鄯科明，李天一，濮吉,3

1. 中國兵器工業(yè)規(guī)劃研究院, 北京 100053； 2. 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206； 3. 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310003

·論著·

2,4-二氨基喹唑啉衍生物的抑菌活性研究

鄯科明1，李天一2，濮吉2,3

1. 中國兵器工業(yè)規(guī)劃研究院, 北京 100053； 2. 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206； 3. 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310003

摘要：喹唑啉衍生物具有廣泛的生物活性，包括抗菌活性。為發(fā)現(xiàn)此類化合物中具有潛在抑菌活性的化合物，本研究考察了15種帶有哌嗪二硫代甲酸酯側(cè)鏈的2,4-二氨基喹唑啉衍生物7a～7o的抑菌活性。首先采用分子對接方法對底物與酶的結(jié)合能進行預測，并用標準2倍稀釋法測定這15種化合物對多重耐藥大腸埃希菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。結(jié)果表明，15種化合物與陽性對照相比均具有較好的抑菌活性?；衔?a、7g和7k具有明顯的抑菌活性，其MIC均≤1 mg/mL。進一步采用高效毛細管電泳篩選模型對7a、7g和7k進行分子水平抑菌實驗，分別測定其抑制率與半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)，發(fā)現(xiàn)化合物7k具有最佳抑制活性(IC50為4.97×10-2mg/mL)。此外，對15種化合物抑菌活性構(gòu)效關系的研究表明，苯環(huán)上連有吸電子基團的哌嗪二硫代甲酸酯側(cè)鏈對抑菌活性有貢獻。這一研究有望為抑菌藥物的研發(fā)提供有效的先導化合物。

關鍵詞：2,4-二氨基喹唑啉；哌嗪基-1-二硫代氨基甲酸酯；抑菌活性；抗葉酸劑；毛細管電泳

二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)是葉酸代謝中的關鍵酶[1]。其在胸苷酸合成中以還原型NADPH為輔因子，將二氫葉酸(dihydrofolate，DHF)還原為四氫葉酸(tetrahydrofolate，THF)[2]；THF亞甲基化后形成N5,N10-亞甲基四氫葉酸(5,10-CH2-THF)，作為一碳單位供體參與胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)催化的反應[3]。TS是一種葉酸依賴酶，在菌體內(nèi)以5,10-CH2-THF為輔因子催化dUMP還原甲基化生成dTMP[4]。dTMP進一步在菌體內(nèi)代謝為dTTP，為DNA合成所必需的前體物質(zhì)(圖1A)。抑制DHFR的活性可破壞細菌的葉酸代謝及胸苷酸循環(huán)，使細菌DNA合成受阻而發(fā)揮抑菌作用。

在抗生素濫用造成細菌耐藥性肆虐的今天，不斷開發(fā)新的抑菌藥物始終是藥物及微生物領域研究的熱點。此外，不同物種間DHFR的氨基酸序列存在顯著差異[5]，使其成為抗葉酸劑開發(fā)的潛在重要靶標[6]。因此，DHFR抑制劑篩選有重要的現(xiàn)實意義。DHFR抑制劑篩選的傳統(tǒng)途徑有紫外分光光度法[7]、熒光光度法[8]、同位素示蹤法[9]及高效液相色譜法[10-11]等。高效毛細管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)是近年飛速發(fā)展的一種新型高效分離分析技術，主要優(yōu)勢是樣本用量極少、分離分析模式靈活多變，在化學、環(huán)境、生命科學領域中有極廣闊的應用前景[12]。目前，采用HPCE建立的DHFR抑制劑篩選模型已成功建立[13]。

