劉大偉，梁芷健，王　芳，于　亮

（11..東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱　15500003300；22..齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江　齊齊哈爾　16611000066；33..阜新市植物保護(hù)站，遼寧　阜新　12233000000）

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大豆抗胞囊線蟲的抗病育種及抗病基因的研究進(jìn)展***

劉大偉11，梁芷健11，王芳22，于亮33

（11..東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱15500003300；22..齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾16611000066；33..阜新市植物保護(hù)站，遼寧阜新12233000000）

摘要：大豆胞囊線蟲病是世界大豆生產(chǎn)上的重要病害，給大豆生產(chǎn)造成巨大損失，種植抗病品種是防治大豆胞囊線蟲病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，國內(nèi)外在大豆抗胞囊線蟲病育種領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展。文中從抗胞囊線蟲的抗源篩選、抗病育種和抗病基因33個方面綜述了國內(nèi)外的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：大豆；大豆胞囊線蟲；抗病育種；抗病基因

第一作者：劉大偉，男，副教授，主要研究方向植物病理學(xué)，E-mail: liudawei353@163.com

大豆胞囊線蟲（Heterodera glycines Ichinohe），英文名稱為Soybean Cyst Nematode，簡稱SCN，是世界大豆生產(chǎn)上的一種毀滅性病原物。大豆胞囊線蟲是一種土傳的定居性內(nèi)寄生線蟲，具有分布廣、危害重、傳播途徑多、存活時間長等特點(diǎn)，因此，防治較為困難。大豆胞囊線蟲病在我國東北和黃淮海兩個大豆主產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，從世界范圍來看，大豆胞囊線蟲病的危害日趨加重，該病已成為世界大豆生產(chǎn)上的主要障礙，因此，大豆胞囊線蟲病的研究一直受到重視?，F(xiàn)就國內(nèi)外大豆抗胞囊線蟲的抗源篩選、抗病育種和抗病基因3個方面進(jìn)行綜述和分析，以期能夠?yàn)槲覈目咕€蟲育種工作提供參考。

1　抗大豆胞囊線蟲的抗源篩選

對大豆胞囊線蟲病抗源篩選研究工作較好的是美國和日本。1956年美國就開始進(jìn)行抗大豆胞囊線蟲資源篩選研究，在北卡羅萊納對4 000份材料鑒定后發(fā)現(xiàn)，Peking、PI88788、PI89732、PI90763根部沒有胞囊。Ross和Brim在大豆胞囊線蟲病重病田采用雙行法對2 800份材料進(jìn)行了抗病性鑒定［1］，篩選出了7份高抗材料：Ilsoy、Peking、PI89920、PI90763、PI79693、PI209332和PI84751，其中Peking成為最著名的抗源材料。Anand和Gallo將從世界各地收集的全部9 153份種質(zhì)對大豆胞囊線蟲3號生理小種的抗病性進(jìn)行了全面的篩選鑒定［2］，共鑒定出19份高抗材料和15份中抗材料。Anand等又將上述種質(zhì)對大豆胞囊線蟲5號和14號生理小種的抗性進(jìn)行了篩選鑒定［3］，得到對5號小種高抗材料7份，中抗材料2份，對14號小種高抗材料7份，中抗材料3份，而且所有抗5號和14號小種的材料都抗3號小種，其中PI437654是當(dāng)時所發(fā)現(xiàn)的抗全部生理小種的優(yōu)質(zhì)抗源。

