馮　俊　李樹生　陳華文（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院，湖北武漢430030）

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基于對miR-133的調控探討丹參酮ⅡA影響鈣調神經(jīng)磷酸酶介導的心肌肥厚的作用機制*

馮俊李樹生陳華文
（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院，湖北武漢430030）

【摘要】目的探討丹參酮ⅡA是否可通過miR-133影響鈣調神經(jīng)磷酸酶途徑來改善胸主動脈縮窄法（TAC）誘導大鼠的心肌肥厚。方法60只SD大鼠隨機分為3組：假手術組、手術組和丹參酮ⅡA治療組。檢測各組超聲和心室體質量比、miR-133、調節(jié)性鈣調神經(jīng)磷酸酶作用蛋白1（MCIP1）、鈣調神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin）的表達及32P的釋放情況（P-release）。結果1）除射血分數(shù)（EF）外，手術組的指標均與其余兩組有差異，丹參酮ⅡA組的心肌肥厚有顯著的改善；2）手術組的MCIP1和miR-133水平均與其余兩組比較均有顯著性差異（P＜0.05），丹參酮ⅡA組MCIP1水平明顯高于假手術組（P＜0.05），miR-133水平低于假手術組（P＜0.05）；3）手術組的Calcineurin的蛋白水平顯著高于其余兩組（P＜0.01），丹參酮ⅡA組與假手術組比較無明顯差異；4）手術組的32P釋放均高于其余兩組（P＜0.01），丹參酮ⅡA組32P釋放高于假手術組（P＜0.05）。結論丹參酮ⅡA可以有效的逆轉手術組誘導的大鼠心肌肥厚，其機制與調控miR-133進而降低Calcineurin相關。

【關鍵詞】心肌肥厚丹參酮ⅡA miR-133鈣調神經(jīng)磷酸酶途徑

心肌肥厚是在長期壓力負荷過重的情況下心肌的代償適應，機體主要通過增加心肌總量來加強心臟的收縮能力，維持正常的血循環(huán)，但隨著肥大的心肌需氧的增加，會導致供血量不足，最終發(fā)展為心肌缺血［1］。丹參酮ⅡA是從丹參中提取的脂溶性的藥效成分。目前的研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA對于左心室肥厚、血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥大、壓力超負荷大鼠心肌肥厚、腹主動脈縮窄高血壓大鼠的心肌肥厚均有較好的逆轉作用，推測其機制為鈣調神經(jīng)磷酸酶信號通路、miR-133的影響［2-7］。相關研究發(fā)現(xiàn)心肌肥厚大鼠的心臟Calcineurin的表達和活性上調，同時miR-133的表達下降，同時采取減弱Calcineurin的表達和活性或者增強miR-133表達的方法可有效干預心肌肥厚［7］。Dong等研究表明，miR-133和Calcineurin在調節(jié)心肌肥厚上有相互抑制的作用［7］。因此，本課題組推測丹參酮ⅡA是通過miR-133來影響鈣調神經(jīng)磷酸酶途徑從而逆轉心肌肥大。

1　材料與方法

1.1實驗動物6.0只雄性SPF級SD大鼠均購買于北京維通利華公司（實驗動物使用許可證號：SCXK京2002-0003），體質量為280～300g。

1.2藥物與試劑丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號Z20026249），Calcineurin和GADPH的一抗和二抗均購買于Santa Cruz公司（Santa Cruz，CA），底物肽由Sigma公司特約合成，RNA assay kits和熒光定量試劑盒購買于Promega公司，其他的試劑均為分析純。