作為抗葉酸劑，喹唑啉類化合物對細菌生長有良好的抑制作用[14-20]。這是因為喹唑啉類化合物與DHFR的生理底物DHF有類似的母環(huán)結(jié)構(gòu)，可競爭性地結(jié)合靶蛋白。例如，2,4-二氨基-5-氯-6-取代芐氨基喹唑啉類化合物(圖1B所示化合物1～3)對肺炎雙球菌(Diplococcuspneumoniae，D.pneumoniae)具有較好的抑制活性[21]；又如6-甲基-2-芳基/仲胺基-4-芳基喹唑啉類化合物(圖1B所示化合物4和5)對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis，E.faecalis)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae)的抑制活性優(yōu)于對照組[22]。此外，在先前研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)合于2-甲基-4-氧代喹唑啉C6位的二硫代氨基甲酸酯是藥效基團[23-25]，其中又以帶有哌嗪二硫代甲酸酯側(cè)鏈的喹唑啉衍生物(圖1B所示化合物6)活性最佳。

綜合上述研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，喹唑啉母環(huán)及喹唑啉C6位的哌嗪基二硫代甲酸酯側(cè)鏈都可能提升抗葉酸劑的抑菌活性。因此，本研究擬對15種具有上述結(jié)構(gòu)特征的2,4-二氨基喹唑啉衍生物(圖1C所示化合物7a～7o)進行抑菌活性考察，從分子對接理論計算入手，預測待測化合物作為底物與DHFR靶蛋白的結(jié)合能力，再測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)作為初步驗證，對其中抑制效果較為明顯的化合物采用已建立的HPCE模型進一步考察，以期發(fā)現(xiàn)具有更好抑菌活性的化合物。

1材料與方法

1.1材料

化合物7a～7o由首都師范大學化學系曹勝利教授饋贈[26]。多重耐藥大腸埃希菌ST171(已證實對阿莫克拉、氨曲南、氯霉素、頭孢吡肟、氨芐西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、卡那霉素、呋喃妥因、哌拉西林、鏈霉素、四環(huán)素、萘啶酸、頭孢曲松、諾氟沙星、舒巴坦、復方新諾明、頭孢噻吩、頭孢呋辛具有耐藥性)和質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所熊衍文研究員惠贈。大腸埃希菌源DHFR由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供。高效毛細管電泳儀P/ACE MDQ購自美國Beckman公司，二極管陣列檢測器、熔融石英毛細管柱(60 cm×75 μm)購自銳灃色譜器件有限公司，紫外分光光度計UV-250購自日本島津公司。Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基、MH肉湯購自北京陸橋技術股份有限公司，DHF (≥90%)、THF(≥65%)、NADPH(≥90%)、NADP(≥90%)、2-巰基乙醇、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、Brij-35購自美國Sigma-Aldrich公司，甲氧芐啶(trimethoprim，TMP)、磺胺甲唑(sulfamethoxazole，SMX)購自中國藥品生物制品檢定所，其余分析純試劑均購自國藥集團化學試劑北京有限公司。蛋白濃度檢測試劑盒(#500-0204)購自Bio-Rad公司，細菌培養(yǎng)用超純水由美國Millipore純水系統(tǒng)制得，分離分析用純水購自杭州娃哈哈集團有限公司，96孔板購自美國Costar公司。

A: Schematic diagram of folic acid metabolic pathway. B: Structures of compounds 1-6. C: Structures of compounds 7a-7o.

圖1葉酸代謝通路示意圖以及化合物1～6和7a～7o的化學結(jié)構(gòu)

Fig.1Schematic diagram of folic acid metabolic pathway and structures of compounds 1-6 and compounds 7a-7o

1.2方法

1.2.1分子對接模擬對接軟件AutoDock、Vina、ADT和PyMOL獲自The Scripps Institute；大腸埃希菌DHFR晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 4NX6)下載于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)；用于對接計算的化合物7a～7o三維結(jié)構(gòu)由化學軟件ChemDraw和Chem3D繪制。

1.2.2MIC的測定待測化合物7a～7o對大腸埃希菌ST171的MIC參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的標準2倍稀釋法[27]進行，實驗平行3次。以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株，復方新諾明的主要成分TMP-SMX為藥物陽性對照(TMP和SMX的濃度分別為16和80 mg/mL)[28]，相同條件下不加入藥物的菌液為陰性對照。

