毛曉麗+覃禹+陳相宜+鄺曉聰+黃庶識+劉華鋼

[摘要]運(yùn)用拉曼光譜法對兩面針活性成分誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析，肝癌細(xì)胞7404分別經(jīng)10 mg·L^-1氯化兩面針堿及3 g·L^-1兩面針提取液處理后，收集經(jīng)藥液處理12，24，36，48 h的各組細(xì)胞的拉曼光譜后，通過Hochest33342/PI熒光染色法鑒定細(xì)胞并保留熒光染色陽性（發(fā)生凋亡活細(xì)胞）的光譜，并在OriginPro8.0系統(tǒng)中比較各組平均光譜的差異。收集肝癌細(xì)胞的拉曼光譜依次進(jìn)行背景扣除、平滑、歸一化等方法處理。Hochest熒光染色后空白組細(xì)胞核染色均勻，而藥物處理48 h后，核碎裂，拉曼光譜結(jié)果顯示兩面針提取液處理肝癌細(xì)胞12，24，36，48 h后，與核酸及蛋白質(zhì)相關(guān)的峰均有降低，其中785，1 002，1 175，1 660 cm^-1峰強(qiáng)度隨兩面針?biāo)幬镒饔脮r(shí)間的延長而降低，表明兩面針活性成分能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，凋亡的肝癌細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的含量均低于活細(xì)胞。兩面針活性成分作用時(shí)間與藥效呈一定的相關(guān)性。拉曼光譜能夠反映中藥兩面針活性成分作用后的肝癌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)變化的信息，對實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞凋亡過程及藥物的臨床應(yīng)用具有重要意義。

[關(guān)鍵詞]拉曼光譜； 肝癌細(xì)胞； 兩面針

[Abstract]The apoptosis of mono-hepatocellular induced by the active ingredients of the Zanthoxyli Radix was investigated using laser Raman spectroscopy. Hepatoma cells （BEL-7404） were treated with 10 mg·L^-1 nitidine chloride and 3 g·L^-1 the extracts of Zanthoxyli Radix， respectively， then were divided into two parts， one for fluorescence staining， the other for determination of Raman spectroscopy. The acquired spectra were then processed by background elimination， smoothing， and normalization. Fluorescence staining results showed that the nucleuses from untreated group were uniformly stained， while those from the group treated for 48 hours were densely stained and broken. The spectra results revealed that the intensity of peaks associated with nucleic acid and protein decreased after the cells were incubated with the extracts of Zanthoxyli Radix for 12， 24， 36 and 48 hours. The intensity of peaks at 785，1 002，1 175，1 660 cm^-1 was decreased with the time of the cells were incubated by the extracts of Zanthoxyli Radix. The results indicated that the extracts of Zanthoxyli Radix could induce the apoptosis of hepatoma cells and reduce the amount of nucleic acid and protein in the cells. There is a certain relevance between the drug treatment time and the efficacy. The above results suggest that Raman spectra can provide abundant information about the changes in biological macromolecules within the cells after incubated by the extracts of Zanthoxyli Radix and serve as an effective method for the real time measurement of apoptosis.

