李榮科　李海龍　王志旺　程小麗　李　巖　陳張敏　妥海燕　任　遠(yuǎn)

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅　蘭州　730000)

·基礎(chǔ)研究·

當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘BALB/c小鼠肺水通道蛋白1、5表達(dá)的影響

李榮科李海龍王志旺1程小麗李巖陳張敏妥海燕任遠(yuǎn)1

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000)

〔摘要〕目的探討當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠的平喘作用及對(duì)水通道蛋白(AQP)1、AQP5表達(dá)的影響。方法將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、地塞米松組、3個(gè)當(dāng)歸劑量組、當(dāng)歸與地塞米松組，通過注射卵清白蛋白(OVA)致敏、吸入OVA激發(fā)復(fù)制哮喘模型，實(shí)驗(yàn)后期給予甲狀腺素復(fù)制成陰虛哮喘BALB/c小鼠模型，觀測當(dāng)歸對(duì)哮喘發(fā)作鼠數(shù)、肺液清除功能、肺組織AQP1、AQP5及其基因表達(dá)的影響。結(jié)果2、4、8 g/kg當(dāng)歸可明顯減少哮喘發(fā)作鼠數(shù)，促進(jìn)肺水代謝平衡，促進(jìn)肺組織AQP1、AQP5及其基因的表達(dá)(P<0.05，0.01)。同時(shí)，當(dāng)歸與地塞米松配伍后對(duì)AQP1、AQP5及其基因表達(dá)有一定的協(xié)同作用(P<0.05)。結(jié)論當(dāng)歸治療哮喘的機(jī)制之一是調(diào)節(jié)AQP1、AQP5及其基因表達(dá)而促進(jìn)肺水代謝平衡。

〔關(guān)鍵詞〕當(dāng)歸；陰虛哮喘；水通道蛋白1；水通道蛋白5

當(dāng)歸為大宗中藥材之一，其“主咳逆上氣”、防治呼吸系統(tǒng)疾病的作用〔1〕一直受到中醫(yī)藥學(xué)界的重視。研究顯示，當(dāng)歸及其制劑對(duì)哮喘有明顯的治療作用，當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)豚鼠氣管平滑肌有明顯的解痙作用〔2〕。水通道蛋白(AQPs)在調(diào)節(jié)水代謝平衡及炎性反應(yīng)過程中具有重要作用〔3〕。本次實(shí)驗(yàn)采用卵清白蛋白(OVA)與甲狀腺素復(fù)制陰虛哮喘小鼠模型，擬從肺組織AQP1、AQP5的表達(dá)來探討當(dāng)歸的平喘作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物、試藥及主要儀器雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠，體質(zhì)量16～20 g，由蘭州獸醫(yī)研究所(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院)提供，動(dòng)物許可證62000600000082；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(甘肅中醫(yī)藥大學(xué))飼養(yǎng)，使用號(hào)00000115。甘肅省岷縣的當(dāng)歸，經(jīng)本校楊扶德教授鑒定，購買時(shí)間：2014年10月18日；Grade V Sigma公司的OVA、磷酸組胺(Hist)及氯化乙酰膽堿(Ach)，批號(hào)：SLBF0342V、WXBB2337V、BCSK5705V；山東中泰藥業(yè)有限公司的甲狀腺片，國藥準(zhǔn)字H37021712，批號(hào)14080303；國藥集團(tuán)容生制藥有限公司的地塞米松注射液，國藥準(zhǔn)字H41020036，批號(hào)13011911；北京博奧森生物技術(shù)有限公司的AQP1、AQP5免疫組化試劑盒，批號(hào)：AD091513、AD111342；日本TaKaRa公司的RNAico Plus，批號(hào)：AA1608-1；日本TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒，批號(hào)：AK3501。將當(dāng)歸藥材陰干后，悶潤切片，陰干，冷凍儲(chǔ)存；實(shí)驗(yàn)時(shí)，取當(dāng)歸適量，分別加入10倍、8倍量水，煎煮50、30 min，過濾，合并濾液，適當(dāng)濃縮，1℃～5℃冷藏，1 w內(nèi)使用。USA的鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系統(tǒng)(CH Technologies)，美國伯樂公司的Real-Time熒光定量PCR儀(CFX型)，澳大利亞Dynamica公司的臺(tái)式冷凍離心機(jī)(VELOCITY18R型)，日本Olympus的光學(xué)顯微鏡(CH-212型)，成都泰盟科技有限公司的醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(BI-2000型)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組、造模及給藥將84只BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。實(shí)驗(yàn)第1天開始致敏，即模型對(duì)照組、地塞米松組(地塞米松0.5 mg/kg)、當(dāng)歸高、中、低劑量組(當(dāng)歸8、4、2 g/kg)以及當(dāng)歸中+地米組(當(dāng)歸、地塞米松分別為4 g/kg、0.5 mg/kg)小鼠每只腹腔注射新鮮配制的致敏液〔內(nèi)含OVA 100 μg、氫氧化鋁3 mg的生理鹽水(NS)混懸液〕0.2 ml，同時(shí)背部皮下注射致敏液0.2 ml，正常對(duì)照組以NS代替致敏；第8天依上法再致敏一次。從第15天開始激發(fā)，將小鼠置于吸入染毒系統(tǒng)中，加入激發(fā)液(1% OVA生理鹽水)，調(diào)節(jié)霧化速度至2 ml/min，使小鼠均勻吸入激發(fā)液20 min，隔日1次，連續(xù)28 d，正常對(duì)照組以NS代替激發(fā)。從實(shí)驗(yàn)第15天開始，各組小鼠按上述劑量灌胃給藥20 ml/kg，其中正常對(duì)照組與模型對(duì)照組灌胃NS，1次/d，連續(xù)28 d。從第29天開始，小鼠給受試藥8 h后，按120 mg/kg灌胃甲狀腺素(用0.5%黃原膠助懸)〔4〕，1次/d，連續(xù)14 d，正常對(duì)照組灌胃NS 20 ml/kg。