自20世紀(jì)70年代后期，我國也重視了大豆胞囊線蟲的抗源篩選工作。吳和禮等［4］、劉漢起等［5］、張仁雙等［6］、劉維志和劉曄［7］、李瑩等都對收集的材料進(jìn)行了對大豆胞囊線蟲的抗性鑒定［8］，篩選出一批免疫或高抗的資源。但由于當(dāng)時的鑒定標(biāo)準(zhǔn)未統(tǒng)一，有的未按生理小種進(jìn)行鑒定，結(jié)果不夠確定。為此，1985年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源所組織了全國大豆種質(zhì)抗大豆胞囊線蟲鑒定協(xié)作組，1986—1990年對全國的1萬多份大豆種質(zhì)按照統(tǒng)一的鑒定方法和分級標(biāo)準(zhǔn)，分別在1、3和4號生理小種地區(qū)進(jìn)行了抗性鑒定研究，其中抗SCN 1號生理小種的品種128份，免疫16份；抗SCN 3號生理小種的品種288份，免疫30份；抗SCN 4號生理小種的品種11份，無免疫品種。五寨黑豆和灰皮支黑豆兼抗1、3、4和5號生理小種。李瑩等于1986—1990年間鑒定了中國各地8 240份大豆遺傳資源對大豆胞囊線蟲4號生理小種的抗性［9］，未發(fā)現(xiàn)免疫材料，篩選出9個抗病品種，分別來自河北、山西和陜西3省，即我國小黑豆的集中產(chǎn)區(qū)，這些小黑豆都是當(dāng)?shù)亻L期種植的地方品種，由于人工選擇和自然選擇的結(jié)果，具有抗性變異的個體存活下來，形成了抗大豆胞囊線蟲的抗源，其中興縣灰皮支黑豆還兼抗1、3和5號生理小種，抗性強(qiáng)而穩(wěn)定，是國內(nèi)外不多見的抗多個小種的優(yōu)質(zhì)資源。

2　抗大豆胞囊線蟲的抗病育種

培育抗大豆胞囊線蟲的品種是防治該病的最經(jīng)濟(jì)有效、環(huán)境友好的方法。美國的Ross和Brim篩選出高抗的Peking后，立即著手進(jìn)行抗病基因的回交轉(zhuǎn)育，經(jīng)與黃種皮的栽培品種Lee三次回交后，1966年育成了第1個抗大豆胞囊線蟲品種Pickett，以Peking為供體親本隨后又育成了Custer 和Deyer，以這些材料為抗病親本陸續(xù)育成推廣了一大批抗病性強(qiáng)的豐產(chǎn)品種。據(jù)Anand報道［10］，截至1991年美國共育成了130個抗病品種，其中有69個品種抗大豆胞囊線蟲3號生理小種，其抗病基因均可追溯到Peking的血緣。PI88788是另一個被廣泛應(yīng)用的抗源，1978年利用PI88788育成的Bed?ford及其姊妹系對控制當(dāng)時危害猖獗的14號生理小種的蔓延和危害起到了決定性的作用。以Forrest和PI437654為親本育成的新品種Hartwig結(jié)合了PI437654和Peking的抗病基因，能夠抗目前發(fā)現(xiàn)的14個生理小種。

我國抗大豆胞囊線蟲育種起步較晚，但也取得了較大進(jìn)展，自1978年育成抗病品種周7327-118以來，到目前已審定了80個抗（耐）病品種，其中東北大豆主產(chǎn)區(qū)品種36個，黃淮海大豆主產(chǎn)區(qū)44個［11］。

黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院以哈爾濱小黑豆為親本，從晉豆3號×哈爾濱小黑豆組合中選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)性廣的抗線大豆新品種—慶豐1號，該品種抗大豆胞囊線蟲3號生理小種，這對于以3號小種為優(yōu)勢生理小種的黑龍江省，慶豐1號是一個應(yīng)用廣泛的抗線品種。而后又培育出一系列抗線蟲品種：抗線4號、抗線6號、抗線8號、抗線9號和抗線10號等。山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所利用哈爾濱小黑豆為親本，從魯豆4號×哈爾濱小黑豆組合中選育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、高抗大豆胞囊線蟲病的大豆新品種—齊黃25號，從魯豆1號×哈爾濱小黑豆組合中選育出早熟、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的抗大豆胞囊線蟲3號小種的新品種—齊黑豆2號，這兩個大豆品種兼抗大豆胞囊線蟲1、3和5號3個生理小種［12］。遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所以感病品種遼豆10號為母本，抗病品種Franklin為父本進(jìn)行有性雜交，選育出在疫區(qū)比對照品種增產(chǎn)25%以上、高抗1號和3號生理小種的品系各5個。王志和李瑩以應(yīng)縣小黑豆和興縣灰皮支黑豆抗源為核心［13］，與武鄉(xiāng)白、25104和83-85等優(yōu)良品種配制雜交組合，獲得一批黃種皮、抗病及具有不同優(yōu)良農(nóng)藝性狀特點(diǎn)的高代育種材料。王連錚等從1991年開始進(jìn)行抗大豆胞囊線蟲的育種研究［14］，利用一些抗源材料（PI437654和灰皮支黑豆等）進(jìn)行了大量雜交工作，通過連續(xù)單株選拔、加大抗性好的組合群體數(shù)量、南繁北育、早代鑒定等措施，篩選出一些高抗、中抗的品種和品系，如中黃12（中作5239）、中黃13（中作975）及中黃17（中作976）等品種已正式審定推廣，后2個品種已通過國家審定。馬俊奎等以早熟、大粒品種埂283作母本［15］，以高抗大豆胞囊線蟲4號生理小種種質(zhì)1259作父本，配制雜交組合，選育出早熟、抗旱、抗大豆胞囊線蟲4號生理小種的新品種晉豆31號。

從育種方法上看，常規(guī)的有性雜交是目前最為常用、成效最大的方法，系統(tǒng)選育和突變育種也得到了成功應(yīng)用。值得一提的是，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院首次利用DNA導(dǎo)入技術(shù)育成了抗病品種抗線6號［16］，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所則以M型質(zhì)核互作雄性不育系W931A與恢復(fù)系WR016組配雜交組合，選育出我國首個抗病雜交夏大豆品種皖豆25。

在抗大豆胞囊線蟲的育種工作中，首先要明確和驗(yàn)證本地大豆生產(chǎn)中大豆胞囊線蟲的生理小種，一個地區(qū)可能有幾個生理小種，應(yīng)當(dāng)明確哪個小種是主要的，哪個是次要的；其次要有針對性地選擇抗源，這是選育抗大豆胞囊線蟲病品種的關(guān)鍵；最后必須要選擇大豆生產(chǎn)中大面積推廣的優(yōu)良品種或新育成的優(yōu)良品系作親本，由于抗源的農(nóng)藝性狀與栽培品種有差距，這樣成功率較高。

利用新的抗源或新型抗病基因是拓寬抗病品種遺傳基礎(chǔ)的重要途徑。國外研究主要集中在野生大豆抗病基因鑒定與利用和新類型抗病基因發(fā)掘2個方面［17］。我國大豆品種資源豐富，已保存23 000多份栽培大豆和7 600多份野生大豆種質(zhì)［11］，在抗病資源發(fā)掘與利用方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，但是僅有北京小黑豆、灰皮支黑豆和哈爾濱小黑豆3個抗源在抗病育種中得到了有效的利用，因此，未來的大豆胞囊線蟲抗病育種研究可以加強(qiáng)以下幾方面的工作：（1）深入開展地方品種的抗病基因鑒定；（2）加強(qiáng)野生大豆抗病基因資源發(fā)掘研究；（3）利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行輔助選擇，提高抗病育種效率；（4）培育抗大豆胞囊線蟲多個生理小種的大豆品種。

