李敬華　王素莉　沈繼春

武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科　天津　300162

神經(jīng)導(dǎo)向因子Netrin-1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的影響

李敬華王素莉沈繼春

武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科天津300162

【摘要】目的研究神經(jīng)導(dǎo)向因子Netrin-1與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。方法選取無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar大鼠，從其骨髓腔中分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)后37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至傳代4次。采用Transwell法進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，分為空白組、VEGF組、Netrin-1組及Netrin-1加VEGF組，培養(yǎng)12 h后顯微鏡觀(guān)察并計(jì)算每孔細(xì)胞數(shù)目，培養(yǎng)1周后測(cè)定管腔周長(zhǎng)、管腔數(shù)目及分支點(diǎn)數(shù)目。將轉(zhuǎn)染Netrin-1重組子后的MSCs細(xì)胞懸液、未轉(zhuǎn)染的MSCs細(xì)胞懸液接種于大鼠腹部皮下，以Matrigel膠作為空白對(duì)照組，移植10 d、20 d、30 d后取出膠栓，免疫組化法檢測(cè)VEGF表達(dá)水平。結(jié)果在細(xì)胞遷移及小管形成實(shí)驗(yàn)中，VEGF組與Netrin-1組細(xì)胞遷移數(shù)量、小管形成中的管腔周長(zhǎng)、管腔數(shù)目及分支點(diǎn)數(shù)目無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而VEGF加Netrin-1組與VEGF組或Netrin-1組比較，細(xì)胞遷移數(shù)升高，管腔周長(zhǎng)變長(zhǎng)，管腔數(shù)目和分支點(diǎn)數(shù)目均明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)中，移植轉(zhuǎn)染Netrin-1重組子的MSCs與移植普通MSCs相比，MSCs/Netrin-1組的VEGF蛋白水平更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論Netrin-1和VEGF促進(jìn)血管生成的能力相當(dāng)，兩者結(jié)合更能促進(jìn)血管生成。神經(jīng)導(dǎo)向因子Netrin-1促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】Netrin-1；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；血管生成

Netrin-1是細(xì)胞分泌型可溶性蛋白，具有神經(jīng)細(xì)胞軸突導(dǎo)向和細(xì)胞遷移誘導(dǎo)作用，由于機(jī)體內(nèi)神經(jīng)和血管相互伴行，所以Netrin-1不但可以調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，還參與血管系統(tǒng)的發(fā)育[1]。Netrin-1在脈管系統(tǒng)形成發(fā)育的初期，可以促進(jìn)不同內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、黏附以及細(xì)胞遷移，是一種血管生成調(diào)節(jié)因子[2-3]。血管生成與新生與促血管生成因子密切相關(guān)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)等[4]。VEGF通過(guò)與特異性受體(如VEGF-1、VEGF-2、neuropilin-1、neuropilin-2等)結(jié)合激活一系列細(xì)胞信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂及血管形成[5]。近年研究證實(shí)，Netrin-1與VEGF的功能相關(guān)[6-7]。但Netrin-1與VEGF蛋白表達(dá)之間的關(guān)系仍少有報(bào)道。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染Netrin-1基因重組子入間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)并表達(dá)出Netrin-1蛋白，移植轉(zhuǎn)染Netrin-1基因重組子的MSCs與轉(zhuǎn)染空載體的MSCs到大鼠皮下組織，移植10、20、30 d后檢測(cè)Netrin-1與VEGF蛋白表達(dá)及微血管形成數(shù)量情況，分析Netrin-1與VEGF蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象、主要試劑和儀器4周齡的健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量150～200 g，清潔級(jí)。

主要試劑：Netrin-1蛋白、VEGF蛋白：美國(guó)BM。Trypsin-EDTA、細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板、巴斯德管：美國(guó)Gibco。MesenCult培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、淋巴細(xì)胞分離液：加拿大StemCellTechnllogies。兔抗鼠Netrin-1抗體、羊抗兔二抗、大鼠Netrin-1酶聯(lián)免疫試劑盒：USCN公司。

主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器：手術(shù)器械、細(xì)胞計(jì)數(shù)板：上海醫(yī)療器械公司。流式細(xì)胞儀：德國(guó)BD公司生產(chǎn)。CO2培養(yǎng)箱3336型：美國(guó)SHEL公司。低溫高速離心機(jī)：德國(guó)EPPENDORF。超低溫冰箱：美國(guó)Forma Scientific公司。

