王瀟,吳曰超,何俊豪,毛之華,張學(xué)喜,蔡金洋,王強(qiáng),尹建華*

(1.南京航空航天大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系,南京　211106;2.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京　210029)

關(guān)節(jié)軟骨的熒光顯微檢測(cè)方法研究

王瀟1,吳曰超1,何俊豪1,毛之華1,張學(xué)喜1,蔡金洋2,王強(qiáng)2,尹建華1*

(1.南京航空航天大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系,南京211106;2.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京210029)

摘要:基于關(guān)節(jié)軟骨組織中膠原蛋白的自發(fā)熒光特性,對(duì)軟骨組織的熒光顯微檢測(cè)方法進(jìn)行研究。首先基于熒光圖像的統(tǒng)計(jì)處理,揭示健康樣本與病變樣本的差異。其次基于熒光的偏振敏感特性,利用線性二色性方法揭示了軟骨組織存在的熒光各向異性特性,為利用熒光各向異性方法研究生物組織結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)的顯微方法檢測(cè)軟骨組織的形態(tài)和超結(jié)構(gòu)相比,利用熒光特性的熒光顯微檢測(cè)方法具有獲取軟骨組織結(jié)構(gòu)的能力。本文的研究結(jié)果為開(kāi)辟新的骨關(guān)節(jié)疾病診斷方法提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:關(guān)節(jié)軟骨;熒光顯微;各向異性

1引言

關(guān)節(jié)軟骨(articular cartilage,AC)是一種透明的結(jié)締組織,覆蓋在骨關(guān)節(jié)的連接表面(幾百微米到幾毫米厚度)。其表面光滑,輔以關(guān)節(jié)滑液,有利于減少相鄰兩骨的摩擦,使人體得以自由運(yùn)動(dòng)。然而當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨隨年齡增長(zhǎng)或者受外界的影響(如外傷、過(guò)承重、低溫等)時(shí),則會(huì)發(fā)生組織功能性退變甚至骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)等各種形式的關(guān)節(jié)疾病。該病的后期階段則會(huì)出現(xiàn)不可逆的大范圍的軟骨損壞,從而最終導(dǎo)致整個(gè)關(guān)節(jié)功能和關(guān)節(jié)置換的喪失。因此,對(duì)軟骨疾病進(jìn)行早期診斷意義重大。

在過(guò)去的關(guān)節(jié)軟骨研究中,人們采用的檢測(cè)手段主要是生物化學(xué)分析[1]、磁共振成像[1]、生物力學(xué)測(cè)量[2]等。生物化學(xué)和生物力學(xué)能探測(cè)大塊組織或者較厚的平行切片,卻受限于分辨率。 磁共振成像成功測(cè)量軟骨的蛋白多糖含量,但難于探測(cè)膠原蛋白的含量信息。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡、掃描和透射顯微鏡可以對(duì)組織的形態(tài)學(xué)和超結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像,但缺少成分濃度以及細(xì)微組織結(jié)構(gòu)信息[3-6]。傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared imaging,FTIRI)光譜成像技術(shù)亦被用于關(guān)節(jié)軟骨分析檢測(cè),并取得了一定的進(jìn)展[7-8]。

與此同時(shí),在過(guò)去的幾十年中熒光技術(shù)因其各種特性和優(yōu)點(diǎn)迅速發(fā)展,極大地豐富了生命科學(xué)研究手段,回答了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域復(fù)雜的科學(xué)問(wèn)題。其中以熒光輻射光強(qiáng)為對(duì)比機(jī)制的顯微技術(shù)因可直接反映熒光基團(tuán)的位置和濃度,應(yīng)用最為廣泛。除此之外熒光本身所具有的波長(zhǎng),壽命和偏振特性也被廣泛應(yīng)用到生物檢測(cè)領(lǐng)域。波長(zhǎng)特性為熒光光譜方法和多色熒光圖像提供了物理基礎(chǔ)；而熒光壽命則對(duì)對(duì)熒光基團(tuán)所處環(huán)境敏感；同時(shí)熒光的偏振敏感性則被用于研究生物分子方向信息以及組織結(jié)構(gòu)特性[9-11]。而基于熒光光譜和熒光壽命的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)被成功應(yīng)用于軟骨組織的研究和骨關(guān)節(jié)炎的診斷中[12-13]。

