曹強強，殷小成，肖　亮，肖正香

(1.南華大學附屬第一醫(yī)院兒科，湖南 衡陽 421001；2.湘潭市中心醫(yī)院兒科，湖南 湘潭 411100)

沉默UVRAG對白血病K562/ADM細胞自噬及耐藥性的影響

曹強強1，殷小成1，肖亮1，肖正香2

(1.南華大學附屬第一醫(yī)院兒科，湖南 衡陽 421001；2.湘潭市中心醫(yī)院兒科，湖南 湘潭 411100)

[摘要]目的探討沉默紫外線抵抗相關(guān)基因(UVRAG)對人白血病K562/ADM細胞自噬及耐藥性的影響。方法Western Blotting檢測UVRAG蛋白在K562及K562/ADM細胞中表達差異。特異性干擾UVRAG基因的UVRAG siRNA及Scramble siRNA在LipofectamineTM2000介導下轉(zhuǎn)染K562/ADM細胞，CCK-8法、MDC熒光染色及Western Blotting分別檢測UVRAG siRNA轉(zhuǎn)染前后K562/ADM細胞耐藥性、自噬水平以及P-糖蛋白(P-gp)表達的變化。結(jié)果Western Blotting檢測顯示K562/ADM細胞中UVRAG蛋白表達明顯高于K562細胞(P<0.05)；與K562/ADM組及Scramble siRNA轉(zhuǎn)染組相比，UVRAG siRNA轉(zhuǎn)染組UVRAG蛋白表達顯著下降(P<0.05)，以48 h效果最佳，提示UVRAG siRNA能高效沉默K562/ADM細胞UVRAG；CCK-8法顯示與K562/ADM組及Scramble siRNA轉(zhuǎn)染組相比，UVRAGsiRNA組對阿霉素敏感性顯著增高，IC50值明顯下降(P<0.05)；MDC染色熒光顯微鏡觀察到UVRAG siRNA轉(zhuǎn)染后K562/ADM細胞胞漿中自噬泡明顯減少；Western Blotting顯示K562/ADM細胞中Beclin-1、P-gp表達及P62降解明顯高于K562細胞，與K562/ADM細胞及Scramble siRNA轉(zhuǎn)染組相比，UVRAG siRNA轉(zhuǎn)染組Beclin-1、P-gp表達及P62降解顯著降低(P均<0.05)。結(jié)論UVRAG蛋白在K562/ADM細胞中高表達，與白血病MDR密切相關(guān)；UVRAG siRNA下調(diào)UVRAG表達可降低K562/ADM細胞耐藥性，其機制可能與降低自噬水平及下調(diào)P-gp表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]紫外線抵抗相關(guān)基因；K562/ADM細胞；自噬；耐藥性

多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)是影響白血病治療效果的重要耐藥形式，P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)等表達可賦予腫瘤細胞耐藥表型形成[1]。自噬是真核細胞利用溶酶體降解細胞漿內(nèi)受損的細胞器和大分子物質(zhì)的生物學過程，細胞自噬與腫瘤治療關(guān)系密切，參與腫瘤細胞化療敏感性的調(diào)控，已成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個熱點[2-3]。本課題組前期研究[4]報道外線抵抗相關(guān)基因(UV radiation resistance-associated gene, UVRAG)參與自噬通路形成，且UVRAG可抑制Bax線粒體轉(zhuǎn)位而抑制凋亡發(fā)生。目前細胞自噬與白血病化療耐藥的研究逐漸增多，但UVRAG是否參與白血病細胞MDR形成及其可能機制研究尚未見報道。本研究擬通過UVRAG siRNA轉(zhuǎn)染人白血病K562/ADM細胞，檢測K562/ADM細胞耐藥性、自噬相關(guān)蛋白及P-gp表達變化，初步探討UVRAG參與白血病MDR形成的可能機制，為深入研究細胞自噬與白血病MDR關(guān)系提供新的實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑胎牛血清購自杭州四季青生物公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；阿霉素(ADM)購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；單丹磺酰戊二胺(MDC)購自Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑購自Invitrogen公司；siRNA購自吉瑪生物公司；UVRAG、Bec1in-1、P-gp、P62抗體購自Abcam公司；β-actin抗體購自北京博奧森生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)K562細胞由實驗組成員提供；K562/ADM細胞購自天津血液研究所。K562、K562/ADM細胞生長于含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADM細胞按照LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染細胞。收集對數(shù)生長期K562/ADM細胞，用含胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細胞，接種于6孔板中，將稀釋的siRNA和Lipofectamin試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20 min，再加于適量細胞懸浮液中，達到100 pmol siRNA/2 mL細胞培養(yǎng)基，6孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h后，收集細胞進行其他檢測步驟。