[Key words]Raman spectroscopy； hepatoma cell； Zanthoxyli Radix

doi：10.4268/cjcmm20162119

兩面針系蕓香科花椒屬藤本植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的干燥根，又名入地金牛、蔓椒、雙面針、雙背針等。兩面針是廣西道地藥材，富含生物堿、木質(zhì)素、香豆素和揮發(fā)油等，具有活血化瘀，行氣止痛，祛風(fēng)通絡(luò)，解毒消腫等功效，用于跌撲損傷，胃痛，牙痛，風(fēng)濕麻痹，毒蛇咬傷等^[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿為主的生物堿活性成分發(fā)揮抗腫瘤作用，其主要作用機(jī)制是抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶活性、阻滯細(xì)胞周期、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等^[2]。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為治療癌癥的新途徑，紫杉醇通過抑制癌細(xì)胞有絲分裂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對子宮癌、乳腺癌、卵巢癌等具有特殊療效^[3]。細(xì)胞凋亡時(shí)會發(fā)生一些特征性的形態(tài)和生化改變，現(xiàn)在常用的檢測細(xì)胞凋亡的方法有電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、核酸電泳等^[4]。拉曼光譜技術(shù)是通過拉曼光譜特征峰的位置和強(qiáng)度來反映分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)和振動結(jié)構(gòu)，從分子水平上對細(xì)胞進(jìn)行檢測，拉曼光譜已成為研究細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)變化的有效工具^[5-6]。拉曼光譜具有非破壞性，非侵入性，不需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理，一般的生物樣品，細(xì)胞、活體組織、DNA以及RNA都可以直接測量。拉曼光譜主要是測定細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子的變化過程，藥液對激發(fā)拉曼散射的可見光只有很弱的吸收，這使得拉曼光譜技術(shù)適合于研究溶液體系如藥物培養(yǎng)液中的細(xì)胞^[7]。近年來拉曼光譜也廣泛用于乳腺癌、肝癌等癌癥診斷以及治療的研究中^[8-11]。

本文從兩面針中提取活性成分，對體外肝癌細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間段的處理，利用單細(xì)胞拉曼光譜系統(tǒng)測定不同處理時(shí)間段細(xì)胞的光譜，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，以期揭示腫瘤光譜特征變化所反映的生物學(xué)內(nèi)涵，促進(jìn)中藥兩面針中的有效成分誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的生理過程的深入理解。

1 材料

1.1 藥物 氯化兩面針堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號1108482-200502，供含量測定用，純度>99.5%）。兩面針樣品分別采集于廣西南寧市大塘鎮(zhèn)和柳州市融水縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院中藥室賴茂祥研究員鑒定為蕓香科兩面針Z.nitidum的干燥根。

1.2 試劑 氯仿（國藥集團(tuán)，分析純）；RPMI DMEM培養(yǎng)基，RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；新生牛血清（杭州四季青生物材料研究所）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Solarbio）；胰蛋白酶（美國Amersco公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Amersco公司）；N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）（美國Sanland-chem公司）；二甲基亞砜（DMSO）（廣州市新港化工有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Hochest33342/PI染色液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 細(xì)胞株 BEL-7404人肝癌細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.4 儀器 Thermo Forma CO₂培養(yǎng)箱（美國 Forma Scientific公司）；Axiovert 200型倒置光學(xué)顯微鏡（德國Zeiss公司）；Model-450酶聯(lián)免疫檢測儀（美國 Bio-Rad公司）；超低溫冰箱（日本三洋公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；平板振蕩器（北京海淀電子醫(yī)療儀器廠）。

1.5 拉曼系統(tǒng) 單光鑷?yán)到y(tǒng)為一束波長為785 nm的半導(dǎo)體激光（美國Thorlabs公司）經(jīng)過濾波后進(jìn)入一臺TE2000U尼康倒置生物顯微鏡（日本Nikon公司），在進(jìn)顯微鏡之前，增加一對X和Y方向的電控掃描對鏡，通過信號發(fā)生器給對鏡的電機(jī)加電，通過調(diào)節(jié)電壓分別控制X和Y方向掃描的幅度，通過調(diào)節(jié)信號的頻率控制掃描的頻率。在本實(shí)驗(yàn)中，X方向設(shè)定的頻率為8 Hz，即1 s掃描8次，Y方向設(shè)定的頻率為0.3 Hz，X和Y方向電壓都設(shè)定為2.6 V。光譜儀耦合到電荷耦合器件CCD上，CCD用液氮冷卻到-120 ℃，用懸浮在水中的聚苯乙烯小球做系統(tǒng)校正。