1.2.3酶活力的測定采用紫外分光光度法在20 ℃測定DHFR酶活力，比色池光徑為1 cm，監(jiān)測波長為340 nm，摩爾吸光系數(shù)為12 300 L/(mol·cm)[29]。測活體系包括含0.02% 2-巰基乙醇的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)(pH 7.0)、0.1 mmol/L DHF、0.1 mmol/L NADPH和0.7 μg/mL DHFR，總體積1.2 mL。以不加DHFR的體系為空白對照。一個單位的酶活力定義為：在該檢測條件下，1 min還原1 μmol/L DHF所需的酶質(zhì)量。

1.2.4抑制率及半數(shù)抑制濃度的測定抑制率及半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)的測定采用HPCE，分離條件參照文獻[30]。將待測化合物7a、7g和7k精確稱量0.5 mg(賽多利斯精密天平，CPA225D)，先溶于25 μL DMSO中(不易溶的化合物采取加熱助溶后再冷卻至室溫)，再用20%乙醇稀釋至500 μL，即配成1 mg/mL標準溶液。另取Eppendorf管，依次加入 25 μL 50 mmol/L PBS (pH 6.0)、10 μL 25 μg/mL DHF溶液(精確稱取1 mg DHF溶于含0.02% 2-巰基乙醇的50 mmol/L PBS，pH 7.0)、10 μL 0.25 u/mg DHFR溶液、5 μL 0.5 mg/mL NADPH溶液(精確稱取1 mg NADPH溶于1 mL 40 mmol/L NaOH溶液)，渦旋振蕩混勻后于室溫反應30 min。以5 μL 50 mmol/L PBS (pH 6.0)代替抑制劑進行對照實驗，以不加DHFR的體系進行空白實驗?；旌虾蟮拇郎y樣本用HPCE分離[10]，以THF和DHF峰面積的差值計算抑制率及IC50。

2結(jié)果

2.1分子對接模擬

待測化合物7a～7o三維結(jié)構(gòu)及DHFR晶體結(jié)構(gòu)采用ADT處理并轉(zhuǎn)換成pdbqt格式，建立處理后的化合物數(shù)據(jù)庫。運行AutoGrid，GridBox中心選擇晶體結(jié)合區(qū)域30.0×30.0×30.0，1.0 ?。Vina計算輸出的待測化合物7a～7o對DHFR的結(jié)合能預測結(jié)果見表1。采用PyMOL進一步分析底物與酶的相互作用。圖2以化合物7k為例顯示了分子對接模擬底物與酶的結(jié)合。

表1分子對接結(jié)合能預測和最小抑菌濃度(n=5)

Tab.1Binding energy calculated by docking and MIC (n=5)

CompoundBindingenergyMIC(mg/mL)CompoundBindingenergyMIC(mg/mL)7a-6.91.07i-8.22.07b-7.67.87j-7.315.67c-7.67.87k-8.00.1257d-7.53.97l-8.23.97e-7.13.97m-6.27.87f-6.52.07n-6.815.67g-7.60.257o-5.57.87h-6.67.8SMX-6.3—

—, no antibacterial effect from the first well at half original concentration.

A: Surface representation of DHFR crystal structure and active site cleft (colored in red). B: Crystal structure of compound 7k bound to DHFR (hydrogen bonds are highlighted with yellow dotted lines, and water molecular is presented as red ball).