1.2.3實驗分組實驗設(shè)為K562細胞組、K562/ADM細胞組、UVRAG siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADM細胞24 h組(si-UVRAG-K562/ADM,24 h組)、UVRAGsiRNA轉(zhuǎn)染K562/ADM細胞48 h組(si-UVRAG-K562/ADM,48 h組)、Scramble siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADM細胞陰性對照組(NC-K562/ADM組)。

1.2.4Western Blotting檢測各組細胞UVRAG、P-gp、Beclin-1、P62蛋白表達收集各組細胞，800 r·min-1離心5 min，棄上清，每管加入含PMSF細胞裂解液置于搖床上冰中裂解30 min，于4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min，取上清；BCA蛋白定量法進行定量；蛋白質(zhì)變性；SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，抗體孵育、顯影、灰度值分析。

1.2.5CCK-8法檢測K562、K562/ADM細胞藥物敏感性根據(jù)CCK-8試劑盒說明書，收集各組細胞，調(diào)整細胞數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)置空白組、對照組及實驗組，實驗組每孔加入100 μL細胞懸液及10 μL含不同濃度ADM培養(yǎng)基，設(shè)置3個復孔，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑后繼續(xù)孵育3 h，酶標儀測定450 nm處各組OD值。計算細胞存活率，細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%，GraphPad Prism 5計算各組細胞IC50值。

1.2.6MDC染色熒光顯微鏡觀察自噬泡收集UVRAGsiRNA轉(zhuǎn)染后si-UVRAG-K562/ADM細胞及K562、K562/ADM細胞，PBS液洗滌后加入1 mL 0.05 mmol·L-1的MDC染液，37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱孵育15 min后，再用PBS洗滌1次，800 r·min-1離心5 min，以少量PBS液重懸細胞后涂于載玻片上，蓋片封片后在熒光顯微鏡下加356 nm發(fā)射濾片和545 nm斷濾片進行觀察和攝片[5]。

2結(jié)果

2.1UVRAG蛋白在K562細胞及耐藥株K562/ADM中表達情況K562/ADM細胞是一種人慢性髓原白血病阿霉素耐藥細胞株，Western Blotting顯示，與K562細胞UVRAG蛋白相對表達量(0.61±0.05)相比，K562/ADM細胞中UVRAG蛋白相對表達量(1.15±0.06)顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示UVRAG高表達可能參與K562/ADM細胞MDR形成。見圖1。

圖1　Western Blotting檢測UVRAG蛋白表達情況

2.2siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADM細胞對UVRAG蛋白表達的影響siRNA轉(zhuǎn)染至K562/ADM細胞24 h、48 h后，Western Blotting顯示，K562/ADM組UVRAG蛋白相對表達量為1.17±0.06，NC-K562/ADM組為1.21±0.03，兩者表達差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，與K562/ADM組及NC-K562/ADM組比較，UVRAGsiRNA轉(zhuǎn)染K562/ADM細胞24 h, UVRAG蛋白相對表達量為0.59±0.03，48 h為0.44±0.02，均顯著降低，且以48 h效果最佳，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖2。

