劉柏炎　宋曉玲　易　健　陳雪梅

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南　長沙　410007)

雌二醇對(duì)去勢大鼠局灶性腦缺血后小窩蛋白-1和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

劉柏炎宋曉玲易健陳雪梅

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410007)

〔摘要〕目的探討去雌二醇對(duì)去勢大鼠局灶性腦缺血(MCAO)后小窩蛋白(caveolin)-1和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法60只雌性大鼠，切除卵巢復(fù)制去勢模型，隨后采用大腦中動(dòng)脈線栓法復(fù)制MCAO模型，隨機(jī)分組為假手術(shù)組、去勢(OVX)模型組、腦缺血模型組(MCAO組)、去勢后聯(lián)合MCAO組(雙模型組)和雌激素組，采用免疫組織化學(xué)法檢測各組動(dòng)物腦內(nèi)caveolin-1、VEGF的表達(dá)，同時(shí)評(píng)價(jià)其神經(jīng)功能。結(jié)果在正常大鼠腦內(nèi)有一定量caveolin-1、VEGF陽性細(xì)胞，去勢對(duì)其影響不明顯，腦缺血后caveolin-1、VEGF陽性細(xì)胞增加，與MCAO組與雙模型組比較，雌激素能改善模型大鼠的神經(jīng)功能缺失癥狀，增強(qiáng)caveolin-1、VEGF的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論雌激素能增加去勢大鼠局灶性腦缺血后caveolin-1、VEGF的表達(dá)，是其抗腦缺血的可能作用機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕雌激素；局灶性腦缺血；去勢；caveolin-1；VEGF

腦卒中作為中老年常見的急性腦血管疾病，是致殘致死的主要因素之一。臨床流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中發(fā)病率存在男女性別差異，絕經(jīng)前女性發(fā)病率低于同齡男性，絕經(jīng)后其發(fā)病率較絕經(jīng)前顯著增加〔1,2〕。生理水平的雌激素治療可降低卒中發(fā)生的相對(duì)危險(xiǎn)度和死亡率〔3〕，但其作用機(jī)制尚未見完全明確。小離蛋白(caveolin)-1與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可能在腦缺血損傷和修復(fù)中扮演了重要作用〔4,5〕，本文擬從caveolin-1、VEGF角度探討雌激素抗腦缺血的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1藥物及主要試劑戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂)購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，麻油溶解為終濃度500 μg/ml，冷藏備用。小鼠抗大鼠 VEGF單克隆抗體、小鼠抗大鼠 caveolin-1抗體購自Abcam公司，SABC 免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自Zymed公司。

1.2主要儀器德國 Leica 公司 RM2235石蠟切片機(jī)，日本olympus公司BX51光學(xué)顯微鏡及Image-Pro Express圖像分析系統(tǒng)。

1.3動(dòng)物分組與給藥雌性特殊清潔級(jí)(SPF)Wistar大鼠，280～300 g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分為去勢模型組(OVX組)、腦缺血模型組(MCAO組)、去勢后聯(lián)合腦缺血組(雙模型組)、雌激素組，動(dòng)物局灶性腦缺血術(shù)后7 d處死，剔除死亡動(dòng)物外每組12只；另設(shè)假手術(shù)組6只。根據(jù)文獻(xiàn)〔6〕雌激素組口服給予戊酸雌二醇溶液500 μg·kg-1·d-1，其他各組動(dòng)物均給予等體積無菌蒸餾水，自由飲食、活動(dòng)。

1.4動(dòng)物

1.4.1去勢造模(OVX)參照文獻(xiàn)〔6〕將60只大鼠10%水合氯醛(1.0 g/kg)腹腔注射麻醉后，腹位固定，腋下2 cm切開腹腔，切除卵巢(假手術(shù)組只切除小塊脂肪)，縫合術(shù)后予以抗感染處理。如法摘除另一側(cè)的卵巢。手術(shù)后第5天開始每天取其陰道分泌物涂片，每天一次，連續(xù)5 d，以不出現(xiàn)動(dòng)情周期反應(yīng)確定造模成功。

