蕭文慧　宋俊威　黃小玲　周玉萍　田長恩

【摘 要】本文首先以擬南芥IQM4基因為搜索對象，檢索了兩個生物信息數(shù)據(jù)庫，搜索到IQM4基因?qū)追N非生物脅迫均能產(chǎn)生應(yīng)答，并對IQM4基因表達(dá)量進(jìn)行了分析；然后參考數(shù)據(jù)庫所提供的實驗方法，采用半定量RT-RCR技術(shù)驗證了幾種非生物脅迫對IQM4基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明鹽和滲透脅迫均能抑制幼苗期IQM4基因表達(dá)，而脫水、低溫和機(jī)械損傷早期能增強(qiáng)IQM4基因表達(dá)水平。實驗初步證明擬南芥IQM4基因在植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】擬南芥；IQM4；非生物脅迫；基因表達(dá)

在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Ca2+作為動植物細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，通過Ca2+傳感蛋白及其靶蛋白來調(diào)節(jié)多種生化和細(xì)胞反應(yīng)。鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）是目前最重要的一類胞內(nèi)Ca2+信號受體。在眾多的CaMs中，除CaM7具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性外，其它均無任何酶活性，必需與其下游的靶蛋白—鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin-binding protein， CaMBP）來調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能[1]。

植物中有5個含IQ基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族：IQM、Myosin、CNGC、IQD和CAMTA，其中IQM家族由我們發(fā)現(xiàn)[2]。擬南芥IQM家族共有6個成員，均含1個IQ基序，N-端具有與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A的同源序列，C-端具有與天花粉素的同源序列。IQM1編碼1個Ca2+不依賴型的CaMBP，影響保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，在氣孔運(yùn)動中發(fā)揮重要作用，IQM1缺失抑制了光誘導(dǎo)的氣孔張開，iqm1突變體表現(xiàn)氣孔開度小和根較短的表型[3]；IQM1過表達(dá)株系則表現(xiàn)為氣孔開度大和根較長[4]。IQM4（編號為At2g26190）是IQM家族中與IQM1高度同源的成員[5]，其功能未見報道。為了研究IQM4的基因功能，本文以IQM4基因為搜索對象，檢索了兩個生物資源信息數(shù)據(jù)庫，搜索到IQM4基因?qū)追N非生物脅迫均能產(chǎn)生應(yīng)答；為了驗證生物信息數(shù)據(jù)庫中IQM4基因表達(dá)的數(shù)據(jù)，本文開展了鹽、甘露醇、脫水、低溫以及損傷處理對IQM4基因表達(dá)影響的分析，該研究結(jié)果為進(jìn)一步開展IQM4基因的功能研究提供重要理論依據(jù)。

1 實驗材料

實驗所用的擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia（Col）生態(tài)型。MS鹽購自Sigma公司，PrimeScript One Step RT-PCR Kit，RNAiso Plus購自TaKaRa公司，NaCl和Manntiol試劑購于上海生工。

2 實驗方法

2.1 擬南芥培養(yǎng)

土壤培養(yǎng)：將經(jīng)過4℃浸泡3d的吸漲種子直接點種于營養(yǎng)土表面，置于長日照培養(yǎng)室中培養(yǎng)（溫度為22±2℃，光周期為16h光照/8h黑暗，光照強(qiáng)度為100μmol·m-2·s-1，相對濕度為85%，下同）。

1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)：取經(jīng)過4℃浸泡3d的吸漲種子，用75%乙醇浸泡5～10s后棄乙醇，再加入0.1% HgCl2浸泡5min后棄HgCl2，用無菌水漂洗3～4次。最后加入適量的0.3% Agar溶液懸浮，接種到1/2MS培養(yǎng)基上，置于長日照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

2.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的檢索

以IQM4基因為搜索對象，檢索AtGenExpress Visualization Tool（http：//jsp.weigelworld.or）和Genevestigator Expression Data（https：//www.genevestigator.com），以基因表達(dá)改變量為1.5倍為閾值，篩選對IQM4基因表達(dá)影響較大的非生物因素作為后續(xù)實驗的依據(jù)。

2.3 非生物脅迫的處理

滲透脅迫處理：將1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長2周的幼苗小心拔出，需保持幼苗的根的完整性，稱取30～50mg幼苗為一個樣品，共稱取6個樣品；將樣品浸沒于300mmol/L甘露醇溶液中，分別在0.5、1、3、6、12和24h取樣。

鹽脅迫處理：稱取6個2周幼苗樣品，將樣品浸沒于150mmol/L氯化鈉溶液中，分別在0.5、1、3、6、12和24h取樣。

低溫處理：稱取3個2周幼苗樣品；將樣品置于4℃處理，分別在0.5、1和3h取樣。

脫水處理：稱取3個2周幼苗樣品；將樣品放在濾紙上，并置于長日照培養(yǎng)室中，分別在0.5、1和3h取樣。

損傷處理：先用帶有鋸齒的鑷子夾傷生長在培養(yǎng)基上的2周幼苗，然后置于長日照培養(yǎng)室中，分別在0.25和0.3h取樣。

2.4 IQM4基因的RT-PCR分析

參照RNAiso Plus說明書提取非生物脅迫處理的樣品總RNA。

以IQM4編碼序列的特異引物F1：5-AGTTAGCTC TTCAGCATTGGC-3′和R1：5-TCTTCTTGTTCCTCTGTAACG-3′進(jìn)行半定量RT-PCR，分析樣品中IQM4的表達(dá)水平。實驗以擬南芥β-ATPase基因設(shè)計了內(nèi)標(biāo)引物F2：5-CTGAATCAATCTCTTAAGCTG-3和R2：5-GTGCAGA AAGTTCTACAGAACTAC-3。RT-PCR采用PrimeScript One Step RT-PCR Kit，每個反應(yīng)以100 ng總RNA為模板，總反應(yīng)體積為20 μL，擴(kuò)增參數(shù)為①50℃ 30min，②94℃ 2min，③94℃ 30s，④54℃ 30s，⑤72℃ 40s，③④⑤ 31次循環(huán)，⑥72℃ 5min。反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