1.3分組與造模大鼠隨機分為：假手術組、手術組和丹參酮ⅡA治療組。假手術組：僅進行開胸處理，不縮窄胸主動脈。手術組：采用腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg）進行麻醉，通過氣管切開術進行機械通氣，在左側第2肋水平處開胸，暴露無名動脈和左側頸總動脈區(qū)域，采用8號針頭與胸主動脈并行，并用4-0手術絲線將兩者結扎，將針頭抽出即可，進行后續(xù)手術。丹參酮ⅡA組：除了進行胸主動脈縮窄術外，并在手術前1周開始每天給予20mg丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液處理（腹腔注射）。假手術組和手術組分別每天給予同等容體積的無菌生理鹽水腹腔注射，每天1次。在造模后共治療8周。

1.4標本采集與檢測1）心臟超聲檢查及心室體質量比測量。在手術8周后進行超聲檢查，主要有大鼠左心室后壁厚度（LVPW）、室間隔厚度（IVs）、射血分數(shù)（EF）和縮短分數(shù)（FS）。待超聲檢查完成后取出心臟，PBS緩沖液沖洗濾紙擦干后，保留大鼠的左心室和室間隔，用電子天平稱質量，并計算左心室體質量比（LVW/BW）。并將左心室保存在-80℃冰箱內，進行下一步實驗。2）Real-time PCR檢測。采用Promega公司的RNA assay kits抽提試劑盒提取大鼠左心室RNA，并采用紫外分光光度計進行RNA的定量，純化后的RNA被分成兩份，分別用于目的基因和管家基因的檢測。每個樣本取1 mg的RNA在M-MLV逆轉錄酶的作用下進行cDNA的合成。采用熒光定量PCR技術進行cDNA的擴增，熒光定量PCR檢測試劑盒包括擴增的所有試劑，如taqman探針和熒光定量PCR試劑。Roche lightcycler熒光儀的程序設置1個循環(huán)（94℃× 3 min），40個循環(huán)（94℃×5 s+60℃×20s）。采用ΔΔCt法來分析實時定量擴增的效果，miR-133和MCIP1的擴增cDNA水平為與GAPDH的標準化處理，結果均以2-ΔΔCT來表示。miR-133的引物為：上游5′-UUGGUCCCCUUCAACCAGCUGU-3′，下游5′-AGCUGGUUGAAGGGGACCAAAU-3′。MCIP1（No：NM_153724）的引物為：上游5′-CAAGCGTGTCCGA ATAAAC-3′，下游5′-TGTAAAGTCTGGGCAAAGT-3′。GAPDH的引物為：上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAT-3′，下游5′-GGATGCAGGGATGATGTTC-3′。3）Western bolt檢測。PBS沖洗大鼠心肌組織，加入細胞裂解液進行組織勻漿處理，離心處理留上清，采用BCA法測量其蛋白濃度。并采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行蛋白的電泳分離，半干轉進行轉膜，采用5%脫脂牛奶將PVDF膜封閉，室溫下?lián)u床處理1 h，并與TBST稀釋（1∶1000）的Calcineurin一抗（兔抗鼠單克隆抗體）孵育4℃過夜，TBST洗膜3次后與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶5000）共同孵育1 h，采用ECL法來顯色處理，膠片曝光后觀察蛋白的條帶。然后將膜上洗脫，重復上述步驟，進行GADPH蛋白的條帶顯影。Calcineurin的蛋白水平以與GADPH的光密度比值來表示。4）放射性同位素法檢測。將20μL的左心室提取液與32P標記的底物肽混合，共同孵育15 min（30℃）后，采用100mmol/L的磷酸鉀緩沖液終止反應。采用Dowex陽離子交換層子柱分離游離的無機磷酸，并通過液體閃爍計數(shù)法計數(shù)。并將結果與不含有calcineurin的對照組的差值作為P的釋放情況。底物肽的序列為：Asp-Leu-Asp-Val-Pro-Ile-Pro-Gly-Arg-Phe-Asp-Arg-Arg-Val-Ser-Val-Ala-Ala-Glu。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，計數(shù)資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布、方差齊者采用t檢驗，不符合正態(tài)分布者，采用秩和檢驗。計量資料用χ2檢驗或非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1心臟超聲檢查及左心室體質量比測量見表1。3組手術8周后的超聲情況表明，除了EF外，手術組的指標均與其余兩組有明顯差異（P＜0.05），丹參酮ⅡA組在BW和LVW/BW上與假手術組有明顯差異（P＜0.05），但其LVW/BW水平仍低于手術組（P＜0.05）。

