林+峰++黃承俊++宋+歡++孫守強++王幸栓++李+峰++梁景山++胡艷芳++侯發(fā)全++劉海軍

摘 要：為了提高奶牛體外受精效果，研究了體外成熟卵母細胞在IVF-100、BO和TALP三種體外受精液中的受精效果，同時比較了裸卵（NOs）與卵丘卵母細胞復(fù)合體（COCs）對受精效果的影響，卵巢的不同保存溫度對卵母細胞受精效果的影響。結(jié)果顯示，體外成熟卵母細胞在受精液IVF-100中的卵裂率顯著高于BO液的（P<0.05），而TALP液中的卵裂率與IVF-100和BO液的差異都不顯著（P>0.05）；裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母細胞復(fù)合體（COCs），但差異不顯著（P>0.05）；NOs的囊胚率極顯著低于COCs的（P<0.01）；卵巢在10和37 ℃下保存2～3 h，卵母細胞卵裂率和囊胚率差異均不顯著（P>0.05）。

關(guān)鍵詞：奶牛；卵母細胞；卵裂率；囊胚率

中圖分類號：S858.23 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.07.007

Agricultural University ， Zhengzhou， Henan 450002 ， China； 3. No. 11 Farm， Tianjin Jialihe Husbandry Corporation， Tianjin 300273 ， China； 4.Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University， Shanghai 201508， China； 5.Xiaying Animal Sciences and Veterinary Medicine Station of Jixian County， Tianjin 300193， China； 6.Animal Health Supervision and Inspection Institute of Jixian County， Tianjin 301900， China）

Abstract： In order to improve the effect of fertilization in vitro of cows， this study compared the effect of fertilization among the IVF-100， BO and TALP solution. Meanwhile， this test compared the effect of fertilization between NOs and COCs，and the trail explored the difference of effect of fertilization on different temperature for ovaries. The results showed that the rate of cleavages of the oocytes in IVF-100 was significantly higher than that in BO （P<0.05），while the oocytes rate of cleavages of TALP solution had no significant differences with that in IVF-100 and BO （P>0.05）.The rate of cleavages of NOs was lower than that of COCs， while there was no significant difference （P>0.05），but the NOs rate of blastocyst was extreme significantly lower than that of COCs （P<0.01）. Also， there was no significant difference between the rate of cleavages and the rate of blastocyst when the ovaries stored in 10 and 37 ℃ for 2～3 hours （P>0.05）.

Key words： cows； oocytes； cleavage rate； blastocyst rate

隨著配子與胚胎生物技術(shù)的研究與應(yīng)用，對胚胎的需求量越來越大。超數(shù)排卵和胚胎移植的合理化應(yīng)用雖能成倍提高優(yōu)良母畜的繁殖率，但所獲得的胚胎數(shù)量有限。為了解決這個問題，近年來國內(nèi)外對奶牛卵母細胞體外受精技術(shù)進行了大量的研究。保國俊、Ginther等[1-2]通過IVF技術(shù)可提供數(shù)量更多、成本更低的胚胎，體外受精技術(shù)是對優(yōu)良公、母畜的綜合充分利用。近年來，牛體外受精技術(shù) （In vitro fertilifation， IVF）取得了較大進展，已成為可在實驗室條件下生產(chǎn)大量廉價胚胎的實用技術(shù)，將為胚胎移植提供重要的胚胎來源。牛體外受精技術(shù)一直是研究的熱點。但由于體外受精技術(shù)操作環(huán)節(jié)復(fù)雜，操作過程涉及因素較多以及卵母細胞對體外生存環(huán)境要求較高，使得試驗體系不穩(wěn)定，進而影響試驗結(jié)果的準確性[3]。

本試驗通過對比不同受精液對卵母細胞體外受精效果影響的研究，分析了不同形態(tài)的卵子和卵巢運輸保存溫度對奶牛成熟卵母細胞體外受精能力的影響，皆在為優(yōu)化奶牛體外受精技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

試驗中所用的化學(xué)試劑除特別說明外，均購自Sigma公司。

1.1 卵巢的采集與保存

奶牛卵巢采集自河北省大廠個體屠宰場。屠宰后立即采集卵巢并除去多余的脂肪組織，然后用加有雙抗的生理鹽水沖洗5～6次，保存在盛有10或37 ℃、加有雙抗的滅菌生理鹽水中，于2～3 h內(nèi)帶回實驗室。

