龐漢青+王軍+唐于平+吳亮+許會芹+金益+朱振華+黃勝良+孫大正+段金廒

[摘要]比較評價新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠血液流變學和凝血功能的影響，探討當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻。采用冰水浴和皮下注射鹽酸腎上腺素共同復制急性血瘀大鼠模型。根據(jù)全血黏度（WBV）、血漿黏度（PV）、血沉（ESR）和紅細胞壓積（HCT）等指標，觀察新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠血液流變學的影響；以血小板最大聚集率（ADP）、凝血酶時間（TT）、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、血漿纖維蛋白原含量（FIB）觀察新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對血瘀大鼠的血小板聚集和凝血功能的影響。采用多指標綜合指數(shù)法和主成分分析法綜合評價當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻。研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組的各血液流變學和凝血功能指標均有統(tǒng)計學差異（P<0.01）；與模型組比較，新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠的血液流變學和凝血功能的多個指標皆有一定的改善作用。多指標綜合指數(shù)法和主成分分析法綜合評價得出，新生化顆粒對血瘀大鼠的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于拆方組和生化湯組；新生化顆粒缺失當歸系列藥對后，各給藥組的活血效應均有一定程度的降低；缺失不同的當歸藥對后對原方的活血效應影響不同，當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻的順序為：當歸-益母草>當歸-川芎>當歸-紅花>當歸-炙甘草>當歸-桃仁>當歸-姜炭。該研究表明，當歸系列藥對是新生化顆粒的重要組成部分，不同的當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻不同；且當歸-益母草藥對在全方中的活血作用貢獻最大，與新生化顆粒的組方結(jié)構(gòu)（重用益母草）以及益母草“活血行滯、祛瘀生新”的功效相一致，該方法為新生化顆粒的臨床合理應用提供了科學依據(jù)，并為復雜方劑的配伍作用研究提供了一定的方法參考。

[關(guān)鍵詞]新生化顆粒； 當歸； 藥對； 活血化瘀； 多指標綜合指數(shù)法； 主成分分析； 撤藥分析法

[Abstract]Xin-Sheng-Hua granule （XSHG） is a popular remedy commonly used in clinic for the treatment of lochiostasis after delivery. To comparatively investigate the roles of herb pairs containing Angelicae Sinensis Radix （Danggui） upon the formula by evaluating the blood coagulation and hemorheology function in acute blood stasis rats， acute blood stasis rat model was established by ice water bath and subcutaneous injection of adrenaline. And the blood stasis mice were administrated intragastrically with different samples of the formula minus herb pairs containing Danggui and the whole formula （XSHG， SHD， DY， DC， DT， DH， DJ and DZ）. The whole blood viscosity （WBV）， plasma viscosity （PV）， erythrocyte sedimentation rate （ESR） and haematocrit （HCT） were applied to evaluate the effects of the formula minus herb pairs containing Danggui on hemorheology of blood stasis rats. The thrombin time （TT）， activated partial thromboplastin time （APTT）， prothrombin time （PT）， and plasma fibrinogen （FIB） were used to observe the effects of the formula minus herb pairs containing Danggui on blood coagulation function of blood stasis rats. Additionally， the maximum aggregation induced by adenosine diphosphate （ADP） was tested to observe the effect of different samples on platelet aggregation index of blood stasis rats.Afterwards， multi-attribute comprehensive index methods and principal component analysis were both applied to comprehensively assess the total effects of the formula minus herb pairs containing Danggui on promoting blood circulation and dissipating blood stasis. Compared with normal group， the hemorheological parameters and coagulation indexes of model group had statistical differences （P<0.01）. Compared with model group， different samples （XSHG， SHD， DY， DC， DT， DH， DJ and DZ） could improve the blood hemorheology indexes， coagulation parameters and platelet aggregation in acute blood stasis rats. According to multi-attribute comprehensive index methods and the principal component analysis， the effects of promoting blood circulation by removing blood stasis became poor when excluding herb pairs containing Danggui from the formula， the sample DY and DC had the weakest effect of activating blood circulation and dissipating blood stasis， and the effect of sample DY was slightly poorer than DC. The orders of contribution of herb pairs containing Danggui on the formula were Danggui-Yimucao>Danggui-Chuanxiong>Danggui-Honghua>Danggui-Zhigancao>Danggui-Taoren>Danggui-Jiangtan. In conclusion， various herb pairs containing Danggui played different roles on the effects of improving the abnormality of hemorheology and coagulation function. And the herb pairs Danggui-Yimucao were particularly important for the formula， which was consistent with the characteristics of XSHG and the traditional effect of Yimucao. Moreover， it could lay foundation to further reveal the compatibility mechanism of XSHG.