2.3抑制UVRAG表達對K562/ADM細胞藥敏性的影響CCK-8法檢測顯示ADM可以導致K562及K562/ADM細胞存活率下降，K562組[IC50值為(0.05±0.00)μg·mL-1]對ADM藥敏性顯著高于K562/ADM組[IC50值為(4.67±0.25) μg·mL-1]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；K562/ADM組和NC-K562/ADM組[IC50值為(4.61±0.30) μg·mL-1]對ADM藥敏性相似；與K562/ADM及NC-K562/ADM組比較，si-UVRAG-K562/ADM組對ADM的藥敏性顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且其IC50值從UVRAG siRNA轉(zhuǎn)染前的(4.67±0.25)μg·mL-1下降至(2.06±0.24)μg·mL-1，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這表明抑制UVRAG表達可降低K562/ADM耐藥性。見圖3。

圖2　Western Blotting檢測各組細胞UVRAG蛋白表達

A:K562組; B:K562/ADM組; C: NC-K562/ADM組; D: si-UVRAG-K562/ADM,24 h組；E: si-UVRAG-K562/ADM,48 h組

圖3　抑制UVRAG表達對K562/ADM細胞藥物敏感性的影響

轉(zhuǎn)染UVRAGsiRNA或Srcamble siRNA48 h后，不同濃度ADM作用于K562組、K562/ADM組、NC-K562/ADM組、si-UVRAG-K562/ADM組細胞48 h，CCK-8法檢測各組細胞活性率，設(shè)置對照組活性100%。

2.4抑制UVRAG表達對K562/ADM細胞自噬泡的影響普通顯微鏡下K562/ADM細胞作為典型的白血病耐藥細胞，其增殖具有一定抱團性，UVRAG siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADM細胞前后細胞形態(tài)無明顯變化；MDC染色后熒光顯微鏡下觀察到與K562組比較，K562/ADM組被MDC染上的細胞數(shù)明顯較多，且每個細胞中自噬泡的數(shù)量亦較多；與K562/ADM組比較，si-UVRAG-K562/ADM組僅見到很少量被MDC染上的細胞，且每個細胞中含的自噬泡數(shù)量很少，形從態(tài)學上提示K562/ADM具有較高自噬水平，抑制UVRAG表達能可能下調(diào)K562/ADM細胞自噬水平。見圖4、5。

圖4　光鏡下觀察各組細胞形態(tài)學

圖5　MDC染色熒光顯微鏡觀察細胞自噬泡

2.5抑制UVRAG表達對K562/ADM細胞Beclin-1、P62、P-gp蛋白表達的影響Western Blotting顯示：K562/ADM組自噬標志蛋白Beclin-1、多藥耐藥蛋白P-gp表達及自噬底物蛋白P62降解顯著高于K562組，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；與K562/ADM組及NC-K562/ADM組細胞比較，si-UVRAG-K562/ADM組細胞Beclin-1、P-gp表達及P62降解顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，K562/ADM組與NC-K562/ADM組細胞比較，兩者Beclin-1、P-gp蛋白表達及P62降解差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這些提示了K562/ADM細胞具有較高自噬水平及P-gp高表達，抑制UVRAG表達可降低自噬水平及下調(diào)P-gp表達。見圖6。

圖6　Western Blotting檢測各組細胞Beclin-1、P62、P-gp蛋白表達

3討論

白血病細胞MDR機制涉及膜蛋白介導的藥物外排機制、藥物作用靶點改變、凋亡受抑及自噬上調(diào)等各個方面[6-13]。K562/ADM細胞是具有MDR1/P-gp高表達屬性的人白血病耐藥細胞，是MDR機制研究的典型細胞模型[7]。

UVRAG最初是在對著色性干皮病細胞紫外線照射敏感性的基因篩查中發(fā)現(xiàn)的，是一個與自噬相關(guān)的腫瘤抑制基因，并且在紫外線照射導致DNA損傷修復中扮演著不可缺如的角色[8]。本研究發(fā)現(xiàn)UVRAG表達水平與白血病MDR有關(guān)。首先，本研究檢測了K562及K562/ADM細胞中UVRAG蛋白表達水平，結(jié)果顯示UVRAG在白血病K562/ADM耐藥細胞中高表達，提示UVRAG可能參與了白血病MDR發(fā)生。隨后采用UVRAG siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADM細胞，通過Western Blotting從蛋白表達層面檢測UVRAG siRNA介導的RNA干擾能高效抑制UVRAG表達，本課題組前期通過實時熒光定量PCR從mRNA層面檢測UVRAG siRNA能抑制K562細胞UVRAG mRNA表達水平[9]，這說明了UVRAG siRNA能成功沉默UVRAG基因，繼而發(fā)現(xiàn)抑制UVRAG表達可增加K562/ADM細胞對ADM的藥敏性，顯著降低K562/ADM細胞耐藥性。上述結(jié)果表明UVRAG蛋白在K562/ADM細胞中高表達，與白血病MDR密切相關(guān)。

