張偉偉，付元帥，邵燕，王寶琴，石東里，張?zhí)m

(1.濱州學院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術研究中心，山東 濱州 256603；2.上海海洋大學 水產與生命學院 ，上海 201306)

張偉偉1，付元帥2，邵燕1，王寶琴1，石東里1，張?zhí)m1

(1.濱州學院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術研究中心，山東 濱州 256603；2.上海海洋大學 水產與生命學院 ，上海 201306)

摘要：本文分別對雌雄白緣的5S rDNA進行了PCR擴增和序列分析，并采用雙色熒光原位雜交(FISH)技術，以白緣的5S rDNA序列和小麥的45S rDNA為探針，對其在白緣雌雄中期染色體上進行了FISH定位研究。結果表明，白緣5S rDNA序列無雌雄差異；5S rDNA的保守區(qū)序列為117 bp；5S rDNA和45S rDNA分別被定位于白緣的性染色體和第5號染色體上。同時從GenBank中獲得了22種魚的5S rDNA，運用DNAman軟件構建了23種魚的系統(tǒng)發(fā)育樹，對白緣的進化地位進行了初步研究。本研究為闡明白緣在魚類系統(tǒng)進化中的位置、重復序列在脊椎動物性染色體上的分布狀況以及與性別決定與分化的關系，提供了資料積累和分析依據。

關鍵詞：Liobagrus marginatus; PCR; 5S rDNA; 系統(tǒng)進化樹; 染色體; FISH

1引言

核糖體RNA 基因(rDNA)是真核生物基因組中一類高度重復并有轉錄活性的基因家族。在細胞遺傳學研究中已成為一種非常有用的遺傳標記[5]。18S、5.8S、28S rDNA串聯(lián)在一起形成45S rDNA，排列在某一染色體上形成核糖體RNA基因簇[6]。5S rRNA基因是串聯(lián)重復的多拷貝基因，它們獨立存在，并不與主體 rRNA (18S-5.8S-28S rRNA ) 基因相連，在生物體內含量豐富，廣泛分布，而且進化上高度保守，因此常用來研究物種進化和同源性分析，被稱為生物體內的活化石[7]。在某些魚類中，45S rDNA 和 5S rDNA 位于相同的染色體上[8—9]，在大部分魚類中則位于不同的染色體上[10—11]。在某些有異型性染色體的物種中，5S rDNA 位于性染色體上[12—14]，有可能參與性別決定和分化。

2材料與方法

2.1材料

根據 5S rDNA 保守序列設計引物：

上游 P1：5′-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3′

下游 P2：5′-CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3′

由上海生工生物工程公司合成。

2.2方法

2.2.25S rDNA 的擴增、克隆及測序分析

2.2.3序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

由 GenBank 獲得另外 22 種魚類的 5S rDNA的保守區(qū)序列(表1)，用 DNAman 軟件進行序列比對分析，并構建魚類的系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1　分析用標本名錄、GenBank 序列號

2.2.4染色體標本制備

2.2.5FISH 探針的制備

2.2.6熒光原位雜交

從-20℃取出染色體標本，依次進行如下處理：60℃烤片3 h；RNase A(0.1 μg/μL溶于 2×SSC中)，37℃處理1 h；2×SSC室溫洗滌3×2 min；70%，90%，100%乙醇梯度脫水，各2 min，室溫干燥；70%甲酰胺變性液(pH7.0)72℃變性3 min，立即轉入-20℃70%乙醇中，5 min后經90%，100%(-20℃)系列乙醇脫水，各5 min，室溫干燥。將 5S rDNA和 45S rDNA 探針雜交液(標記探針4 μL、20×SSC 4 μL、去離子甲酰胺 20 μL、20%硫酸葡聚糖4 μL、PBS(pH7.0)/適量水，總體積40 μL)，于100℃水浴變性10 min，冰浴5 min，加在處理過的染色體標本上，加蓋玻片，橡皮泥封片，置80℃烤箱中3 min，轉入濕盒中37℃雜交20 h。

2.2.7熒光原位雜交的信號檢測

(1) 洗脫。雜交后的玻片，于2×SSC中除去蓋片，按下列程序洗脫：50%甲酰胺/2×SSC 45℃漂洗3×5 min；2×SSC45℃漂洗3×5 min；BUFI室溫漂洗5 min。