[Key words]Xin-Sheng-Hua granule； Angelicae Sinensis Radix； herb pair； promoting blood circulation； multi-attribute comprehensive index method； principal component analysis； withdrawal analysis

doi：10.4268/cjcmm20162120

新生化顆粒來源于清代傅青山的婦科名著《傅青主女科》的“生化湯”，由當歸、益母草、川芎、桃仁、紅花、干姜（碳）、甘草（炙）7味中藥組成，歷來被稱為“產(chǎn)后第一方”^[1-2]。當歸補血活血、調(diào)經(jīng)止痛，為方中君藥；川芎活血行氣、祛風止痛，桃仁活血化瘀，共為臣藥；炮姜走血分、溫中散寒，為佐藥；炙甘草調(diào)和諸藥，為使藥。新生化顆粒在此基礎(chǔ)上，加入益母草和紅花后，大大加強了原“生化湯”活血祛瘀的作用，共奏溫經(jīng)活血，化瘀生新，調(diào)經(jīng)止痛功效^[3]。臨床上，當歸常與其他許多藥味配伍使用，體現(xiàn)出良好的協(xié)調(diào)或制約作用，從而產(chǎn)生了一系列與當歸相關(guān)的藥對^[4]。在新生化顆粒中，君藥當歸分別與其他6味藥都能形成藥對，可能對新生化顆粒的療效發(fā)揮了重要的作用。課題組前期對當歸-川芎、當歸-紅花藥對的配伍均有研究，發(fā)現(xiàn)其在活血、養(yǎng)血等方面皆具有協(xié)同增效的作用^[5-6]。然而，不同當歸系列藥對在新生化顆粒中具體的作用貢獻大小仍不得而知，從而制約了該方的進一步發(fā)展。近年來，整方研究和拆方研究策略已經(jīng)被廣泛用于中藥復方配伍研究中^[7-8]。其中，“撤藥分析法”通過缺失復方中的1味藥或1組藥后，進而比較評價撤出的藥味對原方功效的貢獻度，對揭示中藥復方的配伍規(guī)律發(fā)揮了重要的作用。

本文采用“撤藥分析法”分析當歸系列藥對在新生化顆粒中的功能和作用機制，以新生化顆粒（XSHG）、新生化顆粒缺失各當歸系列藥對的樣品：DY樣品（新生化顆粒缺失當歸-益母草）、DC樣品（缺失當歸-川芎）、DT樣品（缺失當歸-桃仁）、DH樣品（缺失當歸-紅花）、DJ樣品（缺失當歸-姜炭）、DZ樣品（缺失當歸-炙甘草）和生化湯（SHD）為研究對象，觀察不同給藥組對急性血瘀大鼠活血效應的影響，活血效應包括血液流變學、凝血功能及血小板聚集等指標。并通過多指標綜合指數(shù)法進行效應整合與比較分析，結(jié)合主成分分析法，以期在整體動物水平探討當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻大小，從藥對層面揭示新生化顆粒配伍作用規(guī)律，從而促進該方在中醫(yī)臨床更有效地應用，并為中藥配伍藥物相互作用現(xiàn)代基礎(chǔ)研究提供思路與方法的參考。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠，110只，雌性，SPF級，體重230～250 g，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，合格證號SCKY（滬）2013-0004。大鼠購入后檢疫與馴化1周，使其適應環(huán)境并剔除體質(zhì)差異較大的動物，實驗期間動物自由進食、飲水，晝夜節(jié)律正常。