UVRAG如何參與白血病K562/ADM細胞MDR形成，本研究通過2個方面去探討UVRAG參與MDR可能機制：1)Wang等[10]報道P-gp介導的MDR在腫瘤化療抵抗中的發(fā)揮著關(guān)鍵作用, 抑制PI3K/Akt信號途徑可逆轉(zhuǎn)K562/ADM細胞P-gp介導的MDR。P-gp介導的藥物外排機制是腫瘤細胞MDR一種經(jīng)典機制，也是研究時間最長、最廣泛的耐藥機制。P-gp是由多藥耐藥基因1(MDR1)編碼的跨膜耐藥蛋白，是一種能量依賴型非特異性外排泵，可主動將藥物從細胞內(nèi)泵出細胞外，降低抗腫瘤藥物在細胞內(nèi)聚集，從而使藥物的抗腫瘤效應(yīng)減弱甚至消失，已證實是一種廣泛存在的腫瘤細胞的耐藥機制，其過表達將導致腫瘤細胞產(chǎn)生MDR，抑制P-gp往往能有效的逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞MDR[11]。本研究發(fā)現(xiàn)K562/ADM細胞P-gp表達顯著多于K562細胞，抑制K562/ADM細胞UVRAG表達可下調(diào)P-gp表達，提示UVRAG參與MDR形成一個可能機制是通過影響P-gp表達來發(fā)揮作用；2)大多數(shù)相關(guān)研究已表明，自噬可促進細胞清除受損的大分子和線粒體等結(jié)構(gòu)，阻斷凋亡信號通路，賦予細胞應(yīng)激耐受及化療抵抗，是一種促進腫瘤細胞存活的耐藥機制[3,12]，K562/ADM細胞MDR與自噬增強密切相關(guān)[13]。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑促進白血病細胞凋亡的同時可誘導保護性自噬，氯喹與TKIs共同作用于耐酪氨酸激酶抑制劑的慢性粒細胞性白血病細胞后細胞耐藥性顯著下降。Beclin-1蛋白是自噬活性正調(diào)節(jié)因子，參與自噬前體形成，引導自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體膜，其表達與自噬水平正相關(guān)[15]；泛肽結(jié)合蛋白P62與LC3結(jié)合，作為自噬底物，整合入自噬泡最終被溶酶體降解，抑制細胞自噬時，P62蛋白降解減少[16]，因此P62、Beclin-1蛋白可作為自噬分子標志用于檢測自噬水平。本研究通過MDC染色及Western Blotting檢測從細胞形態(tài)學及自噬分子標志物檢測上發(fā)現(xiàn)K562/ADM細胞具有較高自噬活性，提示自噬可能與K562/ADM細胞MDR形成有關(guān)，抑制K562/ADM細胞UVRAG表達后，細胞自噬水平也隨之下降。結(jié)合上述抑制UVRAG表達可下調(diào)P-gp表達，以及Cheng等[13]報道在饑餓誘導K562/ADM自噬中，抑制自噬后K562/ADM細胞MDR1/P-gp表達也顯著下降，證實了自噬參與了K562/ADM細胞MDR形成，因此UVRAG參與MDR形成的另一個可能機制是通過介導自噬來發(fā)揮作用。

