□ 陶文靖 曲連海 賈晨 劉磊 北京良潤(rùn)生物科技有限公司□ 高琦 小池 尹艷 北京熱景生物技術(shù)有限公司□ 王文博 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所

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M-FASTTM（磁在快）沙門氏菌測(cè)試盒在沙門氏菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究

□ 陶文靖 曲連海 賈晨 劉磊 北京良潤(rùn)生物科技有限公司
□ 高琦 小池 尹艷 北京熱景生物技術(shù)有限公司
□ 王文博 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所

摘 要：據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)研究部門最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，沙門氏菌每年在美國(guó)導(dǎo)致的醫(yī)療花費(fèi)達(dá)到37億美元，這個(gè)數(shù)據(jù)將沙門氏菌排在了美國(guó)食源性疾病花費(fèi)最高的15大致病菌之首。另外，一系列沙門氏菌引起的食物中毒事件也表明，沙門氏菌早已成為全球最常見的食源性致病菌之一。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)存在耗時(shí)、繁瑣、低效等缺點(diǎn)，故快速、靈敏、可靠的新型快速檢測(cè)技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。將免疫學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)有機(jī)結(jié)合，利用微生物特異性免疫磁珠和微生物測(cè)試片實(shí)現(xiàn)待檢致病菌的雙重篩選，大大提高了沙門氏菌檢測(cè)的特異性，靈敏度明顯高于同類產(chǎn)品，并大幅度縮短檢測(cè)時(shí)間。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌 食源性致病菌 免疫磁珠 測(cè)試片

世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件接連發(fā)生，食品安全形勢(shì)嚴(yán)峻，衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)公告的食物中毒人數(shù)逐年遞增，且食源性致病菌引起的占據(jù)首位［1］。據(jù)WHO估計(jì)，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物所引起［2］。沙門氏菌主要污染肉及肉制品、蛋制品、奶制品等，雞是沙門氏菌的天然宿主，感染了沙門氏菌的雞肉制品是引起人沙門氏菌感染的主要途徑。市場(chǎng)上的零售雞肉，沙門氏菌陽(yáng)性檢出率高達(dá)50%。所以，開發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確的食源性致病菌快速檢測(cè)方法已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關(guān)鍵。

1　沙門氏菌檢測(cè)方法

國(guó)標(biāo)規(guī)定，食品中沙門氏菌的檢測(cè)主要是培養(yǎng)法和生理生化檢測(cè)法，該檢測(cè)法的特點(diǎn)是方法經(jīng)典，但缺點(diǎn)是操作繁瑣、試劑繁多、耗時(shí)較長(zhǎng)，一個(gè)完整檢測(cè)周期需要大約5～7天時(shí)間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能夠滿足檢測(cè)要求。目前，應(yīng)用較多的快速檢測(cè)法主要是即用培養(yǎng)法、免疫學(xué)法、分子生物學(xué)方法等。免疫學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是特異性高、耗時(shí)間短、結(jié)果可靠，適合批量檢測(cè)和自動(dòng)化檢測(cè)；依賴于專業(yè)儀器分子學(xué)方法的優(yōu)勢(shì)是靶標(biāo)明確、時(shí)間短、結(jié)果可靠，明顯的不足則是引物和探針的選擇及設(shè)計(jì)不當(dāng)，可能降低靈敏度和特異性［3］；技術(shù)設(shè)備要求高，熒光探針價(jià)格昂貴，另外容易造成交叉污染是核酸法不能回避的問(wèn)題等。

因此，設(shè)計(jì)和開發(fā)出特異性好、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便的沙門氏菌快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)于食品安全領(lǐng)域的微生物快速檢測(cè)具有重要意義。

2　磁在快沙門氏菌測(cè)試盒原理

免疫磁性分離技術(shù)，又稱為免疫磁珠法，可直接從樣品或前增菌培養(yǎng)物中分離目的細(xì)菌。磁珠上包被能夠特異識(shí)別目標(biāo)細(xì)菌的抗體，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)從而形成一個(gè)磁珠和細(xì)菌的復(fù)合體，再通過(guò)磁場(chǎng)將磁珠收集使目標(biāo)菌得到有效地富集和分離［4］，大大縮短前增菌時(shí)間。

微生物測(cè)試片是應(yīng)用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法和現(xiàn)代生化鑒定技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)。測(cè)試片的載體中含有可供目標(biāo)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分，選擇劑以及特異酶顯色底物，通過(guò)直接觀察菌落顏色即可對(duì)細(xì)菌種類做出鑒定，是一種簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。

磁在快檢測(cè)試劑盒將兩種檢測(cè)方法結(jié)合，通過(guò)特異性免疫磁珠和微生物測(cè)試片對(duì)微生物進(jìn)行雙重篩選，提高了沙門氏菌檢測(cè)的特異性。對(duì)于食品檢測(cè)中的復(fù)雜樣本，通過(guò)免疫磁珠的富集，能夠有效去除干擾檢測(cè)的雜質(zhì)，并對(duì)樣本具有濃縮作用，靈敏度明顯高于同類產(chǎn)品，大幅度縮短增菌時(shí)間，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在24h內(nèi)可完成。同時(shí)，操作簡(jiǎn)單，不需要大型設(shè)備，可以節(jié)約空間、降低檢測(cè)成本。

3　磁在快沙門氏菌測(cè)試盒驗(yàn)證方案

選取沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離株按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，同時(shí)計(jì)數(shù)，稀釋到測(cè)試所需濃度（100CFU/mL）。

磁在快測(cè)試方法為：取1mL分別加入到2mL的富集管中，放置37℃，150rpm/min震蕩孵育15min，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門氏菌測(cè)試片上，37℃，培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)數(shù)所有測(cè)試片上顯示出藍(lán)色的菌落。

