劉 宇， 董 平， 梁興國(guó)

(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 青島 266003)

胃蛋白酶的分離現(xiàn)狀及其活性研究進(jìn)展

劉 宇， 董 平， 梁興國(guó)

(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 青島 266003)

摘 要闡述了胃蛋白酶的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，總結(jié)了哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)胃蛋白酶的分離進(jìn)展，并比較分析了不同物種間胃蛋白酶的性質(zhì)和特點(diǎn)；同時(shí)對(duì)胃蛋白酶新發(fā)現(xiàn)的降解糖類(lèi)和核酸類(lèi)物質(zhì)的新活性進(jìn)行了總結(jié)分析。胃蛋白酶作為生物體內(nèi)重要的消化酶，其具有蛋白酶、糖酶和核酸酶活性，是一種“多功能酶”，將為胃蛋白酶進(jìn)一步研究以及應(yīng)用提供一定參考。

關(guān)鍵詞胃蛋白酶；酶系組成；新活性；多功能酶

胃蛋白酶是一種典型的天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶，活性位點(diǎn)由2個(gè)天冬氨酸組成，在體內(nèi)以酶原形式分泌，在pH值小于5.0時(shí)酶原自動(dòng)激活形成有活性的酶，在酸性條件下可降解多種蛋白質(zhì)。胃蛋白酶的專(zhuān)一性較強(qiáng)，能水解位于多肽鏈中由芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸)的氨基(-NH2)與酸性氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸)的羧基(-COOH)形成的酰胺鍵(-CO-NH-)[1]，如酪蛋白、球蛋白、組蛋白及角蛋白質(zhì)等。

由于胃蛋白酶是哺乳動(dòng)物胃腸道中重要的多肽水解酶，因此無(wú)論是在動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)方面，還是在醫(yī)藥方面皆有重要應(yīng)用，而胃蛋白酶眾多特性及豐富的酶系為其充分利用提供了重要的理論依據(jù)。胃蛋白酶的研究相對(duì)較為成熟，關(guān)于其研究的熱點(diǎn)多放在不同物種中胃蛋白酶的分離純化，以及作為工具酶來(lái)利用。本文總結(jié)了近年來(lái)胃蛋白酶的分離純化情況，并對(duì)其出現(xiàn)的新活性進(jìn)行了分析，以期為胃蛋白酶的研究注入新的活力，重新引起科研工作者的注意，為胃蛋白酶進(jìn)一步研究以及應(yīng)用提供參考。

1胃蛋白酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

胃蛋白酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)中酸性氨基酸含量高于堿性氨基酸。胃蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)由β折疊組成，含有2個(gè)構(gòu)象相似的結(jié)構(gòu)域，其氨基酸組成和高級(jí)結(jié)構(gòu)與其他天冬氨酸蛋白酶家族成員具有很高的同源性，不同物種胃蛋白酶氨基酸序列和結(jié)構(gòu)之間同樣高度保守[2]。胃蛋白酶在酸性環(huán)境下(pH 1.0～5.0)具有較高的活性，一般隨著pH值的升高而活性降低。不同來(lái)源的胃蛋白酶最適pH值及pH值穩(wěn)定性略有差異。胃蛋白酶一般在50℃以下較為穩(wěn)定，但隨著酶的來(lái)源不同而略有差異。

蛋白酶一般具有較廣泛的作用位點(diǎn)，然而胃蛋白酶是專(zhuān)一性較強(qiáng)的蛋白酶，具有一定的氨基酸序列選擇特異性，優(yōu)先斷裂由芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)或亮氨酸形成的肽鍵。當(dāng)pH值降至1.3時(shí)，這種序列選擇特異性表現(xiàn)得更明顯，胃蛋白酶僅傾向于剪切N端為亮氨酸或苯丙氨酸的肽鍵[3]。在體外胃蛋白酶持續(xù)作用可降解約30%蛋白分子的成肽鍵，形成脙、胨和一些氨基酸，但是角蛋白、黏蛋白和低相對(duì)分子量的蛋白衍生物不能被胃蛋白酶所分解[4]。胃蛋白酶作為一種關(guān)鍵的酸性蛋白酶，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域之中。在食品工業(yè)中，胃蛋白酶被廣泛應(yīng)用于啤酒、果汁的澄清、酸奶發(fā)酵[5]等，此外，胃蛋白酶還可以用于飼料添加劑[6]等方面；在醫(yī)藥領(lǐng)域，從動(dòng)物身上提取的胃蛋白酶可以與其他酶類(lèi)配合或單獨(dú)使用制成片劑，應(yīng)用在胃病病人的治療當(dāng)中，已經(jīng)是治療胃病較為成熟的藥品。