1.2研究方法

1.2.1MSCs細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：SPF(Specific Pathogen Free，無(wú)特定病原體)級(jí)Wistar大鼠頸椎脫臼處死后，無(wú)菌條件下分離股骨、腓骨，75%酒精消毒后去除肌肉組織，剪除干骺端，用PBS沖洗骨髓腔，制成細(xì)胞懸液。加Percoll淋巴細(xì)胞分離液離心處理獲得單個(gè)核細(xì)胞。用15%血清加DMEM培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，傳代4次。

1.2.2將Netrin-1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MSCs，并表達(dá)出Netrin-1蛋白：將4 mL MSCs傳代細(xì)胞懸液置于四孔板內(nèi)，計(jì)算4 mL細(xì)胞懸液含有細(xì)胞數(shù)(約16×109個(gè))，按每2×108個(gè)細(xì)胞需要Netrin-1基因重組子12.5 μmol及轉(zhuǎn)染液3 μL的比例加入后混合，于25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.2.3Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn)：將Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板中，小室上層加入MSC培養(yǎng)基，37 ℃下平衡1 h。0.35%胰蛋白酶結(jié)合0.02% EDTA分離MSCs，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至濃度為每mL 1×l05個(gè)。取100 μL(1×l04)加入Transwell小室的上室，下室內(nèi)不加或加入Netrin-1(50 ng/mL)和(或)VEGF(10 ng/mL)的MSC培養(yǎng)液600 μL，分別為空白(陰性)對(duì)照組、Netrin-1組、VEGF(陽(yáng)性)組及Netrin-1加VEGF組，每組6個(gè)復(fù)孔，共4組于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h。后用吸管吸出培養(yǎng)基，PBS溶液洗滌小室3～5次后取出小室濾膜，用3.5%甲醛固定5～10 min，1.5%結(jié)晶紫染色5～10 min后，干燥濾膜。100～200倍光鏡下觀(guān)察濾膜細(xì)胞，每個(gè)小室隨機(jī)選擇4～5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)目，取平均值。細(xì)胞數(shù)目的多少反映其遷移能力的高低。

1.2.4小管形成：未轉(zhuǎn)染的MSCs在MesenCult Medium培養(yǎng)，分為4組即空白對(duì)照組(陰性對(duì)照)，VEGF組(10 ng/mL VEGF，陽(yáng)性對(duì)照)，Netrin-1組(50 ng/mL Netrin-1)，Netrin-1加VEGF組培養(yǎng)。1周后測(cè)定管腔周長(zhǎng)、管腔數(shù)目及分支點(diǎn)數(shù)目。

1.2.5體內(nèi)血管生成：將轉(zhuǎn)染后的MSCs細(xì)胞懸液(2×106個(gè)細(xì)胞)接種于大鼠腹部皮下并用苦味酸標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組：空白對(duì)照組(Matrigel膠)、MSCs組(Matrigel膠+未轉(zhuǎn)染的MSCs)、MSCs/Netrin-1組(Matrigel膠+轉(zhuǎn)染Netrin-1重組子的MSCs)，每組6只大鼠。移植10、20、30 d后，取出膠栓固定染色，檢測(cè)VEGF表達(dá)水平。

1.2.6ELISA法檢測(cè)MSCs細(xì)胞懸液中Netrin-1蛋白：適當(dāng)稀釋Netrin-1蛋白標(biāo)樣后，將酶標(biāo)液加入平板孔中，另設(shè)空白對(duì)照組(不加抗原物質(zhì))，每孔90 μL，4 ℃儲(chǔ)存12 h。每孔分別加100 μL 1.5% PBS/T20-BSA、100 μL抗血清、100 μL兔抗鼠Netrin-1抗體、100 μL HRP的底物緩沖液，每加一種物質(zhì)前先用PBS洗版2次，5 min/次，加入后于37 ℃培養(yǎng)1～2 h。最后用60 μL 20%的H2SO4終止反應(yīng)后，從酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上讀取OD值。