1.2.2支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)過程中的第41天與第42天進(jìn)行。分別以2%OVA與0.2% Hist和2% Ach混合物為激發(fā)液，將小鼠置于吸入染毒暴露系統(tǒng)內(nèi)，2 ml/min霧化吸入激發(fā)液120 s，從霧化開始觀察10 min內(nèi)哮喘發(fā)作的鼠數(shù)。哮喘發(fā)作的癥狀主要有呼吸急促，呼吸頻率明顯加快、焦躁不安，甚至呼吸過程中急促點(diǎn)頭、腹式呼吸等〔5〕。

1.2.3采集標(biāo)本、測定指標(biāo)實(shí)驗(yàn)第43天，麻醉并處死動(dòng)物后摘取肺臟，于固定位置將肺臟分成3份：第1份肺組織準(zhǔn)確稱取濕重，充分干燥至恒重后稱取干重，計(jì)算濕干重比值(W/D)；第2份肺組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片后免疫組化染色等步驟觀察AQP1、AQP5的表達(dá)并進(jìn)行半定量分析；第3份肺組織經(jīng)NS漂洗后冷凍，采用Real-time qPCR法測定AQP1、AQP5 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.4采用Real-time qPCR法測定肺組織AQP1的基因表達(dá)采用經(jīng)典的Trizol法提取總RNA，應(yīng)用Bio-RAd核酸定量分析儀測定RNA的純度與濃度，使A260 nm/A280 nm在1.8～2.0。按照PrimeScripTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板對(duì)小鼠內(nèi)參照β-actin及AQP1、AQP5基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，β-actin引物序列：上游為GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG，下游為ATGCCACAGGATTCCATACC；AQP1引物序列：上游為ACCTGFTGGCGATTGACTAC，下游為CACCTTCATGCGGTCTGTGA；AQP5引物序列：上游為GCTCCGAGCCATCTTCTACG，下游為GTGTTGTTGCTGAGCGCATT。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)是在美國伯樂公司的CFX型Real-Time熒光定量PCR儀上進(jìn)行，建立10 μl反應(yīng)體系，檢測內(nèi)標(biāo)基因β-actin及AQP1表達(dá)熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定區(qū)域時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)。以內(nèi)標(biāo)基因β-actin的Ct值為對(duì)照計(jì)算△Ct，以模型對(duì)照組為對(duì)照計(jì)算△△Ct，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5軟件行單因素方差分析及χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠支氣管激發(fā)中哮喘發(fā)作動(dòng)物數(shù)的影響模型對(duì)照組吸入激發(fā)液后哮喘鼠數(shù)明顯增加(P<0.05，0.01)；經(jīng)當(dāng)歸治療后，哮喘鼠數(shù)下降，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠肺液清除功能的影響哮喘早期的急性炎癥期，肺組織處于充血水腫狀態(tài)，水液含量高；哮喘中后期逐漸轉(zhuǎn)向以結(jié)締組織增生為主，肺組織間液逐漸減少。模型對(duì)照組小鼠肺組織濕重干重比明顯下降(P<0.01)；經(jīng)當(dāng)歸干預(yù)后，肺組織濕重干重比不同程度上升，其中高、中劑量組與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。此外，當(dāng)歸中+地米組肺濕重干重比較高，與地塞米松組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠肺組織中AQP1、AQP5蛋白表達(dá)水平的影響在高倍鏡下呈藍(lán)色顆粒者為AQP1、AQP5表達(dá)陽性細(xì)胞。