本文基于關(guān)節(jié)軟骨中膠原蛋白的自發(fā)熒光特性,對(duì)軟骨組織的熒光顯微特性進(jìn)行研究,為探索軟骨組織熒光檢測(cè)方法提供基礎(chǔ)。主要包括兩個(gè)方面,首先基于熒光的光強(qiáng)特性,分析正常軟骨和病變軟骨的熒光圖像差別,用熒光圖像處理的方法來(lái)檢測(cè)軟骨組織。由于軟骨組織中膠原蛋白的自發(fā)熒光特性,可以對(duì)軟骨組織不做標(biāo)記進(jìn)行自發(fā)熒光顯微成像。膠原蛋白形成纖維網(wǎng)絡(luò),保證關(guān)節(jié)軟骨可承受機(jī)械壓力和拉力,同時(shí)固定蛋白多糖,而蛋白多糖保證軟骨的彈性、吸收運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的震動(dòng)。紅外光譜成像方法的研究結(jié)果表明,病變軟骨組織會(huì)有大量蛋白多糖的流失,進(jìn)而引起組織基質(zhì)的改變[14]。因此健康樣本和病變樣本的熒光圖像在形態(tài)特征上存在區(qū)別。為此對(duì)兩種樣本進(jìn)行熒光顯微成像,通過(guò)比較其熒光圖像并分析其圖像差別。

其次基于熒光的偏振敏感特性,利用線性二色性方法研究軟骨組織的熒光偏振響應(yīng)特性,從各項(xiàng)異性信息檢測(cè)方面為生物組織的研究提供基礎(chǔ)。其中所謂的線性二色性(LD-linear dichroism)方法是基于熒光吸收過(guò)程中吸收效率對(duì)激發(fā)光偏振方向的敏感性(吸收效率)提出的,每個(gè)熒光分子都有其極性方向,而受激發(fā)時(shí)的吸收效率正比于其極性方向與激發(fā)光偏振方向夾角余弦的平方,基于該原理提出的LD法已成功用于研究細(xì)胞膜磷脂分子排列分布[15]以及淀粉纖維組織結(jié)構(gòu)[16]。而軟骨組織中膠原纖維的各向異性結(jié)構(gòu)作為表征能夠區(qū)分健康和病變組織。因此本文基于膠原纖維的自發(fā)熒光特性,利用該方法,揭示其軟骨組織的各向異性結(jié)構(gòu),為用熒光偏振檢測(cè)軟骨組織結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)。

2軟骨組織熒光顯微檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

2.1熒光顯微圖像實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)中,為保證所獲取熒光圖像具有更好的軸向分辨力,去除骨碎末等雜質(zhì)對(duì)圖像的影響,采用激光共聚焦熒光顯微系統(tǒng)(ZEISS LSM700)獲取熒光圖像,激發(fā)波長(zhǎng)為491 nm波段的藍(lán)光,每個(gè)像素點(diǎn)駐留時(shí)間為3 ms。利用該共焦系統(tǒng)的20倍放大倍率,對(duì)健康樣本和病變樣本分別進(jìn)行熒光成像。

2.2熒光偏振檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(IX51),配置MicroPublisher3.3RTV 型號(hào)CCD,采集軟骨樣品熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。激發(fā)光的偏振方向改變通過(guò)起偏器的旋轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)。具體的光路如圖1所示,鹵素?zé)舭l(fā)出的白光經(jīng)濾光片后成為激發(fā)光光源,經(jīng)起偏器改變偏振方向a,然后被二色棱鏡反射進(jìn)入顯微物鏡,激發(fā)樣本。在該偏振方向下,輻射熒光經(jīng)過(guò)顯微物鏡最后曝光成像在與樣本平面共軛的CCD。改變激發(fā)光偏振方向a,在每個(gè)偏振方向a下,CCD記錄其對(duì)應(yīng)的熒光圖像,最終產(chǎn)生一個(gè)偏振熒光圖像序列。從該圖像序列中,對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)沿偏振方向a這個(gè)維度可以獲取隨a變化的熒光輻射光強(qiáng)。

2.3樣本制備

實(shí)驗(yàn)所用健康樣本和病變樣本均為犬后膝關(guān)節(jié)軟骨,犬后膝關(guān)節(jié)軟骨取自2條成年狗(1 條健康,1條患有關(guān)節(jié)炎)。OA樣本為實(shí)施了前十字韌帶(anterior cruciate ligament,ACL)截?cái)嘈g(shù)后飼養(yǎng)兩年的成年狗,該ACL橫切的犬模型已成為OA動(dòng)物研究的黃金標(biāo)準(zhǔn),其可導(dǎo)致關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)失真和軟骨損傷,類似于在人OA中的組織變化。軟骨樣本從半月板覆蓋著的脛骨上切下,軟骨骨塊的大小約為 2 mm×2 mm×2 mm。隨后用鹽水洗滌樣本并用液氮快速冷凍,在低溫切片機(jī)(Leica CM 1950,Germany)零下20攝氏度的環(huán)境中被切成10微米厚的切片。 軟骨切片附著在載玻片上,并在空氣中干燥。切割方向垂直于軟骨表面,即從淺表區(qū)(SZ)、過(guò)渡區(qū)(TZ)到放射區(qū)(RZ)[17]。