(2) 封阻。BUFⅡ37℃封阻30 min。

(3) 檢測。按下列程序檢測雜交信號，所有操作均在暗處進行：鏈親和素-Cy3(Streptavidin-Cy3)和抗地高辛(Anti-Dig-Fluorescein Fab fragments)混合液，37℃結合30 min；BUFI漂洗3×5 min；生物素化鏈抗親和素(Biotinylated anti-streptavidin)和羊抗地高辛偶聯(lián)物(Fluorescein Anti-sheep IgG)混合液，37℃結合30 min；BUFI漂洗3×5 min；鏈親和素-Cy3 37℃結合30 min；BUF I漂洗3×5 min。70%、90%、100%系列乙醇脫水，各5 min，20 μg/mL DAPI復染，并加入抗熒光萃滅劑PPD(0.5 μg/mL)，蓋上蓋玻片，橡皮泥封片后，用Olympus BX60型熒光顯微鏡觀察雜交結果并照片記錄，然后對照片結果進行分析。

3結果與分析

3.1基因組 DNA 提取、PCR 擴增及序列測定

提取的基因組DNA經電泳和分光光度計檢測，具有較高的純度和濃度，將雌雄基因組DNA分別稀釋成同一濃度(約 15 ng/uL)。采用 PCR 擴增 5S rDNA 基因序列，得到 250、450 和 1 200 bp 左右的3條擴增帶，經克隆測序和GenBank中Blast分析，確定白緣魚央的5S rDNA保守區(qū)序列為 117 bp(圖1)，并且發(fā)現在 5S rDNA 保守區(qū)之間存在不同的非轉錄間隔區(qū)(Nontranscribed Spacers，NTS)序列。

3.2序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

3.3染色體標本制備

3.45S rDNA 和 45S rDNA 在染色體上的 FISH 定位

圖1　23 種魚的 5S rDNA 基因的序列比對分析Fig.1　The sequence alignment analysis of 5S rDNA gene of 23 fishes

圖2　基于 5S rDNA 序列構建的 23 種魚類的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2　Phylogenetic tree of 23 fishes based on 5S rDNA sequences

圖3　5S rDNA和45S rDNA對白緣雄性中期染色體的FISH分析Fig.3　Localization of 5S rDNA Probe and 45S rDNA by FISH in male samples of Leiobagrus marginatusa.5S rDNA和45S rDNA 在中期染色體上的分布； b.白緣基于5S rDNA和 45S rDNA FISH圖像核型圖a.Distribution of 5S rDNA and 45S rDNA on metaphase;b.Homologous pairing of chromosomes based on 5S rDNA and 45S rDNA FISH

圖4　5S rDNA和45S rDNA FISH定位后白緣染色體的Giemsa染色分析Fig.4　Giemsa Karyotype of the male Leiobagrus marginatus after FISH localization of 5S rDNA and 45S rDNA

4討論

45S rRNA 基因簇在不同的生物中存在于不同的染色體上，該基因簇由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成，在不同的真核生物中含有幾百到幾千個串聯(lián)重復序列，每個重復序列由保守的密碼序列區(qū)和變異較快的非密碼間隔區(qū)組成，密碼序列區(qū)(18S、5.8S、28S rRNA結構基因)與非密碼間隔區(qū)(即轉錄間隔區(qū))相間排列，在細胞進行轉錄時整個重復序列均可進行轉錄。真核生物 45S rRNA 基因簇中的串聯(lián)重復序列在進化上表現出相當的一致性，并且在種內的獨特性序列的同質性相對較高，但其他非獨特性序列仍有一定的差異性。因此日益成為近親分類群間的親緣關系、系統(tǒng)發(fā)育關系和遺傳多樣性等研究中的優(yōu)良分子遺傳標記。本研究通過 FISH 技術將 45S rDNA 定位于白緣魚央有絲分裂中期 5 號染色體的中部著絲粒處，但是否與 45S rDNA 位于染色體上核仁組織區(qū)(NORs)相一致，還有待進一步研究證實。