1.2 卵母細胞的采集

用無菌紗布將卵巢表面擦干，抽吸法吸取直徑2～8 mm的卵泡，抽吸液注入培養(yǎng)皿中，根據(jù)試驗不同的需求挑選裸卵及具有一層以上完整卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復(fù)合體（Cumulus oocyte complexes，COCs）用于試驗。

采卵液：TCM-199（Gibco）+5%胎牛血清（FBS，Gibco）+30 g·mL-1肝素鈉+4.766 g·L-1 Hepes。

1.3 體外成熟培養(yǎng)

將收集的卵母細胞用成熟液洗3遍，然后每40～60個移入平衡至少2 h的1 mL成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空氣、38.5 ℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23～24 h，以排出第一極體為卵母細胞成熟的標志。

成熟液：TCM-199+10%FBS+10 g·mL-1 FSH（寧波三生）+20 g·mL-1 LH（寧波三生）+1 g·mL-1 E2。

1.4 體外受精

受精液為IVF-100（Research Institute for the Functional Peptides， Yamagata， Japan）或BO液時運用直接離心法對精子進行洗滌，即用6 mL洗精液稀釋解凍的精液并于2 000 r·min-1下離心7 min，棄去上清液，重復(fù)1次后用受精液稀釋精子，密度為1×106～6×106 個·mL-1，然后放入CO2培養(yǎng)箱中備用。受精液為TALP液時則用上浮法對精子進行30～60 min的孵化，然后再離心洗滌。將23～24 h成熟的卵母細胞于受精液中洗3遍，并用1 mL移液管將卵丘細胞部分去除。每10枚左右卵子移入平衡2 h的覆有石蠟油的50 L受精微滴中，加入50 L精液后于CO2培養(yǎng)箱中進行受精。IVF-100受精時間為6 h，BO液受精時間為8 h，TALP液受精時間為18 h.

1.5 胚胎的體外培養(yǎng)

胚胎培養(yǎng)液為CR1aa。將經(jīng)體外受精的假定受精卵用胚胎培養(yǎng)液洗3遍，并用1 mL移液管部分或全部去除周圍的卵丘細胞。以10枚假定受精卵/100 L微滴的方法，將假定受精卵隨機平等地移入平衡至少2 h的微滴中進行體外培養(yǎng)。從體外受精開始算起，第48小時對各組卵裂率進行觀察與記錄，第7～9天對各組囊胚率進行觀察與記錄，中途不進行換液。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的整理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同受精液對卵裂的影響

將經(jīng)體外成熟的卵母細胞隨機平等地移入3種不同的受精微滴中進行受精，即TVF-100、BO液和TALP液。受精后進行胚胎的體外培養(yǎng)，從受精開始算起第48 小時對各組的卵裂情況進行統(tǒng)計分析。從表1可以看出，用IVF-100作為受精液，其體外受精48 h后的卵裂率顯著高于BO液的（P<0.05）卵裂率，而以TALP液作為受精液其卵裂率與其他組并無差異。說明不同的受精液對卵裂有顯著的影響，從卵母細胞卵裂率來看，IVF-100作為受精液顯著優(yōu)于BO液和TALP2種受精液。

2.2 有無卵丘細胞對卵母細胞受精及受精后體外發(fā)育的影響

選取成熟的裸卵（NOs）和成熟的卵丘卵母細胞（COCs）進行體外受精，用IVF-100受精液稀釋精子，受精后進行胚胎的體外培養(yǎng)，從受精開始算起第48 小時對各組的卵裂情況進行統(tǒng)計分析。從表2可以看出，雖然自然裸卵卵裂率低于COCs，但結(jié)果檢驗并不顯著，而其囊胚率顯著低于COCs的。這表明，卵丘細胞對卵母細胞受精后體外發(fā)育的影響要遠高于對卵母細胞受精的影響。

2.3 卵巢的不同保存溫度對卵母細胞體外受精的影響

卵巢采集后，分別將卵巢放入10和37 ℃的加有雙抗的滅菌生理鹽水中2～3 h運回實驗室，抽取卵泡中的卵母細胞進行體外成熟培養(yǎng)，用IVF-100受精液稀釋精子，受精后進行胚胎的體外培養(yǎng)，從受精開始算起第48 小時對各組的卵裂情況進行統(tǒng)計分析。從表3可以看出，在10和37 ℃條件下保存卵巢其卵裂率和囊胚率均無顯著差異。