3 結(jié)果與分析

3.1 生物信息數(shù)據(jù)庫中IQM4基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析

本文以擬南芥IQM4為研究對象，檢索了兩個數(shù)據(jù)庫，搜索到大量IQM4基因表達(dá)的數(shù)據(jù)資料。表1是以IQM4表達(dá)量改變倍數(shù)在1.5倍以上為標(biāo)準(zhǔn)，整理了幼苗地上組織中IQM4基因表達(dá)受到鹽和滲透脅迫、低溫、脫水以及機(jī)械損傷等非生物脅迫因子影響的數(shù)據(jù)。從數(shù)據(jù)庫的資料（表1）來分析，鹽脅迫1h后明顯抑制了幼苗地上組織中IQM4基因表達(dá)；滲透脅迫在0.5～1h內(nèi)顯著增強(qiáng)了IQM4基因表達(dá)量，但3～24h內(nèi)基因表達(dá)變化不明顯；低溫脅迫0.5h內(nèi)IQM4基因表達(dá)量有所下調(diào)；脫水和機(jī)械損傷能迅速增強(qiáng)IQM4基因表達(dá)量。

3.2 幼苗中IQM4基因的RT-PCR分析

采用半定量RT-PCR技術(shù)分析幾種非生物脅迫對擬南芥幼苗中IQM4基因表達(dá)的影響。

從圖1A可以看出，與對照相比，鹽脅迫初期（0.5和1h），IQM4基因表達(dá)明顯上調(diào)，隨著鹽脅迫時間的增加（6和12h），IQM4表達(dá)量顯著降低，但24h后表達(dá)量恢復(fù)到對照水平。圖1B顯示，與對照相比較，滲透脅迫0.5～12h期間IQM4表達(dá)量逐漸降低，至24h時表達(dá)量有所增加，但仍低于對照水平。圖1C顯示脫水處理能增強(qiáng)幼苗中IQM4基因表達(dá)量。圖1D顯示低溫處理后，IQM4表達(dá)水平呈現(xiàn)先降低（0.5～1h）后升高（3h）趨勢，低溫處理3h后IQM4表達(dá)量明顯高于對照。圖1E顯示幼苗遭受機(jī)械損傷0.25h后，IQM4基因表達(dá)稍有增強(qiáng)，而0.5h后，IQM4基因的表達(dá)量急劇降低。從RT-PCR結(jié)果來看，不同脅迫因子對幼苗中IQM4基因表達(dá)水平產(chǎn)生了不同影響。

4 討論

已知擬南芥IQM家族在植物對光、生物和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7]。半定量RT-PCR結(jié)果驗證了生物信息數(shù)據(jù)庫的資料，結(jié)果表明擬南芥IQM4基因表達(dá)受到鹽和滲透脅迫、脫水、低溫和機(jī)械損傷等非生物脅迫因子的影響，初步證明IQM4基因在植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

實驗發(fā)現(xiàn)RT-PCR分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)有部分偏差，如鹽脅迫處理RT-PCR結(jié)果是脅迫0.5h和1h后IQM4基因表達(dá)明顯上調(diào)，而數(shù)據(jù)庫的資料則為脅迫1h后IQM4表達(dá)量顯著降低。RT-PCR結(jié)果顯示滲透脅迫明顯抑制IQM4表達(dá)，而數(shù)據(jù)庫的資料則為滲透脅迫0.5h和1h后顯著增強(qiáng)IQM4基因表達(dá)量。數(shù)據(jù)庫的資料顯示機(jī)械損傷明顯增強(qiáng)IQM4表達(dá)水平，但RT-PCR結(jié)果則是表達(dá)水平有所下降。我們推測RT-PCR結(jié)果與數(shù)據(jù)庫的資料出現(xiàn)偏差的原因可能是因為實驗材料的取樣部位不一致造成的，數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的取材為幼苗地上組織，而本實驗是以整株幼苗為實驗材料。

【參考文獻(xiàn)】

[1]韋慧彥，郭振清，崔素娟.鈣不依賴性鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007，34（2）：124-131.

[2]田長恩，周玉萍.植物具IQ基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報，2013，48（4）：447-460.

[3]Zhou YP， Duan J， Yamamoto KT， Tian CE. AtIQM1， a novel calmodulin-binding protein， is involved in stomatal movement in Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology， 2012， 79（5）： 333-346.

[4]周玉萍，陳瓊?cè)A，陳潔珊，程惠貞，田長恩.IQM1基因過量表達(dá)對擬南芥氣孔運(yùn)動及根系生長的影響[J]. 西北植物學(xué)報，2013，33（5）：904-910.

[5]Zhou YP， Chen YZ， Duan J，Yamamoto KT， Tian CE. Sequence and expression analysis of the Arabidopsis IQM family[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2010， 32（1）： 191-198.

[責(zé)任編輯：楊玉潔]