2 方法

2.1 兩面針樣品溶液的制備 精密稱取兩面針?biāo)幉?.00 g，加氯仿180 mL，回流提取3次，每次2 h，過濾，回收氯仿，殘?jiān)脽o水乙醇定容到5 mL量瓶中。提取物用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，取濾液300 μL，加入RPMI1640培養(yǎng)液1 200 μL，即得。此方法處理后的樣品溶液生藥濃度為120 g·L^-1，再將其質(zhì)量濃度對半稀釋成60 g·L^-1。置于4 ℃保存待用。

2.2 氯化兩面針堿溶液的配制 精密稱取氯化兩面針堿1.00 mg，無水乙醇定容至1 mL。于超聲儀中超聲1 h后，在超凈臺上用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，取濾液300 μL，加入RPMI1640培養(yǎng)液1 200 μL，即得氯化兩面針堿的質(zhì)量濃度為0.20 g·L^-1。

2.3 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞7404培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺2 nmol·L^-1、青霉素100 IU·mL^-1和鏈霉素100 IU·mL^-1，37 ℃，5% CO₂常規(guī)培養(yǎng)。每天2次置于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.4 肝癌細(xì)胞拉曼光譜的測定 取對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞7404懸液接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞濃度為1×105個/mL，每孔190 μL；培養(yǎng)24 h后，分別加入兩面針提取溶液，每孔10 μL（兩面針樣品溶液和氯化兩面針堿溶液作用到肝癌細(xì)胞上的最終濃度分別是3 g·L^-1及10 mg·L^-1，此濃度是通過前期MTT法及流式細(xì)胞儀研究確定的最佳藥物作用濃度），并根據(jù)藥物對細(xì)胞的作用時(shí)間12，24，36，48 h進(jìn)行分組。各組細(xì)胞經(jīng)過酶消化、離心、PBS漂洗后，用PBS稀釋至適宜濃度后用于拉曼光譜的測定。

從各組細(xì)胞中取一部分用于拉曼光譜的檢測。激光光鑷?yán)庾V系統(tǒng)（LTRS），激光光鑷?yán)庾V系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)裝置及系統(tǒng)描述詳見1.5項(xiàng)。一般而言，拉曼光譜系統(tǒng)激光激發(fā)光斑直徑在2 μm左右，面積約3.14 μm²，肝癌細(xì)胞的直徑一般在15～20 μm，面積大于200 μm²，入射激光僅照射細(xì)胞的局部區(qū)域不一定能獲取整個細(xì)胞的光譜信息，本實(shí)驗(yàn)采用掃描方式收集細(xì)胞光譜，即設(shè)定一個區(qū)域和時(shí)間讓激光連續(xù)在設(shè)定好的區(qū)域進(jìn)行運(yùn)動，以累積的方式記錄光譜信號，由此獲取的細(xì)胞光譜信息較全面。為了獲得單個細(xì)胞的整體光譜，實(shí)驗(yàn)采用激光束動態(tài)掃描模式，激光束在一個周期內(nèi)以分別向X軸橫向和Y軸縱向運(yùn)動，實(shí)驗(yàn)中掃描頻率被設(shè)定為1 Hz。以20 mW激發(fā)功率和30 s曝光時(shí)間。拉曼系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)條件是已經(jīng)通過前期研究^[12]設(shè)定，拉曼光譜的響應(yīng)強(qiáng)度足以反映細(xì)胞的拉曼圖譜。

拉曼檢測流程：加樣，隨機(jī)選取視野，視野中每個細(xì)胞均檢測其拉曼光譜，然后用Hochest33342/PI染色法區(qū)分正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞，最后選取凋亡細(xì)胞的拉曼光譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。重復(fù)以上操作直到獲得30個凋亡細(xì)胞的拉曼光譜數(shù)據(jù)。掃描的范圍是可以包括整個細(xì)胞面積的最小四邊形，來自于溶液、石英片、光學(xué)部件的背景光譜也用同樣掃描的面積取得。每掃描一個細(xì)胞光譜的同時(shí)，要掃描一次細(xì)胞周圍樣品池的背景光譜，進(jìn)行背景光譜的扣除，最后得到細(xì)胞的光譜。由于每個細(xì)胞只被功率為20 mW 的激光照射了30 s，因此對細(xì)胞生物活性的影響很小^[13]。