1.2 試劑 鹽酸腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號150609）；復方丹參滴丸（天士力制藥集團股份有限公司，批號151227）；氯化鈉（國藥集團試劑有限公司，批號150928）；水合氯醛（國藥集團試劑有限公司，批號20160109）；檸檬酸鈉（國藥集團試劑有限公司，批號20151105）。

1.3 儀器 LG-PABER-1型血小板聚集凝血因子分析儀（北京世帝科學儀器公司）；LG-R-80-B電腦血液黏度測試儀（北京世帝科學儀器公司）；YRE-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有效責任公司）；超純水儀（南京易普易達科技發(fā)展有限公司）；電子分析天平（BT125D，sartorius，德國）；Anke LXJ-ⅡB離心機。

1.4 樣品制備 當歸（產(chǎn)地甘肅岷縣，批號151021）、益母草（產(chǎn)地廣東汕頭，批號150916）、川芎（產(chǎn)地四川彭州，批號151018）、桃仁（產(chǎn)地安徽亳州，批號150906）、紅花（產(chǎn)地新疆，批號140816）、姜炭（產(chǎn)地山東安丘，批號160108）、炙甘草（產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號151108）等藥材均由江蘇省仁壽藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學嚴輝老師鑒定，符合《中國藥典》（2015年版）項下標準。

新生化顆粒提取物的制備：稱取當歸、益母草、川芎、桃仁、紅花、炙甘草和姜炭的混合藥材共699 g，7味藥材的比例依次為80∶100∶30∶8∶5∶5∶5。用8倍量水熱回流提取3次，第1次2 h，后2次各1.5 h（模擬臨床上新生化顆粒的制備）。自然冷卻后，傾出藥液，過濾藥渣，合并3次水提液，得到新生化顆粒的水提物。將新生化顆粒水提液于60 ℃下減壓濃縮，得到新生化顆粒提取物（XSHG）樣品。

新生化顆粒缺失各當歸系列藥對的樣品制備：從全方中分別減掉當歸-益母草、當歸-川芎、當歸-桃仁、當歸-紅花、當歸-姜炭、當歸-炙甘草，其他5味藥的比例皆與原方相同。用8倍量水提取3次，分別用時2，1.5，1.5 h，合并3次水提液，分別得缺失各當歸系列藥對的新生化顆粒樣品的提取物。將各樣品的水提液分別于60 ℃下減壓濃縮，分別得到DY（缺失當歸-益母草）、DC（缺失當歸-川芎）、DT（缺失當歸-桃仁）、DH（缺失當歸-紅花）、DJ（缺失當歸-姜炭）和DZ（缺失當歸-炙甘草）提取物。

生化湯提取物品的制備：按照當歸-川芎-桃仁-姜炭-炙甘草24∶9∶6∶2∶2配比，稱取生化湯組方藥材共430 g。用8倍量水提取3次，用時依次為2，1.5，1.5 h，合并3次水提液，將生化湯樣品的水提液于60 ℃下減壓濃縮，則得到生化湯（SHD）提取物。以上所有樣品均4 ℃冷藏備用。

2 方法

2.1 大鼠血瘀模型的復制 除空白組外，模型組和各給藥組的大鼠分別于大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素注射液，劑量均為0.8 mg·kg^-1，共2次，2次間隔時間4 h。大鼠第1次皮下注射鹽酸腎上腺素2 h后，將其置于0～2 ℃的冰水中游泳4 min，復制大鼠急性血瘀模型。最后1次皮下注射鹽酸腎上腺素后，所有組的大鼠均禁食不禁水，12 h后頸總動脈采血測血液流變學和凝血功能的相關(guān)指標^[9-11]。