3 討 論

3.1 不同受精液對奶牛卵母細胞體外受精的影響

試驗結(jié)果顯示，IVF-100作為受精液時的卵裂率顯著高于BO液的，雖然在數(shù)值上表現(xiàn)出高于TALP液的趨勢，但統(tǒng)計檢驗無差異。同時，TALP液與BO液的卵裂率也無明顯差異，結(jié)果表明不同受精液對試驗結(jié)果有著較大的影響。

IVF-100為商品化的受精液，基礎(chǔ)液為BO液，其效果穩(wěn)定而且效率較高，對于成熟良好的卵母細胞，受精率一般高達80%～90%。由于其價格較高，常用于活體取得的卵子體外受精上或其他精密試驗中。筆者的試驗結(jié)果顯示，IVF-100的卵裂率明顯高于BO液的，這在許多實驗中均得到了證實。一般情況下，BO液的受精率在40%～70%，但有時也能夠在一些單獨的實驗中看到BO液的高效卵裂結(jié)果。這表明，IVF-100在促進受精卵的卵裂上要強于BO液，同時，也說明BO液作為體外受精液還存在巨大的改進空間。BO液對精子的作用比較強烈，因而與精卵共孵化的時間不能過長。相比之下，TALP液對精子的作用就比較溫和些，與本試驗結(jié)果相同，許多實驗顯示其雖然在數(shù)值上有高于BO液的趨勢但統(tǒng)計結(jié)果無差異[4]。而且，一些實驗結(jié)果表明其稍后的胚胎發(fā)育效果要低于BO液的[5]，由于這方面受受精時間、卵丘細胞、精子的洗滌等許多因素的制約，其機制仍有待探索。也有人對TALP液與IVF-100的卵裂效果進行了比較，其結(jié)果有與本試驗相同的，也有不同的。就總體而言，成熟良好的卵母細胞不管用什么受精液其受精卵的卵裂率都較高，但IVF-100對受精卵卵裂的促進作用要強于其他受精液。IVP技術(shù)作為一個整體其各個環(huán)節(jié)精密相關(guān)，因而要想得到較多的可移植胚，一個相對較好的受精環(huán)節(jié)是必須的。

3.2 有無卵丘細胞對卵母細胞體外受精效果的影響

自然裸卵與COCs經(jīng)體外成熟后，對其體外受精的卵裂率及囊胚發(fā)育率進行比較，結(jié)果顯示自然裸卵的卵裂率顯著低于COCs的，并且囊胚發(fā)育率達到了極顯著水平。但筆者的試驗結(jié)果表明自然裸卵是能夠發(fā)育到囊胚的，這與許多實驗結(jié)果相違背[6]。筆者的結(jié)果并不排除個別特殊卵母細胞的存在，但其原因仍有待進一步探索。研究表明，卵母細胞成熟過程中的許多機制都需要通過卵丘細胞來完成，自然裸卵經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后雖然能夠部分排出第一極體，但沒有繼續(xù)發(fā)育的潛力[7]，受精后并不能發(fā)育到囊胚階段。有人對卵丘細胞旁分泌進行分析，發(fā)現(xiàn)目前已經(jīng)確認的卵丘細胞分泌物主要有類固醇、透明質(zhì)酸和還原型谷胱甘肽，而這些物質(zhì)主要對受精和胚胎發(fā)育過程具有重要的促進作用[8-9]。筆者以前的研究表明，添加離散卵丘細胞能夠促進機械裸卵的體外成熟[10]。

3.3 卵巢的不同保存溫度對卵母細胞體外受精的影響

目前，奶牛卵巢卵母細胞的體外成熟和體外受精仍有許多問題需要解決，其中一個重要問題就是卵巢從屠宰場運回到實驗室這段時間內(nèi)，采用何種運輸溫度更有利于卵母細胞的發(fā)育。如果卵巢保存的好，卵泡內(nèi)的卵母細胞就會有較強的生命力和活性，從而有利于體外成熟和體外受精。