1.2.7免疫組化法檢測(cè)：VEGE蛋白水平：將Matrigel膠板從大鼠體內(nèi)取出后，浸泡于15%福爾馬林液35 ℃固定處理1 h后取出，利用酒精濃度梯度脫水、脫蠟、制片；微波修復(fù)后，加入非免疫性動(dòng)物血清，35 ℃培養(yǎng)15 min；吸管吸棄血清后加入一抗、鏈霉菌抗生素-過(guò)氧化酶溶液，35 ℃培養(yǎng)15 min；采用二氨基聯(lián)苯胺溶液、蘇木素、DAB溶液分別進(jìn)行組織膠板顯色、復(fù)染、再顯色5～10 min，顯微鏡下觀(guān)察，陽(yáng)性顯色為棕黃色；BX51成像系統(tǒng)下成像，VEGF蛋白光密度值(IOD)采用Image Pro-Plus 5.1軟件處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，體外Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、小管形成實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)中，組間或組內(nèi)比較采用方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后MSCs中Netrin-1表達(dá)水平將Netrin-1基因重組到質(zhì)粒上轉(zhuǎn)染到MSCs中，在一定時(shí)間段內(nèi)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，Netrin-1分泌逐漸增多，在第4天時(shí)達(dá)最高，以后Netrin-1分泌量又逐漸降低。見(jiàn)圖1。

2.2細(xì)胞遷移與空白組比較，VEGF組、Netrin-1組以及Netrin-1+VEGF組細(xì)胞遷移數(shù)量均有明顯的增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Netrin-1+VEGF組與VEGF組或Netrin-1組比較，細(xì)胞遷移數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Netrin-1組與VEGF組比較，細(xì)胞遷移數(shù)變化不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1　MSCs中Netrin-1蛋白的分泌

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與VEGF組比較，P<0.01；與Netrin-1組比較，△P<0.01

圖2體外MSCs遷移數(shù)量

2.3體外小管形成與VEGF組比較，Netrin-1組的管腔周長(zhǎng)、管腔數(shù)目以及分支點(diǎn)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Netrin-1+VEGF組的管腔周長(zhǎng)、管腔數(shù)目以及分支點(diǎn)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與Netrin-1組比較，Netrin-1+VEGF組的管腔周長(zhǎng)、管腔數(shù)目以及分支點(diǎn)也明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　MSCs小管形成水平評(píng)價(jià)

注：與VEGF組比較，*P<0.05，**P<0.01；與Netrin-1組比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.4體內(nèi)血管生成與空白組比較，移植后第10天、20天MSCs組和MSCs/Netrin-1組的VEGF蛋白水平較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與MSCs組比較，MSCs/Netrin-1組的VEGF蛋白水平更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2　VEGF蛋白表達(dá)水平

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與MSCs組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3討論

與神經(jīng)元的生長(zhǎng)方式類(lèi)似，生長(zhǎng)中的血管叢最前方的端細(xì)胞通過(guò)伸出的絲狀偽足探測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)中的VEGF，芽生的毛細(xì)血管順VEGF濃度梯度生長(zhǎng)，相鄰內(nèi)皮的端細(xì)胞融合形成管腔，產(chǎn)生新的血管分支[8]。大量研究表明，MSCs能保持干細(xì)胞部分特性，在體外具有分化成為血管壁結(jié)構(gòu)成分的能力，體內(nèi)能促進(jìn)缺血血管新生[9-11]。因此，將MSCs進(jìn)行基因修飾或聯(lián)合細(xì)胞因子移植(如Netrin-1)對(duì)治療缺血性疾病有重要意義。