2.2 分組與給藥 大鼠飼養(yǎng)10 d后，將110只大鼠隨機分為11組，每組10只，分別為正常組（K）、模型組（M）、復方丹參滴丸陽性藥組（DSDW）、生化湯組（XSD）、新生化顆粒組（XSHG）和新生化顆粒缺失各當歸系列藥對的樣品組（DY，DC，DT，DH，DZ，DJ）。陽性藥組灌胃給予復方丹參滴丸，灌胃劑量為0.10 g·kg^-1；正常組與模型組大鼠給予等容積生理鹽水；XSHG給藥組（通常，新生化顆粒的臨床用量為36 g，本實驗依此為基準，設(shè)定新生化顆粒的臨床1倍量，總量為36 g），XSHG組按新生化顆粒的臨床1倍量，繼而通過人與大鼠體表面換算公式計算大鼠的灌胃劑量，即以4.86 g·kg^-1的劑量灌胃給藥?？紤]到其他因素的影響，其他各給藥組（SHD，DY，DC，DT，DH，DZ，DJ）的給藥劑量均與XSHG給藥組相同，以評價當歸系列藥對在新生化顆粒中的作用貢獻。所有大鼠均統(tǒng)一灌胃0.01 mL·g^-1，每日早晚各1次，共7次。于第5次給藥后除正常組外，其余各組大鼠均按照相應的造模方法復制急性血瘀模型。各組大鼠第7次給藥30 min后頸總動脈取血，及時測定血液流變學和凝血功能相關(guān)指標。給藥劑量按照動物體表面換算系數(shù)計算：人臨床用量×0.018/200×1 000×臨床等效量的倍數(shù)。

2.3 血液流變學和凝血功能指標檢測 各組大鼠均于末次給藥30 min后，在10%水合氯醛麻醉下，頸總動脈插管取血，以枸櫞酸鈉（3.8%）1∶9抗凝。吸取1 mL全血置于壓積管中，靜置1 h記錄血沉（ESR）。然后3 000 r·min^-1離心30 min，記錄紅細胞壓積（HCT）。取全血800 μL采用LG-R-80 B電腦血液黏度測定儀測定各切變率下的全血黏度（WBV）。余下的全血，先800 r·min^-1離心10 min吸取富血小板血漿（PRP），然后3 000 r·min^-1離心10 min吸取貧血小板血漿（PPP）。血小板聚集率[ADP（%）]的測定采用PRP，凝血4項[APTT（s），PT（s），TT（s），F(xiàn)IB（g·L^-1）]的指標采用PPP，儀器均為LG-PABER-1型血小板聚集凝血因子分析儀。血漿PT，TT，APTT，F(xiàn)IB的測定按照試劑盒說明書進行。

2.4 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0軟件中的Descriptives進行統(tǒng)計，實驗結(jié)果采用±s表示；與空白組和模型組的比較，采用ANOVA中的Dunnett法進行組間兩兩比較，P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2.5 效應整合 采用多指標綜合指數(shù)法，對PV，WBV，HCT，ESR，APTT，TT，PT，F(xiàn)IB，ADP多個指標進行單一化處理，計算各給藥組總的活血效應值。首先，對各個指標數(shù)據(jù)進行標化^[12]。相比于模型組，若正常組的各指標值（Value）升高，則V標化=（V給藥-V模型）/V模型；若正常組的指標值降低，則V標化=（V模型-V給藥） /V模型。標化指標權(quán)重的確定首先根據(jù)各指標在臨床中的重要性，賦予各指標以相應的權(quán)重。查閱近10年關(guān)于急性血瘀的文獻150余篇，其中144篇檢測了WBV，137篇檢測了PV，131篇檢測了HCT，98篇檢測了FIB，72篇檢測了ESR，59篇檢測了PT，56篇檢測了TT，89篇檢測了HCT，43篇檢測了ADP，31篇檢測了APTT。其次結(jié)合同行專家對所測指標在活血化瘀效應中的重要程度打分，最后再結(jié)合變量重要性投影值（variable importance in the projection， VIP）處理實驗結(jié)果，綜合給出各指標的權(quán)重系數(shù)，總活血效應值等于各個指標的標化值乘以相應權(quán)重的加和值。各指標VIP的計算如下：首先將每組大鼠的所有指標導入MassLynx v4.1（Waters公司）軟件的EZ info中，采用主成分分析法（principal components analysis， PCA）中的Pareto處理得到各組活血療效的得分圖；然后采用偏最小二乘法（partial least squares method， PLS）分析得到各指標的VIP。根據(jù)VIP的大小判斷各個指標的相對重要程度，若VIP>1，則一般認為該指標的貢獻比較大^[12-13]。最終各指標取權(quán)重系數(shù)如下：APTT，TT，ADP，PT，ESR的權(quán)重系數(shù)為1；FIB的權(quán)重系數(shù)為2；PV，WBV，HCT的權(quán)重系數(shù)為3。采用多指標綜合指數(shù)法中的總活血化瘀效應值與主成分分析法的得分圖綜合評價當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血效應貢獻。