3　抗大豆胞囊線蟲的抗病基因

3.1基于QTL定位獲得的抗病候選基因

rhg1位點(diǎn)是Boutin等于1994年發(fā)現(xiàn)的抗性QTL，該位點(diǎn)與RFLP標(biāo)記K069緊密連鎖，而近等基因系的研究發(fā)現(xiàn)K069位于G連鎖群（18號染色體）上，與抗病基因緊密連鎖［18］。隨后發(fā)現(xiàn)許多與K069連鎖的分子標(biāo)記都定位于G連鎖群的該區(qū)段，與早期的經(jīng)典遺傳分析相結(jié)合，將該QTL位點(diǎn)命名為rhg1，該位點(diǎn)是大豆胞囊線蟲病最重要的抗性位點(diǎn)［19］，為許多交叉基因型提供對大豆胞囊線蟲主要部分的抗性，其不但控制著與大豆抗胞囊線蟲3號生理小種相關(guān)的50%以上的變化，并且對其他幾種大豆胞囊線蟲生理小種也具有部分抗性。擁有rhg1抗性位點(diǎn)被認(rèn)為是培育抗大豆胞囊線蟲病品種的必要條件。

rhg1基因沉默使抗病品系的胞囊數(shù)量增加，表明抗性候選基因rhg1具有對大豆胞囊線蟲的抗病作用。除此之外，Ruben等通過測序［20］，獲得了112份抗病種質(zhì)（PI系列）和34份衍生品種rhg1的DNA序列，發(fā)現(xiàn)了9種單倍型，其中4種為抗病單倍型。還發(fā)現(xiàn)了2個重要的突變A47V和H297N，推測可能改變了前體蛋白的傳導(dǎo)和（或）蛋白的功能。rhg1位點(diǎn)之間的相互作用是普遍現(xiàn)象，并沒有一個單一的基因可以提供完全的抗性，與抗性相關(guān)的一系列基因都位于rhg1位點(diǎn)內(nèi)，這些基因被顯示與連鎖群B1上的另一個基因組具有合成同源性。

Li等對6個抗病和2個感病基因型rhg1序列進(jìn)行分析［21］，鑒定出37個SNP，其中11個發(fā)生在編碼區(qū)，這11個中的7個SNP能夠?qū)е禄虬被嵝蛄械母淖儯?個SNP形成了一個與大豆胞囊線蟲抗性相關(guān)的haplotype。這個定位于抗性候選基因rhg1序列的新的特異等位PCR標(biāo)記與微衛(wèi)星標(biāo)記BACR-Satt309結(jié)合將顯著提高大豆胞囊線蟲抗病品種分子標(biāo)記輔助鑒定水平。南海洋等根據(jù)rhg1序列插入/刪除位點(diǎn)［22］，開發(fā)了3個InDel標(biāo)記，關(guān)聯(lián)分析表明rhg1-I4為抗性相關(guān)標(biāo)記，此標(biāo)記的288 bp和294 bp等位變異為抗病相關(guān)等位變異。這個標(biāo)記與Satt309配合鑒定可以提高大豆胞囊線蟲抗病資源的檢測效率。

從上述分析可以看出，rhg1位點(diǎn)對大豆胞囊線蟲的抗性作用是顯而易見的，但這個抗性候選基因究竟是類受體激酶還是其他相關(guān)功能基因，尚未見轉(zhuǎn)基因大豆驗(yàn)證報道。

Rhg4位點(diǎn)位于A2連鎖群（8號染色體）上，其對大豆胞囊線蟲3號和14號生理小種有共同的抗性作用，但其對大豆胞囊線蟲2號生理小種沒有抗性作用。Rhg4在結(jié)構(gòu)上與rhg1相似，也含有LRR重復(fù)、跨膜結(jié)構(gòu)域和絲氨酸-蘇氨酸激酶。其編碼894個氨基酸，但與rhg1的同源性卻比較低，Mek?sem等將分離到的Rhg4轉(zhuǎn)化到感病材料中［23］，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Rhg4基因的材料表現(xiàn)為抗病，表明該基因具有抗病作用。對從Rhg4純化獲得的LRR蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其可能具有一個α-β折疊，為馬蹄式結(jié)構(gòu)［24］。Jamai等利用Tilling技術(shù)對Rhg4進(jìn)行功能分析［25］，在LRR-激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)了一個終止突變，并定位于在距Rhg4 1.5 cM處。迄今為止，發(fā)現(xiàn)的重組事件顯示Rhg4位點(diǎn)位于A2D8和BLT65之間，該區(qū)域長為142 kb，包括基因編碼的一個類受體激酶、一個類枯草桿菌蛋白和一個類蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［26］，其中Rhg4編碼的蛋白是類受體酶，屬于R基因之一。