1.4.2局灶性腦缺血(MCAO)造模參照文獻(xiàn)改良Zea等〔7〕的大腦中動(dòng)脈線栓法建立MCAO大鼠模型：10%水合氯醛(1.0 g/kg)腹腔注射麻醉后，將去勢雌鼠固定，頸正中切口游離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈分叉部下方剪一小口，將一預(yù)先燒成圓頭的尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直到遇到輕微阻力為止，插入深度由分叉部計(jì)為(17～20)mm，固定尼龍線，依次關(guān)閉切口。假手術(shù)組僅切開皮膚、分離右側(cè)頸總動(dòng)脈后即縫合。動(dòng)物蘇醒后神經(jīng)功能評(píng)分1～3分入者組。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1神經(jīng)功能評(píng)分參照文獻(xiàn)〔7〕方法進(jìn)行5級(jí)評(píng)分。各組動(dòng)物在手術(shù)后2 h和處死前2 h進(jìn)行評(píng)分。

1.5.2紅四氮唑(TTC)檢測參照文獻(xiàn)〔7〕將大鼠以10%水合氯醛(4.0 mg/kg)麻醉后，斷頭取腦，用0.01 mol/L PBS沖洗后立即放入-34℃冰箱快速冷凍30 min后去掉嗅球、小腦和低位腦干，自額極后2 mm做等距離5個(gè)冠狀切片，腦片用2%濃度TTC染色，37℃避光水浴染色30 min，正常組織呈紅色，梗死組織為白色。拍成數(shù)碼照片拷入電腦，運(yùn)用Image-Pro Express圖像分析系統(tǒng)計(jì)算非梗死區(qū)面積，梗死面積的百分比(IS%)按Swanson方法〔8〕進(jìn)行校正。IS%=(健側(cè)總面積-患側(cè)非梗死區(qū)面積)/2×健側(cè)總面積×100%。

1.5.3VEGF、caveolin-1檢測采用免疫組化SABC法檢測，DAB顯色，其中VEGF濃度為1∶300，caveolin-1濃度為1∶500。大鼠以10%水合氯醛(4.0 ml/kg)麻醉后，4℃的4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，冠狀切片。每只動(dòng)物取切片5張，置于100倍物鏡下，每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野，用Olympus MicroImage 4.0 圖像處理系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)數(shù)免疫陽性細(xì)胞數(shù)。

2結(jié)果

2.1雌二醇對(duì)大鼠腦缺血面積及神經(jīng)功能的影響用藥前MCAO組、雙模型組、雌激素組神經(jīng)功能缺失癥狀積分和缺血面積三組間無顯著性差異，但與假手術(shù)組和OVX組比較差異顯著(P<0.05)；治療后雌激素組在改善神經(jīng)功能缺失癥狀和減少腦缺血面積上與MCAO組、雙模型組有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1　補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠腦缺血面積及

與MCAO組比較：1)P<0.05；與雙模型組比較：2)P<0.05；與假手術(shù)組和OVX組比較：3)P<0.05

2.2雌二醇對(duì)模型大鼠VEGF、caveolin-1表達(dá)的影響在正常腦組織中VEGF、caveolin-1均有一定程度的表達(dá)，腦缺血后MCAO組、雙模型組、雌激素組VEGF、caveolin-1表達(dá)增加，與假手術(shù)組、OVX組比較有顯著性差異(P<0.05)，且雌激素組能明顯增加VEGF、caveolin-1表達(dá)，與MCAO組、雙模型組差異均有顯著性(P<0.05)。見表2。

表2　補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠缺血腦內(nèi)caveolin-1、

與MCAO組比較：1)P<0.05；與雙模型組比較：2)P<0.05

3討論

腦血管阻塞后，缺血周圍區(qū)組織由于血流的低灌注引起細(xì)胞的繼發(fā)性損傷，因此，重建周圍區(qū)微循環(huán)、恢復(fù)組織血流供應(yīng)對(duì)功能康復(fù)有著重要的意義。