表1　各組心臟超聲檢查及左心室體質量比比較（±s）

表1　各組心臟超聲檢查及左心室體質量比比較（±s）

與假手術組比較，△P＜0.05；與手術組比較，▲P＜0.05。下同。

組別　LVPW（mm）Ivs（mm）　EF（%）　FS（%）HW（g）BW（g）　LVW/BW（mg/g）假手術組　1.88±0.06手術組　2.69±0.05△1.83±0.1254.72±6.93 93.34±7.122.89±0.15△51.46±6.75 75.23±5.68△1.15±0.031.89±0.05△493.17±14.03　2.21±0.03 425.49±11.72△3.49±0.05△丹參酮IIA組1.94±0.08▲2.03±0.09▲54.48±7.98 88.77±6.59▲1.32±0.04▲454.55±13.91△▲　2.75±0.06△▲

2.2各組MCIP1 mRNA及miR-133表達水平比較見表2。結果顯示，手術組的MCIP1水平明顯高于其余兩組（P＜0.05），丹參酮ⅡA組的MCIP1水平明顯高于假手術組（P＜0.05）。手術組的miR-133均低于其余兩組（P＜0.05），丹參酮ⅡA組的miR-133水平低于假手術組（P＜0.05）。

表2　各組MCIP1、miR-133 Calcineurin及P釋放情況比較（±s）

表2　各組MCIP1、miR-133 Calcineurin及P釋放情況比較（±s）

組　別　MCIP1（2-ΔΔCT）P釋放miR-133（2-ΔΔCT）Calcineurin蛋白水平假手術組　2.31±0.02　0.62±0.05手術組　17.82±0.42△1.63±0.14△0.98±0.05　0.42±0.03 0.67±0.04△0.76±0.06△丹參酮ⅡA組　3.85±0.08△▲0.85±0.08△▲0.87±0.03△▲　0.45±0.04▲

2.3各組Calcineurin蛋白表達水平比較見表2。手術組Calcineurin的蛋白水平明顯高于其余兩組（P＜0.05），丹參酮ⅡA、假手術兩組之間Calcineurin表達無顯著差異。

2.4各組P的釋放情況比較見表2。手術組的P釋放明顯高于其余兩組（P＜0.05），丹參酮ⅡA組P釋放高于假手術組（P＜0.05）。

3　討　論

研究發(fā)現(xiàn)MicroRNAs已成為心肌肥大的重要調節(jié)因子，在大鼠心肌肥大模型和人心肌肥大病例的miR-133的表達下調，體外miR-133的過表達可有效的抑制心肌肥大，抑制其表達可誘導心肌肥大以及延緩病程發(fā)展［7］。綜合以上發(fā)現(xiàn)，有人建議miR-133可作為預測心肌肥大的一個必要條件。