3 結(jié)果

3.1 新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響 不同給藥組的全血黏度實驗結(jié)果見表1，圖1，新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對血漿黏度的影響見圖2。與正常組相比，模型組的WBV和PV均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。相比于模型組，各給藥組的PV和WBV均有不同程度的降低；其中，陽性藥組（DSDW）于不同切變率下的WBV和PV較模型組均顯著降低（P<0.01）。WBV中，DY組和DC組在不同切變率下的全血黏度均無顯著性差異；DH組在切變率為30和1 s^-1時的黏度有顯著性差異（P<0.05）；其他各給藥組在不同切變率下的全血黏度均顯著降低（P<0.05）。PV中，除了DY給藥組外，其他各給藥組的差異較模型組均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與XSHG組比較，DSDW組在不同切變率下的WBV和PV均無顯著性差異，表明新生化顆粒與復方丹參滴丸在改善血液流變學方面具有相似的療效；DY組和DC組在各切變率下的全血黏度均有顯著性差異（P<0.05）；DH組除了切變率30 s^-1下沒有統(tǒng)計學差異外，其余切變率下的全血黏度顯著升高（P<0.05）；SHD組和DZ組在切變率1 s^-1的WBV均較XSHG組明顯升高（P<0.05）；DY組和DH組PV均顯著升高（P<0.01）。

3.2 新生化顆粒樣品缺失當歸系列藥對前后對急

性血瘀大鼠ESR和HCT的影響 各給藥組的ESR和HCT結(jié)果見圖3。與正常組比較，模型組的ESR，HCT均有明顯升高，兩者差異皆具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組相比，DSDW組的ESR和HCT顯著性降低（P<0.01）；各給藥組的ESR和HCT均有不同程度的降低；各給藥組的ESR均明顯降低（P<0.01）；除了DC和DT組外，其他各給藥組的HCT顯著降低（P<0.05）。與XSHG組比較，DSDW組的ESR和HCT有所升高，但兩者無統(tǒng)計學差異；DY，DH和DZ組的ESR明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；DY，DC和DH組的HCT均顯著升高（P<0.05）。

3.3 新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠凝血功能和血小板聚集的影響 各給藥組對急性血瘀大鼠的凝血功能和血小板聚集功能影響的實驗結(jié)果見圖4。與正常組相比，模型組的凝血功能指標（TT，APTT，PT，F(xiàn)IB）和ADP均有顯著性差異（P<0.01），其中TT，APTT，PT，ADP均明顯降低，F(xiàn)IB和ADP含量顯著升高。與模型組相比，DSDW組和XSHG組對急性血瘀大鼠的凝血4項和ADP有明顯的改善作用，差異皆有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；SHD組的TT，PT和ADP均有明顯的改善作用（P<0.05）；DY組TT顯著延長（P<0.01）；DC組的相關(guān)指標均無明顯改善作用；DT組和DH組的APTT均明顯增加，ADP均顯著降低，差異皆有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；DJ組和DZ組的TT，PT和APTT均顯著延長，ADP含量均顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。此外，新生化顆粒缺失當歸系列藥對后的各給藥組對急性血瘀大鼠的FIB指標均無明顯的改善作用。與XSHG組比較，TT中，除了DY組外，其他各給藥組均顯著縮短（P<0.05）；PT中，SHD，DY和DC組明顯縮短（P<0.05）；APTT中，DY，DC和DH組均顯著縮短（P<0.05）；FIB中，除DT組外，其他各給藥組均明顯升高（P<0.01）；ADP中，DY，DC和DH組均顯著升高（P<0.05）。此外，DSDW組的TT，APTT和FIB較XSHG組均有所降低，PT和ADP有所升高，但皆無顯著性差異。