小鼠肺組織AQP1主要表達(dá)于氣管腔上皮細(xì)胞、支氣管黏膜下腺上皮細(xì)胞、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及肺組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞；AQP5主要表達(dá)于肺泡Ⅰ型細(xì)胞的頂膜面、支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞的頂膜面、黏膜下腺體、肺泡上皮細(xì)胞等部位。對(duì)肺組織AQP1、AQP5半定量分析顯示，模型對(duì)照組AQP1、AQP5的平均光密度明顯降低(P<0.01)；經(jīng)當(dāng)歸干預(yù)后，AQP1、AQP5的表達(dá)增強(qiáng)，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表2；圖1，圖2。

表1　當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠支氣管激發(fā)中哮喘發(fā)作鼠數(shù)、

與模型對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與地塞米松組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

表2　當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠肺組織中AQP1、AQP5蛋白表達(dá)

2.4當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠肺組織AQP1、AQP5基因表達(dá)的影響每組隨機(jī)取6個(gè)標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，PCR結(jié)果中基因擴(kuò)增曲線和溶解曲線一致性較好，實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的AQP1 mRNA與AQP5 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)；經(jīng)當(dāng)歸干預(yù)后，AQP1 mRNA與AQP5 mRNA表達(dá)水平明顯上升，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí)，與地塞米松組比較，當(dāng)歸油中+地米組AQP1 mRNA與AQP5 mRNA表達(dá)水平上升的更明顯(P<0.05)，顯示出一定的協(xié)同作用。見表3。

A：正常對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：地塞米松組；D：當(dāng)歸高劑量組；E：當(dāng)歸中劑量組；F：當(dāng)歸低劑量組；G：當(dāng)歸中+地米組；下圖同圖1　小鼠肺組織中AQP1表達(dá)水平的免疫組化分析(×40)

圖2　小鼠肺組織中AQP5表達(dá)水平的免疫組化分析(×40)

表3　當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠肺組織AQP1 mRNA、

3討論

支氣管哮喘(簡稱哮喘)嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量〔6〕。盡管已經(jīng)采取包括吸入糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的綜合抗炎治療方案，但由于環(huán)境污染、人均壽命的延長，哮喘的發(fā)病率、死亡率并沒有隨之而降低〔5〕，仍然迫切需要去尋找新的方法來防治哮喘。自《神農(nóng)本草經(jīng)》記載當(dāng)歸“主咳逆上氣”以來，歷代中醫(yī)典籍均有當(dāng)歸防治呼吸系統(tǒng)疾病的理論與臨床應(yīng)用。本次研究采用OVA與甲狀腺素復(fù)制慢性陰虛哮喘動(dòng)物模型〔7〕，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)歸可明顯減少陰虛哮喘模型哮喘發(fā)作動(dòng)物數(shù)，具有明顯的平喘作用。