2胃蛋白酶的分離純化研究進(jìn)展

2.1胃蛋白酶的提取方法

目前，胃蛋白酶的提取方法主要有2種：酸法提取和堿法提取。其中酸法提取較為簡(jiǎn)便，可以直接得到成熟的胃蛋白酶，一般使用的是鹽酸、檸檬酸等酸性緩沖液[7]。通過(guò)pH 2.5的鹽酸，直接從組織中提取被激活了的胃蛋白酶。有研究提出利用超聲輔助酸法提取豬胃蛋白酶，收到了良好的效果，較傳統(tǒng)的堿法浸提時(shí)間縮短了15倍，比活力提高36.4%；較傳統(tǒng)酸法浸提時(shí)間縮短1.5 h，比活力提高70%[8]。但是由于酸法提取的為已激活后的胃蛋白酶，其穩(wěn)定性較低，提取純化的過(guò)程中的一些因素(如溫度、pH值、粗酶液中的其他物質(zhì)、微生物)都可能會(huì)導(dǎo)致酶活的降低，因此對(duì)純化過(guò)程的條件控制要求較高，如文獻(xiàn)報(bào)道的金線(xiàn)魚(yú)胃蛋白酶[7]和豬胃蛋白酶[9]皆采用酸法提取。

相對(duì)于酸法提取得到的是成熟的胃蛋白酶，堿法提取得到的是尚未被激活的胃蛋白酶原，提取過(guò)程中一般使用的是堿性磷酸鹽緩沖液，該法提取得到的胃蛋白酶原較為穩(wěn)定，對(duì)后續(xù)純化過(guò)程中的環(huán)境控制要求較低，但提取的時(shí)間長(zhǎng)，雜蛋白多，得到的酶量低。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大部分已知的胃蛋白酶采用的是堿法提取，如黃鰭鯛和鱖魚(yú)[10]等。采用堿法提取雖然時(shí)間長(zhǎng)，但提取得到的為胃蛋白酶原，有利于分析研究酶原的激活性質(zhì)，并且有利于長(zhǎng)期保存。

2.2胃蛋白酶的分離方法

胃蛋白酶的分離方法主要有3種：有機(jī)溶劑沉淀法、鹽析法和底物親和法。有機(jī)溶劑沉淀法分辨力比鹽析法好，溶劑易除去；缺點(diǎn)是易使酶變性，故操作時(shí)要求條件比鹽析嚴(yán)格。鹽析法根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的目的，其相對(duì)于有機(jī)溶劑法得到的胃酶活力得率高(70%)。胃蛋白酶在不同飽和度的硫酸銨條件下溶解度差異較大，由于胃蛋白酶一般在20%飽和硫酸銨時(shí)溶解度較高，60%飽和硫酸銨時(shí)溶解度較低，因此采用20%飽和硫酸銨去除雜質(zhì)，60%飽和硫酸銨沉淀濃縮胃蛋白酶，可以達(dá)到良好的分離純化目的[11]。鹽析法用鹽量較大，采用有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇等)結(jié)合鹽析法可減少鹽的用量[12]，但后續(xù)需要增加去除有機(jī)溶劑的程序，未除凈的有機(jī)溶劑會(huì)嚴(yán)重影響胃蛋白酶的活力，并且對(duì)后續(xù)的柱層析純化極為不利。底物親和法是利用胃蛋白酶與酪蛋白的親和特性和不同物質(zhì)之間的等電點(diǎn)差異，通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H值促使底物和酶的復(fù)合物沉淀及底物和酶的分離，與有機(jī)溶劑法、鹽析法比較，底物親和分離法具有簡(jiǎn)單高效的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有較高的特異性[13]。

此外，近年來(lái)一些新型分離純化方法逐漸被應(yīng)用于胃蛋白酶的分離純化。如雙水相萃取結(jié)合聚電解質(zhì)沉淀法[14]，利用該方法從牛胃組織勻漿中提取純化得到胃蛋白酶，純化倍數(shù)可達(dá)到9倍；聚乙二醇/硫酸銨萃取[15]以及膜分離技術(shù)[16]等。膜分離技術(shù)是典型的物理分離過(guò)程，不用化學(xué)試劑和添加劑，胃蛋白酶不會(huì)受到二次污染，且處理量可大可小，較為靈活，是近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛的分離技術(shù)。胃蛋白酶在物種間高度保守，分子質(zhì)量一般在30～40 ku之間，因此可應(yīng)用膜分離技術(shù)對(duì)其進(jìn)行選擇性分離，可達(dá)到初步純化的目的。