Fig.1The setup of polarized fluorescence microscopic

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1軟骨組織的熒光顯微圖像分析

利用2.1所述的激光共聚焦熒光顯微系統(tǒng)(ZEISS LSM700)對(duì)正常樣本和病變樣本(各3片),進(jìn)行熒光成像,從熒光圖像直觀上看所有正常樣本圖像特征相似,所有病變樣本圖像特征相似,而兩種樣本的熒光圖像特征差異明顯。共聚焦圖2展示了實(shí)驗(yàn)所測(cè)量的樣本中一個(gè)健康樣本和一個(gè)病變樣本的熒光圖像及其強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)直方圖,從圖中可以直觀看出,與健康樣本相比病變軟骨發(fā)生如下變化:首先病變樣本淺表層被破壞不再平滑；其次軟骨組織基質(zhì)發(fā)生變化,蛋白多糖流失造成過(guò)渡區(qū)附著的細(xì)胞數(shù)目明顯減少,膠原纖維直接顯露出來(lái),這與紅外光譜成像方法所得結(jié)果符合[14]。進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)樣本的前半部分和后半部分,進(jìn)行熒光圖像直方圖統(tǒng)計(jì)的比較,如圖2(c)(f)所示,從圖像統(tǒng)計(jì)上給出健康樣本和病變樣本的差異。由于蛋白多糖的流失,造成病變樣本組織基質(zhì)和附著細(xì)胞的減少,膠原纖維裸露造成的空洞使得病變樣本的直方圖分布更偏向暗部,前半部分和后半部分的強(qiáng)度分布中心都處在50～70左右,而健康樣本前半部分和后半部分的強(qiáng)度分布中心都處在100～120左右。對(duì)其他兩個(gè)正常樣本和病變樣本進(jìn)行處理,得到相似的結(jié)果,該結(jié)果表明病變軟骨的熒光強(qiáng)度分布發(fā)生了明顯的改變,由此可見(jiàn)直方圖統(tǒng)計(jì)特征可以作為辨別軟骨組織的一個(gè)重要標(biāo)識(shí),進(jìn)而為病變軟骨的熒光顯微檢測(cè)提供了新的方法。

Fig.2Fluorescence microscopic images(a,b)and fluorescence intensity histograms(c)of the first half part of the healthy and osteoarthritic cartilages,respectively,as well as the corresponding graphs(d,e,f)of the latter half part of the both cartilages.The fluorescence intensity histograms of the healthy and osteoarthritic cartilages are respectively indicated by grey and black in(c)and(f)

3.2軟骨組織的熒光偏振檢測(cè)

利用圖1所示熒光偏振檢測(cè)裝置,對(duì)健康樣本進(jìn)行測(cè)量。實(shí)驗(yàn)中起偏器從0°到180°,以10°為間隔進(jìn)行旋轉(zhuǎn),保證激發(fā)光的偏振方向a進(jìn)行相應(yīng)的旋轉(zhuǎn),CCD依次曝光記錄每個(gè)激發(fā)光偏振方向a下對(duì)應(yīng)的熒光圖像。從19幀的熒光圖像系列中,對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)可以提取受激發(fā)光偏振方向a調(diào)制的熒光變化曲線。圖3展示了一個(gè)健康樣本的測(cè)量結(jié)果,其中圖3(a)為a=0°時(shí)CCD所記錄的熒光圖像。圖3(b)為軟骨組織表層區(qū)A點(diǎn)位置隨偏振方向a變化的歸一化熒光強(qiáng)度和對(duì)其擬合后的熒光強(qiáng)度變化曲線。在數(shù)據(jù)擬合中,由于輻射光強(qiáng)正比于偏振方向與熒光偶極子方向夾角余弦的平方,所以設(shè)計(jì)擬合函數(shù)為I(α)=A×cos2(α+B)+C,其中I為輻射光強(qiáng),A為幅度代表了各向異性特性,B為角度平移代表了組織結(jié)構(gòu)的平均取向,C為背景光強(qiáng)。利用Matlab根據(jù)所設(shè)計(jì)的擬合函數(shù)對(duì)所記錄的熒光強(qiáng)度進(jìn)行擬合,得到擬合后的熒光變化曲線。從擬合結(jié)果可以看出,擬合曲線匹配實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),擬合系數(shù)為0.87,表明熒光強(qiáng)度變化曲線符合理論上吸收效率隨a變化的正弦規(guī)律。由于表層區(qū)域纖維排列平行于表面,因此當(dāng)偏振方向與表面垂直時(shí)(即偏振方向α=90°),吸收最小,輻射熒光光強(qiáng)接近最低值,與紅外光譜方法所得結(jié)果符合[18]。為避免單個(gè)數(shù)據(jù)的偶然性,進(jìn)一步沿表層區(qū)水平方向隨機(jī)選取8個(gè)點(diǎn)(包括點(diǎn)A),疊加這8個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度,并對(duì)疊加后的熒光強(qiáng)度隨α變化的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,其結(jié)果如圖3(c)所示。由于表層區(qū)各位置膠原纖維的排列性質(zhì)基本相同,都沿水平方向,所以多點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果與單點(diǎn)A的結(jié)果相似。該結(jié)果為利用熒光偏振技術(shù)檢測(cè)和診斷軟骨組織結(jié)構(gòu)提供了方法基礎(chǔ)。在下一步的工作中,熒光各向異性信息與組織病變之間的關(guān)系會(huì)進(jìn)行更為詳細(xì)的研究。