細(xì)胞活性的鑒定：各組細(xì)胞完成拉曼檢測后將5 mg·L^-1 Hochest33342熒光染料及5 mg·L^-1 PI熒光染料加入待檢測樣品中。避光反應(yīng)15 min，置于熒光顯微鏡下，在激發(fā)波長為352 nm的紫外光及激發(fā)波長為488 nm下觀察細(xì)胞的情況。

2.5 數(shù)據(jù)處理 光譜數(shù)據(jù)運(yùn)用Origin 8.0進(jìn)行背景扣除、平滑、拉曼光譜基線校正軟件進(jìn)行基線校正，用Unscrambler 9.7對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，歸一化的方法是標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（standardized normal variate， SNV）。

3 結(jié)果

3.1 7404肝癌細(xì)胞的Hochest33342/PI染色結(jié)果 Hochest33342/PI在熒光顯微鏡下觀察?；罴?xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；染色后其細(xì)胞核在激發(fā)波長為352 nm下呈彌漫均勻的淡藍(lán)色熒光；活細(xì)胞對PI 染料拒染，所以在激發(fā)波長488 nm下觀察不到紅色熒光，見圖1。

凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整；染色后其細(xì)胞核在激發(fā)波長為352 nm下呈亮藍(lán)色熒光，并觀察到核碎裂；凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整對PI染料拒染，所以在激發(fā)波長488 nm下觀察不到紅色熒光，見圖1。

死亡細(xì)胞的胞膜完整性被破壞；染色后其細(xì)胞核在激發(fā)波長為352 nm下觀察到藍(lán)色熒光；在激發(fā)波長488 nm下觀察到紅色熒光，見圖1 。

在激發(fā)波長為352 nm下是不能區(qū)分凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞的。只有在激發(fā)波長488 nm下，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整對PI染料拒染，觀察不到紅色熒光；死亡細(xì)胞細(xì)胞膜被破壞，PI染料進(jìn)入細(xì)胞在激發(fā)波觀察到紅色熒光，見圖1。可以區(qū)分對應(yīng)凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。

3.2 各組細(xì)胞拉曼光譜 經(jīng)兩面針?biāo)幰禾幚?，12，24，36，48 h的肝癌細(xì)胞的平均拉曼光譜見圖2，各峰歸屬見表1。從圖2可以觀察到A組不加藥物處理的肝癌細(xì)胞平均拉曼光譜隨時(shí)間的變化沒有發(fā)生明顯的變化趨勢，而加入藥物處理后的B，C，D組的肝癌細(xì)胞的拉曼光譜隨時(shí)間的變化發(fā)生了一些規(guī)律性的變化。與核酸相關(guān)的譜峰，785 cm^-1代表核酸U，C，T堿基環(huán)呼吸振動和磷酸二酯鍵O-P-O伸縮振動，此峰值隨著藥物作用時(shí)間的推移逐漸降低。與蛋白質(zhì)相關(guān)的譜峰，1 002 cm^-1代表苯丙氨酸面內(nèi)振動，1 080 cm^-1代表蛋白質(zhì)C-N伸縮振動，1 175 cm^-1代表蛋白質(zhì)分子的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等殘基中的C-O基團(tuán)氫鍵結(jié)合力，1 259 cm^-1代表蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶，1 610 cm^-1代表絡(luò)氨酸的C=C伸縮振動，1 660 cm^-1代表蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶。1 002，1 175，1 259，1 660 cm^-1峰強(qiáng)度隨兩面針?biāo)幬镒饔脮r(shí)間的延長都有不同程度的降低。1 610 cm^-1峰強(qiáng)度隨兩面針?biāo)幬镒饔脮r(shí)間的延長而升高。與脂質(zhì)相關(guān)的譜峰，1 443 cm^-1代表脂質(zhì)CH₂/CH3變形振動，1 300 cm^-1代表脂質(zhì)CH₂扭曲振動，這2個峰沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化趨勢。