圖2化合物7k與DHFR的對接模擬

Fig.2Docking simulation of compound 7k and DHFR

2.2MIC的測定

以MIC測定結(jié)果作為初步判斷依據(jù)。該值越低表明藥物具有越強的潛在抑菌活性。由表1可知，化合物7a、7g和7k具有明顯的抑菌活性，MIC均≤1.0 mg/mL。

2.3酶活力、抑制率及IC50的測定

為確保后續(xù)抑制實驗的可靠性，首先對DHFR的酶活力進行驗證。測得DHFR的比活達5.8 μmol/(mg·min)，與文獻報道相符[31]。根據(jù)MIC的初步篩選結(jié)果，發(fā)現(xiàn)7a～7o系列化合物中有3種化合物(7a、7g和7k)具有較好的抑制活性(MIC≤1.0 mg/mL)，進一步考察這3種帶有哌嗪基-1-二硫代氨基甲酸酯側(cè)鏈的2,4-二氨基喹唑啉類化合物對大腸埃希菌DHFR的抑菌率和IC50。

首先對化合物7a、7g和7k純品進行HPCE，其遷移譜圖如圖3所示。然后，將化合物7a、7g和7k作為DHFR抑制劑分別加入DHFR酶反應體系中，通過對比加入前后電泳圖譜中DHF與THF的峰面積考察抑制效果。圖4以化合物7k為例，顯示了酶反應體系加入抑制劑7k前后的電泳遷移譜圖。

A: Compound 7g. B: Compound 7a. C: Compound 7k.

圖3化合物7g、7a、7k純品的HPCE遷移譜圖

Fig.3HPCE spectra of pure compounds 7g, 7a and 7k

化合物7a、7g和7k對DHFR的IC50見表2。抑制劑的抑制率用以下公式計算：

其中：R為抑制劑對DHFR的抑制率；A為對照組扣除空白后DHF與THF峰面積的差值；B為加入抑制劑扣除空白后DHF與THF峰面積的差值。將化合物7a、7g和7k的標準溶液稀釋為不同濃度，在酶反應體系中進行HPCE，以抑制率R對抑制劑濃度作標準曲線，從所得線性方程中可求得IC50。

表2化合物7a、7g、7k對DHFR的抑制效果(n=5)

Tab.2Inhibitory effects of compounds 7a, 7g and 7k (n=5)

InhibitorInhibitionequationr2IC50(mg/mL) 7ay=8.5054x+28.8330.99862.49×10-1 7gy=9.0833x+26.0420.99632.64×10-1 7ky=14.247x+42.9170.99674.97×10-2

x, inhibitor concentration;y, inhibition rate (%).

A: Before addition of compound 7k as DHFR inhibitor. B: After addition of compound 7k as DHFR inhibitor.

圖4DHFR酶反應體系的HPCE遷移譜圖

Fig.4HPCE spectra of DHFR reaction system

3討論

在分子對接理論預測中，為簡便起見，僅以SMX為陽性對照，因為在TMP-SMX中SMX是DHFR底物。計算結(jié)果顯示，15種有哌嗪二硫代甲酸酯側(cè)鏈的喹唑啉衍生物7a～7o與DHFR的結(jié)合能均優(yōu)于陽性對照，化合物7i和7l的結(jié)合能為-8.2，效果最佳；化合物7k的結(jié)合能為-8.0，僅次于化合物7i和7l。圖2以化合物7k為例顯示了底物與酶對接后的結(jié)合情況。需說明的是，計算過程涉及多個參數(shù)的選取，不能排除人為因素；且DHFR蛋白結(jié)構(gòu)為晶體X-衍射(X-ray)數(shù)據(jù)，不能完全反映在體內(nèi)體液環(huán)境中底物與酶的真實結(jié)合情況。因此，分子對接作為理論預測僅可作為參考，實際抑菌活性仍需通過實驗進行考察。

大腸埃希菌ST171為多重耐藥菌，對包括復方新諾明在內(nèi)的多種抗生素具有耐藥性，在本研究的MIC值測定中得以顯現(xiàn)。15種帶有哌嗪二硫代甲酸酯側(cè)鏈的喹唑啉衍生物7a～7o對大腸埃希菌ST171均具有抑菌作用，MIC為0.125～15.6 mg/mL。其中，化合物7k的MIC值最佳，達到0.125 mg/mL，表明其具有較明顯的抑菌活性，有望成為新型喹唑啉類抑菌藥物的先導化合物。這一結(jié)果還較好印證了以前的分子對接預測結(jié)果，具有一定的相關性。綜合分子對接預測與MIC值的測定結(jié)果，可對該系列化合物抑菌活性的構(gòu)效關系進行簡單探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哌嗪4位苯基上2位連有吸電子基團的化合物，如化合物7a和7f具有較強的活性；而哌嗪4位連有芐基的7k有非常好的抑菌活性，可能與底物與酶的結(jié)合臂長度(鍵長)及是否可在空間上靈活旋轉(zhuǎn)有關。