2.3胃蛋白酶的純化方法

上述分離方法僅是對(duì)胃蛋白酶的一個(gè)粗分離的過(guò)程，得到的胃蛋白酶仍含有其它雜蛋白和鹽離子，為了滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要，通常采用離子交換和凝膠過(guò)濾層析方法進(jìn)行進(jìn)一步純化。在實(shí)際應(yīng)用中，為得到純度較高的胃蛋白酶，通常采用離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析相結(jié)合的方法進(jìn)行純化。Sitthipong Nalinanon等在鰹魚(yú)胃蛋白酶的純化時(shí)先后采用DEAE-纖維素、Sephadex G-50和Sephadex G-75柱層析法，得到了2種鰹魚(yú)胃蛋白酶[17]。

目前蛋白質(zhì)的分離純化方法在胃蛋白酶的分離純化研究方法應(yīng)用較為成熟，其流程為：浸提-鹽析沉淀(可輔以膜分離方法)-離子交換層析與凝膠過(guò)濾層析配合使用純化胃蛋白酶或酶原。其中粗酶液一般采用鹽析沉淀法進(jìn)行粗分離，并輔以超濾膜分離去除大部分雜質(zhì)以及除鹽，且可達(dá)到濃縮的目的。此外，透析法也可有效除鹽，且使樣品均一的分散到其它緩沖液中，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)、樣品處理量小且樣品易損失；超濾法可借助加壓的方式有效縮短處理時(shí)間，達(dá)到除鹽和濃縮的目的，但使樣品更換緩沖液較為困難，除鹽和換液效率略低于透析法，因此在實(shí)際應(yīng)用中一般采用透析法除鹽、超濾法濃縮兩者有效結(jié)合的方法[8]。對(duì)胃蛋白酶濃縮除鹽后，一般采用DEAE陰離子交換柱與凝膠柱相結(jié)合的方法進(jìn)行進(jìn)一步的純化，可使胃蛋白酶的純度在95%以上。

目前一般的蛋白純化策略已很好地應(yīng)用到胃蛋白酶的分離純化中，方法也較為成熟。胃蛋白酶具有在強(qiáng)酸性環(huán)境下活性高的特點(diǎn)，同時(shí)胃蛋白酶是一種廣泛的蛋白酶，利用胃蛋白酶的這2種性質(zhì)，可有效去除雜蛋白，簡(jiǎn)化其純化過(guò)程，然而胃蛋白酶在酸性條件下穩(wěn)定性較差，酶得率較低[17]，因此胃蛋白酶在酸性條件下的穩(wěn)定性還有待提高。

2.4哺乳動(dòng)物及魚(yú)類(lèi)胃蛋白酶酶系的組成及性質(zhì)

哺乳動(dòng)物常見(jiàn)的胃蛋白酶主要有3種，分別為胃蛋白酶A、B和C(表1)。其中胃蛋白酶A由胃底腺體的主細(xì)胞分泌，豬胃蛋白酶D是未磷酸化的胃蛋白酶A[18]；胃蛋白酶B主要存在于豬和狗[19]胃腸道內(nèi)，又稱(chēng)副胃蛋白酶或明膠酶，對(duì)明膠的水解活性較高；胃蛋白酶C又稱(chēng)胃亞蛋白酶，是胃粘膜細(xì)胞分化成熟的終末產(chǎn)物[20, 21]，大鼠的胃蛋白酶主要為胃蛋白酶C，在人和豬胃中也存在胃蛋白酶C。3種胃蛋白酶中，胃蛋白酶A和C的基因調(diào)控機(jī)制不同，但蛋白編碼區(qū)所在基因結(jié)構(gòu)非常相似；胃蛋白酶B和C除了底物特異性比A較強(qiáng)外，其他性質(zhì)非常相似[22]。此外在胎兒和幼齡動(dòng)物中還發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶原F和凝乳蛋白酶原，在成熟以后逐漸被胃蛋白酶A代替[23]。

表1 哺乳動(dòng)物主要的胃蛋白酶

表2 魚(yú)類(lèi)胃蛋白酶的性質(zhì)

注：以七星鱸魚(yú)為例，七星鱸魚(yú)(3)代表七星鱸魚(yú)中分離得到3種胃蛋白酶；最適pH值、最適溫度、Km和kcat從左到右分別對(duì)應(yīng)七星鱸魚(yú)胃蛋白酶I、II和III

近年來(lái)，隨著海洋資源的開(kāi)發(fā)利用，從魚(yú)類(lèi)中提取胃蛋白酶的研究也在逐漸展開(kāi)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家已經(jīng)從多種魚(yú)類(lèi)中得到胃蛋白酶(表2)，并對(duì)其性質(zhì)和功能進(jìn)行分析研究。魚(yú)類(lèi)胃蛋白酶的分子質(zhì)量在30～39 ku之間不等，大部分集中在30～32 ku；最適pH值略高于哺乳動(dòng)物，在3.0左右。海洋資源豐富多樣，對(duì)海洋魚(yú)類(lèi)胃蛋白酶的開(kāi)發(fā)利用將是胃蛋白酶功能開(kāi)發(fā)利用的良好方向。