5S rDNA在染色體上的位置不像 45S rDNA 那樣有與核仁相連系的明顯的特征，關于它的定位，在不同物種間差異較大。在一些魚類中，發(fā)現 5S rDNA 分布于性染色體上[12，19—20]。本研究發(fā)現，白緣魚央的 5S rDNA 也位于其性染色體上，并且靠近 X 和 Y 染色體的著絲粒處。綜合以前研究，5S rDNA 位于性染色體的這種現象是否就說明其與該物種性染色體相連鎖或與性染色體進化有關，或者說與性別決定或性別分化有關，都有待于今后進一步的深入研究和探討。

參考文獻：

[1]成慶泰，鄭葆珊. 中國魚類系統(tǒng)檢索(上冊)[M]. 北京: 科學出版社，1987: 217-218.

Cheng Qingtai，Zheng Baoshan. The Fish Retrieval System (volume one)[M]. Beijing: Science Press，1987: 217-218.

[2]龍華. 青藏高原淡水魚類的研究現狀[J]. 水利漁業(yè)，2004，24(5): 5-7.

Long Hua. Research status and development prospect of freshwater fish in Qingzang Plateau[J]. Reservoir Fisheries，2004，24(5): 5-7.

[3]余先覺，周暾，李康，等. 中國淡水魚類染色體[M]. 北京: 科學出版社，1989.

Yu Xianjue，Zhou Tun，Li Kang，et al. The Chromosomes of Freshwater Fishes in China[M]. Beijing: Science Press，1989.

Long Hua，Wang Dengqiang. Analysis on karyotype of leiobagrus marginatus(Günther)[J]. Freshwater Fisheries，2004，34(2): 9-10.

[5]Cross I，Merlo A，Manchado M，et al. Cytogenetic characterization of the soleSoleasenegalensis(Teleostei: Pleuronectiformes: Soleidae): Ag-NOR，(GATA)n，(TTAGGG)nand ribosomal genes by one-color and two-color FISH[J]. Genetica，2006，128(1/3): 253-259.

[6]徐延浩，李立家. 花生45S rDNA和5S rDNA的染色體定位研究[J]. 武漢植物學研究，2010，28(6): 649-653.

Xu Yanhao，Li Lijia. Physical mapping of the 45S rDNA and 5S rDNA in the Peanut (ArachishypogaeaL.)[J]. Journal of Wuhan Botanical Research，2010，28(6): 649-653.

[7]屈良鵠，余小強，洪德元，等. 萬年青Ls-rRNA 5’端核苷酸序列及進化意義[J]. 植物分類學報，1990，28(6): 425-429.

Qu Lianghu，Yu Xiaoqiang，Hong Deyuan，et al. Ls-rRNA 5’Nucleotide sequence ofRohdeajaponica(Liliaceae) and its evolutionary significance[J]. Acta Phytotaxonomica Sinica，1990，28(6): 425-429.

[8]Almeida-Toledo L F，Ozouf-Costaz C，Foresti F，et al. Conservation of the 5S-bearing chromosome pair and co-localization with major rDNA clusters in five species ofAstyanax(Pisces，Characidae)[J]. Cytogenet Genome Res，2002，97(3/4): 229-233.

[10]Martins C，Galetti P M Jr. Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish species: is it a general rule for fishes？[J]. Genetica，2001，111(1/3): 439-446.

[11]Sola L，Rossi A R，Annesi F，et al. Cytogenetic studies inSpratusauratus(Pisces，Perciformes): molecular organization of 5S rDNA and chromosomal mapping of 5S and 45S ribosomal genes and of telomeric repeats[J]. Hereditas，2003，139(3): 232-236.

[12]Ota K，Tateno Y，Gojobori T. Highly differentiated and conserved sex chromosome in fish species (Aulopusjaponicus: Teleostei，Aulopidae)[J]. Gene，2003，317: 187-193.

[13]Pisano E，Ghigliotti L，Mazzei F，et al. Mapping of 5S ribosomal genes revealed independent evolution of sex-linked heterochromosomes in two closely related teleostean species，Pagetopsis macropterus and Chionodraco hamatus (suborder Notothenioidei，family Channichthyidae)[J]. Annales de Génétique，2003，46: 98.

[14]Iturra P，Lam N，de la Fuente M，et al. Characterization of sex chromosomes in rainbow trout and coho salmon using fluorescenceinsituhybridization (FISH)[J]. Genetica，2001，111(1/3): 125-131.