本文結(jié)果顯示，VEGF組與Netrin-1組的體外細(xì)胞遷移數(shù)量相差不大，而Netrin-1+VEGF組分別與VEGF組與Netrin-1組比較，細(xì)胞遷移數(shù)量明顯上升(P<0.01)。其原因可能是：Netrin-1與VEGF協(xié)同作用，促進(jìn)MSCs的遷移。Netrin-1與位于MSCs細(xì)胞膜上的UNC5C(Netrin-1的受體)結(jié)合，信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖并向損傷處移動(dòng)[12]。另有研究[13]表明，機(jī)體黏膜在缺氧時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)通過(guò)誘導(dǎo)Netrin-1基因表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，及時(shí)修復(fù)機(jī)體受損的皮膚黏膜。體外小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF組與Netrin-1組比較，管腔周長(zhǎng)、管腔數(shù)目以及分支點(diǎn)無(wú)明顯變化(P>0.05)；Netrin-1+VEGF組與VEGF組或Netrin-1組比較，管腔周長(zhǎng)、管腔數(shù)目以及分支點(diǎn)明顯增多(P<0.01)。其原因可能為：Netrin-1與VEGF協(xié)同作用，促進(jìn)小管形成，其機(jī)制與細(xì)胞遷移相似。Netrin-1+VEGF組的MSCs遷移能力以及小管形成能力明顯增加，因此，在動(dòng)物體內(nèi)可以誘導(dǎo)移植的MSCs進(jìn)入缺血區(qū)域，加速局部小管的形成，促進(jìn)缺血區(qū)的血管形成，從而改善缺血癥狀[14]。

體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植轉(zhuǎn)染Netrin-1重組子的MSCs與移植普通MSCs相比，VEGF蛋白表達(dá)水平具有顯著變化。與MSCs組比較，MSCs/Netrin-1組的VEGF蛋白水平更高(P<0.01)。其原因可能為：一方面，Matrigel膠占據(jù)組織細(xì)胞周?chē)难鯕饪臻g，使MSCs處于低氧狀態(tài)，刺激MSCs表達(dá)HIF-1α，HIF-1α刺激周?chē)?xì)胞分泌VEGF，從而導(dǎo)致VEGF水平升高，誘導(dǎo)MSCs分化加速血管形成；另一方面，Netrin-1不但能與MSCs上的受體結(jié)合促進(jìn)血管生成，還能促進(jìn)VEGF表達(dá)水平[15]。

綜上所述，VEGF和Netrin-1對(duì)血管生成均有促進(jìn)作用，且Netrin-1能夠促進(jìn)VEGF的表達(dá)，為利用MSCs進(jìn)行基因修飾或聯(lián)合細(xì)胞因子移植(如Netrin-1)治療缺血性疾病如糖尿病引起的下肢缺血性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(收稿2015-04-02)

Positive impact of Netrin-1 on the expression of VEGF protein

LiJinghua，WangSuli，ShenJichun

DepartmentofEndocrinology，AffiliatedHospitaloftheArmedPoliceLogisticsCollege，Tianjin300162，China

【Abstract】Objective To study the relation between Netrin-1 (nerve guidance factor) and VEGF (vascular endothelial growth factor) protein. Methods SPF (specific pathogen free) Wistar rats were selected as objects， mesenchymal stem cells (MSCs) were acquired from rats' bone marrow cavity and were cultured under the situation of 37 ℃ and 5% CO2 until 4 generations. According to Transwell method， we used cell migration assays to divided rats into 4 groups： control group， VEGF group， Netrin-1 group and VEGF+Netrin-1 group. Then the number of cells per hole were calculated and observed by microscopy after 12h culture. In addition， the perimeter， the number of lumens and the number of branch points were measured after one-week culture. MSCs cells suspension transfected by Netrin-1 recombinant plasmid and non-transfected MSCs cells suspension were inoculated at rats' abdominal subcutaneous tissues. At the same time， we regarded Matrigel glue as blank control group， then pulled the glue emboli out after 10-， 20-， 30-day transplantation to test the expression level of VEGF. Results In cell migration and tube formation assays， cell migration number， the lumen perimeter， cavity number and branch number of the formed tube showed no significant differences between VEGF group and Netrin-1 group (P>0.05)； Additionally， compared with VEGF group or Netrin-1 group， the number of cell migration， cavity and branch points were increased and the lumen perimeter was elongated in VEGF+Netrin-1 group with obviously statistical differences (P<0.01). In vivo angiogenesis assay， compared with non-transfected MSCs suspension group， MSCs/Netrin-1 group transfected by Netrin-1 recombinant had higher expression level of VEGF protein with statistically significant difference (P<0.01). Conclusion Both Netrin-1 and VEGF are capable of promoting angiogenesis， and their combination can have better effect. Netrin-1 promotes the expression of VEGF protein.

【Key words】Netrin-1； Vascular endothelial growth factor； Angiogenesis

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)09-0003-04