Calcineurin是可由鈣和鈣調蛋白激活的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，可通過使轉錄因子去磷酸化，從而影響其與DNA的結合。Calcineurin可通過使活化T細胞核因子（NFAT）去磷酸化，繼而移位至細胞核并與DNA結合，激活心肌肥大反應基因的表達。Molkentin等研究指出心肌特異性的激活Calcineurin或者其下游的NFAT是誘導心肌肥大的必要條件［8］。Dong等研究表明大鼠Calcineurin的過表達可導致伴隨鉀通道降低的急性心肌梗死［9］。壓力超負荷誘導的大鼠心肌肥厚模型的Calcineurin和磷酸酶的活性升高。以上證據(jù)表明Calcineurin在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)心肌肥厚大鼠的心臟Calcineurin表達和活性上調、miR-133表達下降，采取降低Calcineurin的表達和活性或者增強miR-133表達的方法可有效干預心肌肥厚［7，9-11］。Dong等證實了miR-133和Calcineurin在調節(jié)心肌肥厚上有相互抑制的作用［9］。這與本研究的發(fā)現(xiàn)一致，TAC組的miR-133水平降低，而Calcineurin水平升高，這表明miR-133和Calcineurin有一個相互的抑制作用。為了進一步確認和探討該現(xiàn)象的機制，筆者還研究了Calcineurin的一個調節(jié)因子MCIP1和代表Calcineurin活性的P釋放情況，且手術組的MCIP1表達上調和P釋放增強。本研究表明，模型大鼠經(jīng)丹參酮ⅡA處理后，丹參酮ⅡA組大鼠的miR-133水平高于手術組，這表明miR-133對于心肌肥厚有保護作用，但其水平也同樣高于假手術組，可能的原因是為了對抗造模處理后的心肌負荷加重導致的代償性反應。丹參酮ⅡA組大鼠的Calcineurin的蛋白水平低于手術組，這表明丹參酮ⅡA可有效降低Calcineurin水平，且其水平與假手術組沒有差異。丹參酮ⅡA組的MCIP1水平低于手術組。以上的結果表明，丹參酮ⅡA主要是通過上調miR-133來影響Calcineurin，從而達到逆轉心肌肥厚的作用。同時丹參酮ⅡA組Calcineurin水平下降和P釋放減弱，這表明miR-133影響Calcineurin的機制為降低其含量和活性。

丹參酮ⅡA作為丹參的有效成分，在其預防和治療心血管疾病中發(fā)揮了重要的作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)其主要是通過miR-133影響鈣調神經(jīng)磷酸酶途徑來改善心肌肥大，這同樣也是臨床治療的一個突破口。

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中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）03-0377-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.001

*基金項目：國家自然科學基金資助項目（81202825）

收稿日期（2015-11-03）

Mechanism of Action of Tanshinone IIA on Attenuating the Hypertrophy Induced by Transverse Aortic Constriction（TAC）through Calcineurin Pathway Influenced by MiR-133

FENG Jun，LI Shusheng，CHEN Huawen.
Tongji Hospital affiliated to Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Hubei，Wuhan 430030，China.

【Abstract】Objective：To explore whether TanshinoneⅡA attenuates the hypertrophy induced by transverse aortic constriction（TAC）through calcineurin pathway influenced by miR-133.Methods：60rats were randomly divided into three groups：the sham group，TAC group and TAC+ TⅡA group.The protocols were described as followed：three groups received ultrasound examination and measurement of HW/BW；Real-time PCR was used to examine the level of miR-133 and modulatory calcineurin-interacting protein-1；western blot was employed to examine the level of calcineurin；isotopic tracer method was employed to examine the 32P release.Results：1）Except ejection fraction，all indexes of TAC were significantly different from the two groups（P＜0.05），while the cardiac hypertrophy was attenuated by the treatment with TanshinoneⅡA；2）The levels of MCIP1 and miR-133 in TAC were significant different from the other two groups（P＜0.05），and the levels of MCIP1 in TAC+ TⅡA was higher than the sham group；the levels of miR-133 in TAC+TⅡA was lower than the sham group；3）The protein level of calcineurin in TAC was higher than the other two groups（P＜0.05），and there was no significant difference between TAC+ TⅡA group and the sham group on the subject of calcineurin despite of an elevated trend.4）The p-release of TAC was higher than the other two groups（P＜0.01），and the p-release of TAC+ TⅡA was higher than the sham group（P＜0.05）.Conclusion：TanshinoneⅡA can effectively attenuate cardiac hypertrophy in TAC induced rats，and the effects is achieved by the influence of miR-133 on calcineurin pathways，which is mainly manifested in the deactivation of calcineurin.

【Key words】Cardiac hypertrophy；Tanshinone IIA；MiR-133；Calcineurin pathway