對(duì)照方法為將1mL菌液直接涂布于LB平板中，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)所有生長(zhǎng)菌落。

3.2不同菌濃度的回收效率

選取鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，同時(shí)計(jì)數(shù)，梯度稀釋，每個(gè)稀釋度取1mL，按照3.1所示方法進(jìn)行測(cè)定。

3.3不同體積的回收效率

選取鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，同時(shí)計(jì)數(shù)，稀釋到100CFU/mL，100 CFU/5ml，100 CFU/10ml，100CFU/25ml，按照3.1所示方法進(jìn)行測(cè)定。

在文化保護(hù)視角下對(duì)鄉(xiāng)村空間進(jìn)行改造，可以促使鄉(xiāng)村與城鎮(zhèn)之間協(xié)調(diào)發(fā)展，達(dá)到城鎮(zhèn)與鄉(xiāng)村空間融合的發(fā)展目標(biāo)。城鄉(xiāng)統(tǒng)籌規(guī)劃是鄉(xiāng)村空間改造的立足點(diǎn)，整合重點(diǎn)城鎮(zhèn)發(fā)展空間是鄉(xiāng)村空間改造的關(guān)鍵，整治村莊生產(chǎn)與生活空間是鄉(xiāng)村空間改造的重點(diǎn)，改造傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)是鄉(xiāng)村空間改造的重要內(nèi)容。

3.4生鮮乳和豬肉中沙門氏菌的檢測(cè)方法

生鮮乳樣品20份，采自北京某奶廠，4℃進(jìn)行保藏；豬肉樣品20份，購(gòu)于北京某批發(fā)市場(chǎng)。

生鮮乳：取樣品25mL，加入磁珠，震蕩15min，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門氏菌測(cè)試片上，37℃，培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)數(shù)所有測(cè)試片上顯示出藍(lán)色的菌落。

豬肉：取樣品25g，用20mLBPW均質(zhì)，將均質(zhì)液加入磁珠富集管中，37℃，震蕩4h，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻，磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門氏菌測(cè)試片上，37℃，培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)數(shù)所有測(cè)試片上顯示出藍(lán)色的菌落。

對(duì)照方法：取樣25g，按照GB 4789.4-2010的方式進(jìn)行測(cè)定。

4　結(jié)果分析

4.1識(shí)別性和特異性

通過(guò)檢測(cè)，磁在快檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)沙門氏菌A、B、C、D、E不同血清型及常見沙門氏菌均可以有效富集及擴(kuò)增（富集率＞75%），對(duì)干擾菌大腸桿菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌均能有效的抑制（均未生長(zhǎng)），方法識(shí)別性和特異性良好。

表1　磁在快沙門氏菌檢測(cè)試劑盒識(shí)別性

4.2不同菌濃度的回收效率

經(jīng)測(cè)定，初始菌濃度為1.3×106CFU/mL，通過(guò)不同菌濃度測(cè)試，磁在快檢測(cè)系統(tǒng)磁珠富集容量大于5×105CFU/mL，同時(shí)菌濃度處于10～105CFU/mL時(shí)，菌的回收率均大于85%。

表2　不同濃度沙門氏菌回收率

4.3不同體積的回收效率

結(jié)果顯示，隨著體積的增大，磁在快檢測(cè)方法的回收率略有下降，從91.6%下降為78.8%，但是回收率仍大于75%，符合測(cè)試要求。

表3　不同體積沙門氏菌回收率

4.4生鮮乳和豬肉中沙門氏菌的檢測(cè)方法

檢測(cè)樣本也同時(shí)采用了國(guó)標(biāo)法對(duì)樣本進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，本實(shí)施例中的測(cè)試結(jié)果與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果一致。各樣本的定性檢測(cè)結(jié)果如表4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示20例豬肉樣本中有5例檢出含有沙門氏菌，20例牛奶樣本有0例檢出含有沙門氏菌。

經(jīng)過(guò)比對(duì)，4份樣品磁在快方法和GB 4789.4-2010方法一致，1份不一致從磁在快測(cè)試片挑取菌落經(jīng)鑒定為沙門氏菌。

表4　鮮奶和肉樣品中沙門氏菌的定性檢測(cè)

5　結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，磁在快檢測(cè)方法對(duì)沙門氏菌的捕獲率均在80%以上，并有較高的特異性；免疫學(xué)結(jié)合生物化學(xué)技術(shù)快檢方法與國(guó)標(biāo)法相比較，測(cè)試結(jié)果與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果一致，準(zhǔn)確性無(wú)顯著性差異，靈敏度達(dá)到10個(gè)cfu以下。測(cè)試片可直接觀察菌落顏色即可對(duì)菌類做出鑒定，是一種高效、精準(zhǔn)、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法。免疫學(xué)結(jié)合生物化學(xué)技術(shù)快檢方法優(yōu)化了食品安全檢測(cè)人員的工作方式，提高工作效率和檢測(cè)可信度，對(duì)于中國(guó)食品安全的發(fā)展具有重大意義。

6　展望

食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)在不斷的發(fā)展和創(chuàng)新過(guò)程中，每種技術(shù)都有各自的優(yōu)勢(shì)。多種技術(shù)的聯(lián)用可大大提高檢測(cè)的靈敏度，并縮短檢測(cè)時(shí)間。隨著微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，各種多功能微生物檢測(cè)系統(tǒng)的研發(fā)正逐步成為熱點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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［3］ 石曉路，扈慶華，張佳峰，等.多重實(shí)時(shí)PCR 快速同時(shí)檢測(cè)沙門菌和志賀菌［J］.中華流行病學(xué)雜志，2006，27（12）：1053-1056.

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