[15]何世斌，柴連琴，譚珺雋，等. 熒光原位雜交技術的研究進展[J]. 植物科學學報，2014，32(2): 199-204.

He Shibin，Chai Lianqin，Tan Junjun，et al. Recent advances in fluorescenceinsituhybridization[J]. Plant Science Journal，2014，32(2): 199-204.

[16]徐延浩，楊飛，程有林，等. 45S rDNA和5S rDNA在南瓜、絲瓜和冬瓜染色體上的比較定位[J]. 遺傳，2007，29(5): 614-620.

Xu Yanhao，Yang Fei，Cheng Youlin，et al. Comparative analysis of rDNA distribution in metaphase chromosomes of Cucurbitaceae species[J]. Hereditas，2007，29(5): 614-620.

[17]余先覺，周暾，李渝成，等. 中國淡水魚類染色體[M]. 北京: 科學出版社，1989: 120-122，135-136，162.

Yu Xianjue，Zhou Tun，Li Yucheng，et al. The Chromosomes of Freshwater Fishes in China[M]. Beijing: Science Press，1989: 120-122，135-136，162.

[18]周愛芬，徐春暉，向鳳寧，等. 應用5S rDNA間隔序列分析鑒定體細胞雜種[J]. 生物工程學報，1999，15(4): 529-532.

Zhou Aifen，Xu Chunhui，Xiang Fengning，et al. Study on the identification of somatic hybrids by PCR with 5S rDNA spacer sequence primers[J]. Chinese Journal of Biotechnology，1999，15(4): 529-532.

[19]Moran P，Martinez J L，Garcia-Vazquez E，et al. Sex chromosome linkage of 5S rDNA in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)[J]. Cytogenet Cell Genet，1996，75(2/3): 145-150.

[20]Stein I，Phillips R B，Devlin R H. Identification of the Y chromosome in chinook salmon (Oncorhynchustshawytscha)[J]. Cytogenet Cell Genet，2001，92(1/2): 108-110.

The amplification and FISH analysis of 5S rDNA in Liobagrus marginatus

Zhang Weiwei1，Fu Yuanshuai2，Shao Yan1，Wang Baoqin1，Shi Dongli1，Zhang Lan1

(1.ShandongProvincialEngineeringandTechnologyResearchCenterforWildPlantResourcesDevelopmentandApplicationofYellowRiverDelta，BinzhouUniversity，Binzhou256603，China；2.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract:In present research，5S rDNA was amplified by the usual 5S rDNA primers in Genomic DNA of female and male Liobagrus marginatus，and sequenced. The results of amplification showed that there were not different in 5S rDNA between female and male of L.marginatus，and length of 5S rDNA was 117 bp. Using the method of double color Fluorescence In situ Hybridization (FISH)，5S rDNA and 45S rDNA on metaphase chromosomes were located in L.marginatus. The results showed that 5S rDNA and 45S rDNA were located on sex chromosome and the 5th chromosome，respectively. Phylogenetic tree of 5S rDNA in L.marginatus and 22 fishes else was constructed by DNAman，so evolution position of L.marginatus in fishes was studied preliminarily. This study offer data accumulating and basis of analysis，to illustrate phyletic evolution of fishes and repeat sequences on sex chromosome，and relation of heterochromatin or repeat sequences and sex determination & differentiation in vertebrates．

Key words:Liobagrus marginatus; PCR; 5S rDNA; phylogenetic tree; chromosome; FISH

收稿日期：2015-06-03；

修訂日期：2015-12-24。

基金項目：國家自然科學基金項目(31400401)；山東省自然科學基金項目(ZR2013EML002)；山東省科技發(fā)展計劃項目(2011YD21020)。

作者簡介：張偉偉(1981—)，女，山東省淄博市人，講師，主要研究方向為動物分子細胞遺傳。E-mail:wwzhang1225@163.com

中圖分類號:S917.4

文獻標志碼：A

文章編號：0253-4193(2016)06-0082-07

Zhang Weiwei，Shao Yan，Wang Baoqin，et al. The amplification and FISH analysis of 5S rDNA inLiobagrusmaginatus[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(6)：82—88，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.06.009