本課題組前期研究[4]報道基因毒性或代謝應(yīng)激可誘導腫瘤細胞自噬發(fā)生，同時上調(diào)UVRAG表達，抑制自噬能下調(diào)UVRAG表達，進一步發(fā)現(xiàn)UVRAG通過參與UVRAG-Beclin-1-PI3KC3復合體形成，增強Beclin-1與Vps34相互作用，促進自噬體形成[15]，介導Bif-1與Beclin-1相互作用，增強PI3KC3活性，促進細胞自噬[17]。這些表明UVRAG是一個自噬正調(diào)節(jié)蛋白。此外，UVRAG也是一種抗凋亡蛋白，UVRAG可通過C2結(jié)構(gòu)域與bax相互結(jié)合，抑制bax介導的凋亡發(fā)生[4]。因此下調(diào)UVRAG表達后，K562/ADM細胞自噬水平受制與Bax介導的凋亡增多是否共同促進化療藥物誘導細胞死亡有待進一步探討。

綜上所述，UVRAG蛋白在K562/ADM及K562細胞中高表達，與白血病MDR密切相關(guān)；UVRAG siRNA下調(diào)UVRAG表達可降低K562/ADM細胞耐藥性，其機制可能與降低自噬水平及下調(diào)P-gp表達有關(guān)。細胞自噬與細胞膜P-gp兩者都具有促瘤、促存活作用，細胞自噬水平受PI3K-I/Akt/mTOR信號通路[18]、UVRAG/ Beclin-1/PI3K-Ⅲ復合體[15]等調(diào)控，K562/ADM細胞P-gp表達受PI3K/Akt通路調(diào)控[10]，兩者之間存在交互作用，其機制值得進一步探討。

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Role of UVRAG on Autophagy and Drug Resistance in the K562/ADM Cells

Cao Qiangqiang1, Yin Xiaocheng1, Xiao Liang1, Xiao Zhengxiang2

(1.DepartmentofPediatrics,theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;2.DepartmentofPediatrics,theCentralHospitalofXiangtan,Xiangtan411100,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the role of UV radiation resistance-associated gene (UVRAG) on autophagy and drugs sensitivity by down-regulation of the expression UVRAG in K562/ADM cells.MethodsThe UVRAG protein levels were measured by Western Blotting in the K562 cells and the K562/ADM cells. Specificity siRNA and Scramble siRNA without any gene homology were designed and synthesised aiming at UVRAG gene, K562/ADM cells were transfected by LipofectamineTM2000 mediated siRNA. In different ce1ls groups, the chemotherapy sensitivity of adriamycin (ADM) were determined by CCK-8 kit, the autophagic vacuoles were observed by MDC staining and fluorescence microscope, the autophagy-related protein and P-gp protein expression were measured by Western Blotting.ResultsThe expression of UVRAG in K562/ADM cells was higher than K562 cells (P<0.05). In comparison with K562/ADM cells group and NC-K562/ADM cells group，the UVRAG protein expression level of K562/ADM cells group was obviously decreased after transfection with UVRAG siRNA(P<0.05), with 48 h working best; In comparison with K562/ADM cells group and NC-K562/ADM cells group, the sensibility of si-UVRAG-K562/ADM cells group to ADM was increased while IC50obviously decreased(P<0.05). Autophagic vacuoles in endochylema determined by MDC staining and fluorescence microscope were significantly reduced after UVRAG siRNA transfection. Further findings showed that the expression levels of Beclin-1 and P-gp and the degradation of P62 were higher than K562 cells, the expression of Beclin-1 and P-gp were significantly decreased and the degradation of P62 was reduced after inhibition expression of UVRAG gene (P all<0.05).ConclusionThe expression of UVRAG gene in K562/ADM cells was higher than K562 cells, suggesting that UVRAG may be closely involved in the multiple drug resistance in K562/ADM cells. Down-regulation of the expression UVRAG in K562/ADM cells can reduce drug resistance to chemotherapeutic adriamycin. It may be related to the down-regulation of autophagy and the expression of P-gp.

[Key words]UV radiation resistance-associated gene; K562/ADM cells; autophagy; drug resistance

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號:31271482)

作者簡介：曹強強(1987-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事小兒白血病基礎(chǔ)研究。E-mail: 1418277361@qq.com 通信作者：殷小成(1969-)，男，教授，主任醫(yī)師，主要從事小兒白血病基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:xcyin108@sina.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2016.03.001

[中圖分類號]R733.7; R730.23

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2016)03-0183-06

(收稿日期：2016-04-05)