Fig.3(a)The polarized fluorescence microscopic image of healthy articular cartilage,(b)the polarized fluorescence intensity and the fitted profile of the corresponding point A with the fitting coefficient of 0.87,(c)the statistical polarized fluorescence intensity and the fitted profile for points indicated by white circles in(a)with the fitting coefficient of 0.78

4結(jié)論

本文以軟骨組織膠原蛋白自發(fā)熒光特性為基礎(chǔ),結(jié)合熒光顯微技術(shù)這一強(qiáng)大光學(xué)檢測(cè)手段,研究了利用自發(fā)熒光圖像進(jìn)行組織的檢測(cè),以及利用熒光的偏振特性研究其組織結(jié)構(gòu)的各向異性信息,為利用熒光技術(shù)進(jìn)行軟骨組織診斷提供新的理念和方法基礎(chǔ)。進(jìn)一步基于熒光偏振特性研究各向異性信息與病變組織之間的關(guān)系,是接下來(lái)要繼續(xù)深入進(jìn)行的工作。而熒光顯微自身所具有的無(wú)損、便捷、高靈敏和高準(zhǔn)確性必將在軟骨組織檢測(cè)方向展示出其優(yōu)點(diǎn)。

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A Study on Fluorescence Microscopy Measurement Method of Articular Cartilage

XIAO Wang1,WU Yue-chao1,HE Jun-hao1,MAO Zhi-hua1,ZHANG Xue-xi1,CAI Jin-yang2,WANG Qiang2,YIN Jian-hua1*

(1.DepartmentofBiomedicalEngineering,NanjingUniversityofAeronauticsandAstronautics,Nanjing210016,China;2.StateKeyLaboratoryofReproductiveMedicine,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China)

Abstract:Based on the auto-fluorescence property of collagen in articular cartilage,the research on fluorescence microscopy measurement method of articular cartilage was carried out.First,the difference between the healthy and pathological samples was revealed by statistical comparison of fluorescence images.Second,based on the polarization property of fluorescence,the fluorescence anisotropy of the cartilage was presented by the linear dichroism method,which lays foundation for research on structure of articular cartilage using fluorescence anisotropy method.Compared to traditional microscopic measurement techniques that supply the morphology and the super-structure of cartilage tissues,fluorescence microscopy measurement methods are able to obtain the information about the structure of cartilage tissues.The results presented in this paper open the door for developing new diagnostic method for articular cartilage diseases.

Key words:articular cartilage;fluorescence microscopy;anisotropy

收稿日期:2015-08-08; 修改稿日期:2015-10-30

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(61378087)和江蘇省自然科學(xué)基金(BK20150752)

作者簡(jiǎn)介:王瀟(1985-),男,講師,研究方向:生物光子學(xué),光學(xué)顯微成像,生物成像,生物光譜學(xué)。 E-mail:xiao.wang@nuaa.edu.cn 通訊作者:尹建華,E-mail:yin@nuaa.edu.cn

文章編號(hào):1004-5929(2016)02-0185-05

中圖分類號(hào):O433；O657.3；Q-3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

doi:10.13883/j.issn1004-5929.201602016