當(dāng)歸“主咳逆上氣”的中醫(yī)藥理論基礎(chǔ)是當(dāng)歸具有補(bǔ)血養(yǎng)陰、活血行氣、布津潤燥的功效，而機(jī)體陰血津液的主要組成成分是水，所以當(dāng)歸“主咳逆上氣”、防治哮喘的作用基礎(chǔ)是對(duì)肺臟水分的分布及伴隨而來的生理、病理功能的調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)代研究顯示，水通道蛋白對(duì)肺臟水分的分布及其功能的實(shí)現(xiàn)顯得尤為重要〔8〕。呼吸道和肺組織中的AQPs主要有AQP1、AQP5等，肺部AQP1主要分布于支氣管周圍血管床和淋巴管臟層胸膜，為血管與肺間質(zhì)之間的水轉(zhuǎn)運(yùn)快速通道，維持正常肺組織的通氣和換氣功能；AQP5在呼吸道和肺組織中分布最廣，主要參與構(gòu)成血?dú)馄琳蠚怏w側(cè)的水分子通路，維持氣管與肺泡腔內(nèi)的水代謝平衡，調(diào)節(jié)氣道液體的黏稠度〔9〕。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)歸可促進(jìn)肺組織AQP1、AQP5及其基因的表達(dá)，提高陰虛型慢性哮喘的肺組織濕干重比值，促進(jìn)肺水代謝平衡而實(shí)現(xiàn)肺組織水分的生理功能。

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〔2015-12-03修回〕

(編輯袁左鳴)

Effects of RASI on the expressions of aquaporin-1 and aquaporin-5 in lung of asthmatic mice with Yin deficiency syndrome

LI Rong-Ke,LI Hai-Long,WANG Zhi-Wang,et al.

Gansu University of TCM,Lanzhou 730000,Gansu,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of Radix Angelicae Sinensis(RASI)on anti-asthma and the expressions of aquaporin-1(AQP1)and aquaporin-5(AQP5)in lung tissue of asthmatic mice with Yin deficiency syndrome.MethodsThe BALB/c mice were randomly divided into control,model,Dexamethasone,three doses of RASI,middle dose of RASI and Dexamethasone groups.Asthmatic model mouse was made by injecting ovalbumin(OVA)to sensitize,then inhaling OVA to stimulate,and thyroxin was used to make asthmatic mouse with Yin deficiency syndrome during late stimulation.The number of animals with asthma attacks,pulmonary fluid clearance,and expressions of AQP1 and AQP5 and their genes in lung tissue were observed.Results2,4 and 8 g/kg RASI could reduce the number of animals with asthma attacks,increase the ratio of W/D,and promote the expressions of AQP1 and AQP5 and their genes in lung tissue(P<0.05,P<0.01).In addition,these was a certain synergy between RASI and dexamethasone on improving the expressions of AQP1 and AQP5 and their genes(P<0.05).ConclusionsOne of mechanisms of RASI's anti-asthmatic effect is to regulate the AQP1,AQP5 proteins and their genes expression to promote water metabolism balance in lung.

【Key words】Radix Angelicae Sinensis(RASI);Asthma with Yin deficiency syndrome;Aquaporin-1;Aquaporin-5

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81460668);甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.1310RJZA086)

通訊作者：王志旺(1970-)，男，副教授，碩士，主要從事(中藥)藥理與毒理學(xué)教學(xué)與研究。

〔中圖分類號(hào)〕R285.5；R562.25

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)10-2309-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.001

1甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

第一作者：李榮科(1972-)，男，副教授，碩士，主要從事中醫(yī)診治研究。