3.4 基于主成分分析法的當歸系列藥對的活血化瘀效應評價 將所有血瘀相關(guān)指標的原始數(shù)據(jù)導入MassLynx v4.1軟件（Waters公司）的EZ info中，通過降維矩陣建立包含2個主成分軸t[1]和t[2]的平面空間的PCA分類模型，見圖5。主成分軸t[1]是源數(shù)據(jù)矩陣方差最大方向，主成分軸t[2]是方差的次大方向，降維過程中，最大限度保留有用信息，尋找能夠使不同組別指標得到最大分離的方向。從圖5中可以看出，正常組的中心大約是（6，-0.5），模型組的中心大約是（-5.5，1），復方丹參滴丸組的中心大約是（2，-0.5），新生化顆粒組的中心大約是（2.5，0.5），生化湯組的中心約在（1，-0.25），新生化顆粒缺失當歸系列藥對的DY，DC，DT，DH，DJ，DZ樣品組的中心依次大約是（-3.5，1），（-4.5，-1），（1，-1.5），（-1.5，-1），（0.5，0），（0，1）。模型組的中心離正常組的中心最遠，說明血瘀模型造模成功；DSDW組離空白組較近，表明DSDW對急性血瘀大鼠的改善作用較好；較其他拆方組，新生化顆粒組距離空白組最近且離陽性藥DSDW組較近，說明新生化顆粒組的活血化瘀效應最好，在活血化瘀方面具有與復方丹參滴丸相似的治療效果；DJ組、DT組和生化湯組位于正常組和模型組中間位置，表明它們對急性血瘀大鼠的改善作用弱于新生化顆粒組；DY，DC和DH組距離模型組較近，表明DY，DC和DH組的改善作用較差；其中DY組距離模型組最近，說明DY組對急性血瘀大鼠的改善作用最差。

3.5 基于多指標綜合指數(shù)法的當歸系列藥對的活血化瘀效應整合 將各組大鼠的所有指標導入Mass Lynx v4.1（Waters公司）軟件的EZ info中，采用偏最小二乘法（PLS-DA）分析每個指標的VIP，VIP越大，說明該指標對分類的貢獻越大。WBV200，WBV30，WBV5，HCT，F(xiàn)IB，TT，APTT，ADP和ESR的VIP均較大，PT和WBV1的數(shù)值較小，見圖6。依據(jù)本課題組前期的多指標綜合指數(shù)法對WBV200，WBV30，WBV5，WBV1，PV，HCT，F(xiàn)IB，TT，PT，APTT，ADP和ESR各指標進行歸一化處理，得到各組的總活血化瘀效應值，見表2，結(jié)果表明新生化顆粒較生化湯的活血效應好，缺失當歸系列藥對后，各樣品總的活血效應值均有一定程度的減少。新生化顆粒缺失各當歸系列的總活血效應值的大小順序依次為：DJ>DT>DZ>DH>DC>DY，這說明DJ和DT給藥組的總活血效應最好。這些研究結(jié)果表明，生化湯中增加益母草和紅花2味藥后（新生化顆粒），大大加強生化湯的活血化瘀療效；而新生化顆粒中缺失當歸系列藥對后，原方的活血化瘀療效均有不同程度的降低，尤其是缺失當歸-益母草藥對后，活血化瘀效應大大減弱，側(cè)面說明當歸-益母草藥對在新生化顆粒中的活血化瘀的作用貢獻最大。

3.6 結(jié)合主成分分析法和多指標綜合指數(shù)法綜合評價當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻 綜合多指標綜合指數(shù)法和主成分分析法中的總活血化瘀效應結(jié)果可得，樣品DY和DC的總活血效應最差，樣品DJ和DT的總活血效應最好，2種分析方法所得結(jié)果相一致。當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻的順序為：當歸-益母草>當歸-川芎>當歸-紅花>當歸-炙甘草>當歸-桃仁>當歸-姜炭。其中，藥對當歸-益母草在全方中的活血作用貢獻度最大，與新生化顆粒的組方結(jié)構(gòu)（重用益母草）以及益母草“活血行滯、祛瘀生新”的功效相一致。