MIC檢測為在細菌細胞水平進行的抑菌活性篩選實驗，是基于化合物與細菌菌體之間的作用進行藥物篩選的方法，能反映藥物對細菌生長等過程的綜合作用，但不能反映藥物作用的具體途徑和靶點。因此，為證實該系列化合物通過抑制DHFR活性從而抑制細菌生長，選擇3種MIC值最佳的化合物(7a、7g和7k)在分子水平進一步考察對DHFR的抑制率和IC50。由于DHF不穩(wěn)定，在試劑存放過程中不可避免有一定量的DHF轉(zhuǎn)化為THF，為避免扣除空白等繁瑣的計算環(huán)節(jié)，以THF與DHF峰面積的差值來探討抑制效果，5次平行實驗的相對標準偏差為3.4%。由測定結(jié)果可知，化合物7a、7g和7k均可有效抑制DHFR的還原活性，3種化合物的IC50分別為2.49×10-1、2.64×10-1和4.97×10-2mg/mL。

綜上所述，本研究考察了一系列連有哌嗪二硫代甲酸酯側(cè)鏈的喹唑啉衍生物的抑菌活性。通過分子對接模擬及該系列15種化合物對多重耐藥大腸埃希菌MIC的檢測，發(fā)現(xiàn)理論預測值與實際MIC值在一定程度上吻合。初步篩選實驗結(jié)果表明，該系列所有化合物與陽性對照相比均具有較好的抑菌活性，其中化合物7a、7g和7k表現(xiàn)出較強的抑菌活性。進一步采用HPCE篩選模型對化合物7a、7g和7k進行分子水平抑菌實驗，分別測定這3種化合物的抑制率與IC50，結(jié)果顯示抑制效果均較好。這一研究結(jié)果有望為抑菌藥物的研究和開發(fā)提供活性更強、選擇性更佳的先導化合物。

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Antibacterial activity of piperazine-1-carbodithioate derivatives of 2,4-diaminoquinazoline

SHAN Keming1, LI Tianyi2, PU Ji2,3

1. Planning and Research Institute, China North Industries Group Corporation, Beijing 100053, China; 2. State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China; 3. Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Hangzhou 310003, China

Abstract:Antibacterial activity of fifteen piperazine-1-carbodithioate derivatives of 2,4-diaminoquinazoline was investigated in order to search for compounds with efficient antibacterial activity. First, the binding energies of substrate-enzyme were predicted by molecular docking calculation. Second, minimum inhibitory concentration (MIC) values of the tested compounds were measured against the multidrug-resistant Escherichia coli (E. coli) with a standard method. The results showed that some compounds had better antibacterial activity than the control, and MIC of compounds 7a, 7g and 7k was below 1 mg/mL. The results were further confirmed by high performance capillary electrophoresis (HPCE) screening method, and the half inhibitory concentration (IC50) of 7k was 4.97×10-2mg/mL. In addition, structure-activity relationship analysis showed that the presence of an electron-withdrawing group at the C2-position of phenyl ring linked with piperazine moiety was favorable to the antibacterial activity. This study provided a new option for the development of antimicrobial agents.

Key words:2,4-Diaminoquinazoline; Piperazine-1-carbodithioate; Antibacterial activity; Antifolate; Capillary electrophoresis

基金項目：國家自然科學基金(81471919)

通信作者：濮吉

Corresponding author. PU Ji, E-mail: puji@icdc.cn

(收稿日期：2016-02-24)