腦缺血后半暗區(qū)組織血運(yùn)重建的好壞對(duì)患者功能恢復(fù)有顯著影響〔9〕，而血管新生是血運(yùn)重建的物質(zhì)基礎(chǔ)。血管新生包括內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、移行、管腔形成和出芽等多個(gè)環(huán)節(jié)，受眾多因素調(diào)節(jié)。VEGF作為一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂原，在血管新生中起重要作用。當(dāng)組織低氧、缺血時(shí)，VEGF表達(dá)增強(qiáng)并與其特異性受體結(jié)合而發(fā)揮生理作用。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF過表達(dá)、低表達(dá)大鼠和VEGF野生型大鼠在腦缺血損傷后VEGF過表達(dá)大鼠腦梗死體積最小〔4〕。caveolin-1不僅是細(xì)胞質(zhì)膜微囊的最主要結(jié)構(gòu)組分，也是其功能蛋白，caveolin-1通過其腳手架結(jié)構(gòu)域與eNOS、PKC等多種信號(hào)分子結(jié)合，調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，參與細(xì)胞的多種生理、病理活動(dòng)〔5〕。研究表明，caveolin-1參與了腦缺血損傷和組織修復(fù)過程，如局灶性腦缺血后caveolin-1基因缺失小鼠腦水腫和梗死面積加重，神經(jīng)功能恢復(fù)速度明顯減緩〔10〕；抑制caveolin-1可抑制缺血周邊腦組織的血管新生〔11〕。更有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，caveolin-1能影響氧糖剝奪/復(fù)氧損傷的人臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞中VEGF表達(dá)〔12〕，caveolin-1敲除小鼠腦缺血后，血管功能不能有效恢復(fù)，對(duì)VEGF的刺激無反應(yīng)，血管新生減弱。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦缺血后VEGF和caveolin-1表達(dá)顯著增加，去勢可減少兩者的表達(dá)，但仍高于假手術(shù)組；VEGF與Careolin-1表達(dá)規(guī)律相似，但cavedin-1表達(dá)強(qiáng)度明顯弱于VEGF?？梢?，caveolin-1參與了VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

雌激素作為類固醇類激素，已經(jīng)證實(shí)與腦卒中的發(fā)生有密切關(guān)系〔1〕，研究發(fā)現(xiàn)去勢大鼠腦缺血面積顯著增加、神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重，給予雌二醇治療可減少梗死面積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)〔13〕。目前認(rèn)為其抗缺血損傷與改善血流供應(yīng)、抗氧自由基損傷和抑制凋亡等有關(guān)〔14〕，但機(jī)制尚未完全明確。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)雌激素呈劑量依賴性地刺激培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF和新血管形成〔15〕。生理濃度雌二醇在正常氧條件下促進(jìn)體外視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 VEGF表達(dá)，低氧條件下通則降低VEGF表達(dá)〔16〕。雌二醇還能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞caveolin-1基因表達(dá)〔17〕，通過調(diào)節(jié)caveolin-1表達(dá)而促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖〔18〕。本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素治療后神經(jīng)功能缺損積分減少，且能顯著增加careolin-1和VEGF的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)，去勢大鼠腦缺血損傷后caveolin-1與VEGF陽性細(xì)胞數(shù)少于單純腦缺血大鼠，予以雌激素治療后，動(dòng)物神經(jīng)功能恢復(fù)明顯，caveolin-1與VEGF表達(dá)增強(qiáng)，提示影響VEGF及caveolin-1是雌激素抗腦缺血損傷的又一可能機(jī)制。

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〔2015-11-19修回〕

(編輯李相軍)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30873355，81273989)；湖南省教育廳創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目(12K089)

〔中圖分類號(hào)〕R743.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)10-2321-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.005

第一作者：劉柏炎(1970-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治心腦疾病與干細(xì)胞研究。