4 討論

中藥復方配伍規(guī)律的研究有助于揭示復方配伍的科學內(nèi)涵及相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)，并為藥物的臨床合理應用指明方向。目前，中藥復方的研究方法主要有2種，整方研究和拆方研究。整方研究即將復方視為整體后進行化學分析和藥理學研究，盡管能夠反映其藥效和臨床應用的相關(guān)程度，然而由于復方組成的復雜性，該方法難以解釋其真正的藥效物質(zhì)。而拆方研究對于闡明經(jīng)方配伍的科學性、確定方中的主要藥效物質(zhì)和新藥的研制都有一定的指導作用^[8]。本研究中，同時結(jié)合整方研究和拆方研究，以新生化顆粒為研究對象，通過比較新生化顆粒缺失各當歸系列藥對前后的活血化瘀功效，以揭示藥對在新生化顆粒中的配伍作用，進而闡明新生化顆粒組方的科學內(nèi)涵。

為了綜合反映新生化顆粒及其拆方的活血化瘀藥效，本實驗選擇了血液流變學（WBV，PV，HCT，ESR）、凝血功能（TT，PT，APTT，F(xiàn)IB）與血小板聚集功能（ADP）等多個效應指標來分別評價其藥效。然而針對同一指標，不同的藥物對其反應靈敏度往往不同，導致很難直觀評價不同樣品的活血效應。因此，需要采用“標化”的方法統(tǒng)一所有效應指標的計量單位，形成整合效應以綜合評價不同樣品的活血效應。多指標綜合指數(shù)法可以將量綱不同的效應指標轉(zhuǎn)化成無量綱的相對評價值，是一種能反映事物相對水平和整體變動的一種綜合評價方法^[10]。多指標綜合指數(shù)法的核心在于賦予指標一定的權(quán)重。與傳統(tǒng)的權(quán)重系數(shù)確定的方法相比，本實驗不僅僅采用了通常采用的專家評分法，進而考慮了不同指標在臨床中出現(xiàn)的頻次，同時結(jié)合了PLS-DA中的VIP對血液流變學和凝血功能指標的評分，最后綜合確定其權(quán)重系數(shù)，使權(quán)重系數(shù)的確定更加趨于合理^[14-16]。為了驗證多指標綜合指數(shù)法的合理性，筆者又采用了PCA的方法分析了各組所有血瘀相關(guān)的源數(shù)據(jù)，PCA通過將復雜因素歸結(jié)為幾個主成分，使得問題簡單化，同時可以得到更加科學有效的結(jié)果，有助于客觀地反映各樣本間的現(xiàn)實關(guān)系^[17]。

通過多指標綜合指數(shù)法結(jié)合PCA對急性血瘀大鼠的血液流變學和凝血功能指標進行了效應整合。結(jié)果顯示，新生化顆粒和生化湯樣品均能一定程度改善急性血瘀大鼠的血液流變學及凝血功能相關(guān)指標，新生化顆粒的活血效應明顯優(yōu)于生化湯，說明生化湯中加入益母草和紅花2味藥組成新生化顆粒后，明顯增加了原生化湯的活血效應。在新生化顆粒中，缺失不同的當歸系列藥對后對原方的活血效應有不同程度的影響，缺失藥對當歸-益母草和當歸-川芎后，原方的活血效應大大減弱。益母草有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫的作用，川芎有活血行氣的作用，兩者與當歸配伍組成相應藥對后，在活血方面會產(chǎn)生協(xié)同增效的作用，這與本實驗得到的結(jié)果具有一致性。后期將進一步比較新生化顆粒與當歸-益母草藥對的化學化瘀藥效作用，并基于分子生物學和代謝組學等方法，以期揭示當歸-益母草藥對在新生化顆粒中活血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。這些研究結(jié)果有利于從藥對角度揭示新生化顆粒的配伍效應，為新生化顆粒在臨床中更好的應用提供了科學依據(jù)，也為復雜方劑的配伍作用研究提供了一定的方法參考。

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[責任編輯 陳玲]