到目前為止，大多數(shù)試驗仍采用接近于生理溫度（36±2） ℃為運輸溫度[11-12]。 本試驗的結(jié)果表明，在10和37 ℃的生理鹽水下保存牛卵巢，對卵母細胞的體外受精并沒有顯著影響。大量的研究結(jié)果表明，卵巢不同保存溫度對奶牛卵母細胞的體外受精有很大影響，F(xiàn)irst等[13] 報道，當卵巢的貯存溫度低于30 ℃時，會對卵母細胞的成熟和隨后的胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利的影響。邢鳳英等[14]也報道，分別在22.0，30.0，37.0，38.5，40.0 ℃下保存卵巢，隨著溫度的升高，其卵母細胞體外成熟后的質(zhì)量、激活后的卵裂率和囊胚率均明顯下降。當達到40.0 ℃時，成熟培養(yǎng)后卵子的死亡率明顯增加，激活后卵裂的形態(tài)異常率明顯增加，細胞質(zhì)不均勻，碎裂率升高，不能發(fā)育到囊胚，認為37 ℃的生理鹽水保存豬卵巢效果最佳。但本研究表明，奶牛卵巢在10和37 ℃放置2～3 h其卵裂率和囊胚率不受明顯影響。從常理上講，應(yīng)該是保存溫度降低得越少越好，但有時結(jié)果并不是這樣，其原因可能是奶牛接近排卵時卵泡內(nèi)溫度低于卵巢基質(zhì)溫度[15]。采用與奶牛卵母細胞體外成熟溫度一樣溫度的生理鹽水收集卵巢，對其卵巢內(nèi)卵泡卵母細胞有不良影響。當采用和體外培養(yǎng)相同或更高溫度的生理鹽水保存卵巢時，卵子受到熱應(yīng)激[14]而影響其成熟后的質(zhì)量。因此，在實際生產(chǎn)中，不用刻意地控制卵巢的保存溫度。

4 結(jié) 論

（1）體外成熟卵母細胞在受精液IVF-100中的受精效果卵裂率優(yōu)于BO液與TALP液。

（2）裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母細胞復(fù)合體（COCs），但差異不顯著；NOs能夠發(fā)育到囊胚階段，但囊胚率極顯著低于COCs的。

（3）卵巢在10和37 ℃溫度下保存2～3 h，卵裂率和囊胚率差異不顯著。

參考文獻：

[1] 保國俊. 牛卵母細胞體外受精和培養(yǎng)技農(nóng)[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2010，29（1）：34-36.

[2] G1NTHER O J，KASTELIC J P，KNOP F L，et al.Composition and characteristics of follicular waves during the bovine estrous cyele[J].Anim Reprod Sci，1989，20（3）：187-200.

[3] 劉新峰，郝志明，史遠剛，等.不同培養(yǎng)體系對牛卵母細胞體外受精的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（2）：1049-1050.

[4] 馬學(xué)海. 牛體外成熟卵母細胞與性控精子體外受精的研究[D]. 石河子：石河子大學(xué)， 2007.

[5] 穆春雨. 影響牛體外受精若干因素的研究及性控精液體外受精初探[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2007.

[6] 錢云， 劉紅林. 卵母細胞成熟的形態(tài)學(xué)特征及其調(diào)控[J]. 國外畜牧科技， 1999， 26（6）： 26-30.

[7] 李榮鳳，薛曉先，劉哲.牛卵母細胞皮層顆粒熒光染色法成熟鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2000，31（3）：203-210.

[8] 錢 易，孟 艷，崔毓桂，等.卵丘細胞在卵母細胞發(fā)育過程中的作用[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志， 2013， 22（5）： 375-378.

[9] 趙學(xué)明，杜衛(wèi)華，郝海生，等.卵丘細胞在牛卵母細胞體外受精生產(chǎn)胚胎中的作用[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2011，19（2）：375-380.

[10]黃承俊，郭林林，孫守強，等. 卵丘細胞對牛卵母細胞體外成熟的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報，2014， 29（4）：111-115.

[11]YANG N，LU K，GORDON I.In vitro fertilization and culture of bovine oocytes from stored ovaries [J]. Theriogenology 1990，33：352.

[12]EINDA B L，CHOI Y H，CHARLES C I ，el a1.Effect of ovary storage and oocyte transport method on maturation rate of horse oocytes[J].Theriogenology，2003，59：765-774.

[13]FIRST N L，PARRISH J J.In-vitro fertilization of ruminants[J]. Reprod Fertil，1987，34（9）：151-165.

[14]邢鳳英.吳中紅，曾申明，等.豬卵母細胞體外成熟和孤雌激活效率影響因素分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（1）：125-129.

[15] HUNTER M H F，GRONDAHL C，SCHMIDT M， et al.Graafian follicles are cooler than ovarian stroma [J].Journal of Reproduction Fertility，1995，16：8-9.