3.2基于比較基因組獲得的抗病候選基因GmHs1pro-1

Hs1pro-1基因是從野生甜菜中克隆，并通過轉(zhuǎn)基因甜菜試驗(yàn)證明該基因具有抗線蟲的作用。Hs1pro-1與rhg1和Rhg4不同，其具有抗病機(jī)制的特殊結(jié)構(gòu)Hs1pro-1-N和Hs1pro-1-C［27］。大豆Hs1基因類似物是由Ishihara等從抗大豆胞囊線蟲病的品種Forrest和對大豆胞囊線蟲感病的品種Essex中克?。?8］，并且被定位在分布有大量大豆胞囊線蟲抗性位點(diǎn)的C2連鎖群（2號染色體）上。Hauge等也在大豆中獲得了Hs1pro-1類抗大豆胞囊線蟲病的抗性候選基因［29］，并且還申請了專利。Yuan等根據(jù)甜菜Hs1pro-1基因克隆出大豆完整的1 447 bp的不含內(nèi)含子的Hs1pro-1同系物GmHs1pro-1基因序列［30］。Hs1pro-1基因編碼的蛋白包含一個亮氨酸富集區(qū)和一個轉(zhuǎn)膜區(qū)，但是發(fā)現(xiàn)該蛋白不屬于植物抗性基因的NBS-LRR類或其他已經(jīng)存在的R蛋白，認(rèn)為其可能是一個完全新的R基因之一［31］。Thurau等研究發(fā)現(xiàn)Hs1pro-1基因上游3 802 bp的啟動子區(qū)在-355和+247之間存在線蟲攝氏位點(diǎn)必需的順式元件，且上游元件位于基因高表達(dá)所必須的-1 999到-705區(qū)域［32］。

3.3基于芯片雜交鑒定出的抗病候選基因

Ithal和Klink等對大豆胞囊線蟲3號生理小種侵染后的大豆均進(jìn)行了Microarray分析。Ithal等在35 611個大豆轉(zhuǎn)錄本中鑒定出429個在大豆胞囊線蟲侵染和未侵染根部組織中存在差異表達(dá)的基因［33］，這些基因主要分為6大類：基礎(chǔ)新陳代謝、酚類化合物、木質(zhì)素和類黃酮的生物合成、脅迫與防御反應(yīng)、細(xì)胞壁修飾、細(xì)胞信號和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。另在7 431個大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)錄本中鑒定出1 850個在線蟲寄生和發(fā)育的不同階段表達(dá)顯著不同的基因。Klink等對37 744個大豆轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行的Microarray分析鑒定發(fā)現(xiàn)［34］，在大豆胞囊線蟲非競爭性（Incompatible，I）群體中有339個受誘導(dǎo)表達(dá)和740個受抑制表達(dá)的基因；在大豆胞囊線蟲競爭性（Compatible，C）群體中有181個受誘導(dǎo)表達(dá)和491個受抑制表達(dá)的基因。其中在I和C中共有62個基因的表達(dá)相同，包括編碼PR10、過氧化物酶、苯基苯乙烯酮合成酶、WRKY轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞色素P450的基因。