3胃蛋白酶新活性的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展

科研工作者對(duì)胃蛋白酶的研究關(guān)注已有80年之久，關(guān)于其作用機(jī)理、理化性質(zhì)等研究也較為透徹，因此科學(xué)家們對(duì)胃蛋白酶的關(guān)注多在于對(duì)不同物種胃蛋白酶的提取純化以及其在臨床診斷方面的應(yīng)用[36]。然而最近有研究指出豬胃蛋白酶具有降解糖類(lèi)物質(zhì)[37, 38]和核酸[39]的新活性，這在一定程度上來(lái)說(shuō)是對(duì)胃蛋白酶顛覆性的認(rèn)識(shí)，這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中，胃蛋白酶可能不僅僅是作為“蛋白酶”發(fā)揮功能，而是作為“多功能酶”對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮著重要作用。

圖2 胃蛋白酶降解糖類(lèi)活性中心預(yù)測(cè)[37]

圖3 胃蛋白酶對(duì)核酸的降解[36]

Shobha等[37]研究發(fā)現(xiàn)豬胃蛋白酶具有降解脫支瓜爾豆半乳甘露聚糖的功能，表明胃蛋白酶具有對(duì)糖苷類(lèi)底物的非特異性催化功能。該研究表明，胃蛋白酶降解脫支瓜爾豆半乳甘露聚糖的最適pH 5.5，最適溫度45℃，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生Km為5.0 mg/mL，豬胃蛋白酶作用于脫支瓜爾豆半乳甘露聚糖的活性中心與其降解蛋白的活性中心有所不同，其中Asp138可能對(duì)其催化水解糖類(lèi)有重要作用。該研究展示了一種由豬胃蛋白酶用不同的活性位點(diǎn)殘基進(jìn)行催化的一種新型的模式。

Liang等[39]所在研究團(tuán)隊(duì)近期發(fā)現(xiàn)豬胃蛋白酶具有降解核酸的活性。胃蛋白酶即可催化單鏈DNA的降解，也可催化雙鏈DNA的降解，同時(shí)也具有RNA降解活性；對(duì)單鏈底物具有一定的序列選擇性；降解產(chǎn)物為5′羥基，3′磷酸；其最適pH值為3.8，最適溫度為60℃，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km為55.6 μM，專(zhuān)一性常數(shù)kcat/Km為1.05×10-2s-1。該研究結(jié)果為胃蛋白酶在生物進(jìn)化中的作用提供了新的思路，為完善核酸的體內(nèi)消化代謝途徑提供理論支持，同時(shí)也為豐富完善胃蛋白酶的功能提供幫助。

4展望

綜上所述，胃蛋白酶作為一種蛋白消化酶，科學(xué)家長(zhǎng)期關(guān)注其組成結(jié)構(gòu)、降解蛋白的理化性質(zhì)以及提取純化方法，不斷有新的胃蛋白酶從新的物種中分離純化得到，豐富了胃蛋白酶家族酶系，為胃蛋白酶新活性的發(fā)現(xiàn)和胃蛋白酶的系統(tǒng)性研究提供幫助。然而隨著豬胃蛋白酶具有降解糖類(lèi)和核酸類(lèi)物質(zhì)的新功能的發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶作為一種“多功能酶”，關(guān)于其具有“多功能”的作用機(jī)理還有待深入研究，其活性和功能、在生物體內(nèi)的作用以及在進(jìn)化中的位置必將引起科學(xué)界的重新審視。

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The research progress in pepsin purification and enzymatic activity

LIU Yu, DONG Ping, LIANG Xing-guo

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

AbstractThe structure and properties of pepsin were summarized in this study. The enzyme system compositions of mammal and fish were concluded and the differences in these pepsins were presented. In addition, the newly founded activities of pepsin including digestion of guar galactomannan and nucleic acids were illustrated in details. As pepsin is the main digestive enzyme, the founding that pepsin is a "multifunctional enzyme". Based on the above, some suggestions were proposed for the future study and application of pepsins.

Key wordspepsin； enzyme system composition； new activities； multifunctional enzyme

收稿日期：2015-05-11；修回日期：2015-05-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31201327)；國(guó)家教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目；國(guó)家青年千人計(jì)劃(National Youth Qianren Plan)；山東省自然科學(xué)基金杰出青年基金(JQ201204)

作者簡(jiǎn)介：劉 宇，博士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)支持，E-mail: shishui87@163.com； 通信作者：梁興國(guó)，教授，研究方向?yàn)楹怂峄瘜W(xué)與生物技術(shù)，E-mail: liangxg@ouc.edu.cn。

中圖分類(lèi)號(hào)Q556

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)03-0075-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.075