為了定量描述肝癌細(xì)胞中生物大分子的含量隨著兩面針?biāo)幰禾幚頃r(shí)間的變化規(guī)律，從拉曼光譜圖中提取785，1 002，1 660，1 610 cm^-1這4個表征細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)變化的特征峰相對峰強(qiáng)度百分比，結(jié)果見表2～4。785，1 002，1 660 cm^-1相對峰強(qiáng)度隨藥物作用時(shí)間的延長而顯著，由此說明肝癌細(xì)胞在凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)類等生物大分子顯著降低。

4 討論

785 cm^-1峰值隨藥物處理時(shí)間延長顯著的降低，是反映細(xì)胞凋亡程度的敏感指標(biāo)。785 cm^-1峰強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)磷酸二酯鍵以及C，T，U堿基含量，由此可以推論兩面針?biāo)幬镒饔煤?，肝癌?xì)胞的DNA的磷酸根骨架有一定的斷裂，細(xì)胞內(nèi)含氮堿基含量逐漸下降，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的分裂繁殖失去有效的控制。這和目前對細(xì)胞凋亡的認(rèn)識是一致的^[12]。細(xì)胞凋亡時(shí)，內(nèi)源性的核酸內(nèi)切酶被激活，在核小體的連接處將DNA切斷為200 bp整數(shù)倍的小片段，細(xì)胞在凋亡晚期DNA降解加劇，因此核酸堿基的含量也會下降。DNA是許多抗癌藥物作用的靶標(biāo)^[15-16]，應(yīng)用共振拉曼光譜研究抗癌藥物與DNA的相互作用，能夠得出相互作用的位點(diǎn)和連接方式等重要信息。據(jù)現(xiàn)有的研究及相關(guān)報(bào)道^[17]，兩面針提取液作用于肝癌細(xì)胞后其可能的機(jī)制是兩面針活性成分能夠嵌入DNA，影響拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的DNA鏈的切割/連接過程，造成細(xì)胞內(nèi)大量DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期阻滯于G₂/M期，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

1 002，1 175，1 660 cm^-1峰強(qiáng)度隨兩面針提取物作用時(shí)間的延長而降低，而1 610 cm^-1峰隨著提取物作用時(shí)間的延長而升高，表明細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈氨基酸殘基發(fā)生改變，酪氨酸增多，苯丙氨酸減少，同時(shí)蛋白質(zhì)分子中酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等殘基中的C-O基團(tuán)結(jié)合的氫鍵受到破壞，蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ及蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ的峰高降低，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。1 610 cm^-1峰強(qiáng)度并未隨氯化兩面針堿作用時(shí)間的延長而升高，說明氯化兩面針堿是單一生物堿藥效成分，而兩面針提取物含多種生物堿混合藥效成分，兩者總體上誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制是一致的，但也存在微小的差別，這種差異的原因有待進(jìn)一步的研究。

兩面針抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，一方面與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)降低有關(guān)，使蛋白質(zhì)的合成代謝減弱；另一方面，凋亡的過程確實(shí)會伴隨著一些蛋白的水解，因此蛋白質(zhì)含量會下降。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)半胱氨酸蛋白酶家族的成員被水解激活，活化的酶可以催化其他底物蛋白的水解，造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的降低。

5 結(jié)論

肝癌細(xì)胞經(jīng)兩面針提取物處理后，利用顯微拉曼光譜技術(shù)測定不同處理時(shí)間后肝癌細(xì)胞拉曼光譜的變化，結(jié)果表明肝癌細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)含量隨藥物處理時(shí)間的延長而顯著降低，說明凋亡的肝癌細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的含量均低于活細(xì)胞，并與藥物處理時(shí)間呈一定的相關(guān)性。拉曼光譜能夠反映經(jīng)中藥兩面針提取物作用后肝癌細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)變化的信息，對實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞凋亡過程及藥物的篩選乃至臨床應(yīng)用具有重要意義。

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[責(zé)任編輯 陳玲]