魏利對重復(fù)出現(xiàn)于上述不同芯片研究中的4個基因BQ080041、U03860、AI759701和BU551112進(jìn)行研究［35］，發(fā)現(xiàn)BQ080041是與胰蛋白酶抑制劑相關(guān)的基因；U03860和AI759701基因是與大豆延展所相關(guān)的基因；BU551112則是與泛素結(jié)合酶相關(guān)的基因。其中BQ080041基因定位于J連鎖群（16號染色體）；AI759701基因定位于B1連鎖群（11號染色體）；U03860和BU551112基因均定位于D1a連鎖群（1號染色體）。而J、B1和D1a這3個連鎖群上均被發(fā)現(xiàn)有抗大豆胞囊線蟲的QTL位點(diǎn)。

3.4基于元分析與結(jié)構(gòu)域注釋獲得的抗病候選基因

?，|等采用圖譜整合軟件BioMercator 2.1將不同來源的QTL整合到遺傳圖譜GmComposite 2003上［36］，并通過元分析的方法獲得一致性QTL。運(yùn)用抗病基因注釋的方法獲得一致性QTL內(nèi)包含的抗性候選基因，同時采用分子生物學(xué)手段克隆預(yù)測得到的基因，并采用半定量RT-PCR的方法進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明通過元分析獲得了27個一致性位點(diǎn)，根據(jù)hmmsearch的搜索結(jié)果顯示，共得到77個大豆胞囊線蟲抗性候選基因，其中PK-LRR-TM 和PK類的抗病基因?yàn)橹饕念愋?，共占總?shù)的77%。選擇Gm16上抗病基因簇內(nèi)的基因進(jìn)行克隆，其中4個獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，半定量RT-PCR結(jié)果表明，Glyma16g31490.1只在抗線蟲品種L-10中表達(dá)，而在感線蟲品種黑農(nóng)37中不表達(dá)，且在L-10根中的表達(dá)量明顯高于葉片中的表達(dá)量，推測其在大豆胞囊線蟲抗性過程中可能發(fā)揮一定的作用。

3.5基于轉(zhuǎn)錄組分析獲得的抗病候選基因

劉大偉等利用高通量測序技術(shù)對感病品種遼豆15和抗病品種灰皮支黑豆（ZDD2315）受大豆胞囊線蟲侵染后早期根系基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析［37］，研究大豆胞囊線蟲侵染后大豆根部誘導(dǎo)表達(dá)的差異基因。結(jié)果表明，這些差異表達(dá)的基因與激素應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、熱激蛋白、防御酶系和PR蛋白等有關(guān)，推測這些基因可能在大豆與大豆胞囊線蟲的非親和互作中起重要作用。李海燕等利用Illumina HiSeqTM2 000對大豆胞囊線蟲侵染前后的抗病大豆品種五寨黑豆的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測［38］。將測序的2個文庫進(jìn)行拼接，篩選得到1 045個差異表達(dá)基因，KEGG代謝通路分析顯示差異表達(dá)基因在苯丙烷類及氧化磷酸化代謝通路顯著富集，說明這2個代謝通路在五寨黑豆抗胞囊線蟲病中起重要作用。

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Research Progress on the Resistance Breeding and Resistant Genes of Soybean to Heterodera glycines

Liu Dawei1, Liang Zhijian1, Wang Fang2, Yu Liang3

（1. College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Life Science and Agricultural College, Qiqihar University, Qiqihar, Heilongjiang 161006, China; 3. Plant Protection Station of Fuxin City, Fuxin, Liaoning 123000, China）

Key words:Soybean; Heterodera glycines Ichinohe; Resistance breeding; Resistant genes

Abstract:Soybean Cyst Nematode（Heterodera glycines Ichinohe）is a seriously destructive pathogen in soybean production worldwide and causes great loss. The best control method is planting resistant culti?vars. The paper summarized screening resistant sources, resistance breeding and resistant genes of soy?bean to Soybean Cyst Nematode at home and aboard.

中圖分類號：S332.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-3547（2016）02-0021-07

收稿日期：2016-03-16；修回日期：2016-04-04

*基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金（C201428）；黑龍江省博士后資助項(xiàng)目（LBH-Z14034）