宗乾坤，徐麗娟，呂利群

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

嗜水氣單胞菌性鯽敗血癥的鹽酸沙拉沙星用藥方案研究

宗乾坤，徐麗娟，呂利群

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

[摘要]【目的】 研究鹽酸沙拉沙星在鯽魚體內(nèi)的藥代學(xué)、藥效動(dòng)力學(xué)聯(lián)合參數(shù)，確定鹽酸沙拉沙星治療鯽魚細(xì)菌性疾病的防耐藥突變用藥方案?！痉椒ā?測(cè)定鹽酸沙拉沙星對(duì)嗜水氣單胞菌的體外最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)、抗菌后效應(yīng)(PAE)、防耐藥突變濃度(MPC)和防耐藥突變選擇窗(MSW)；給鯽經(jīng)口灌服不同劑量(20，30，40 mg/kg)的鹽酸沙拉沙星,于給藥后0.5，1，2，4，6，8，10，12，16，24，48 h取血清及肌肉樣品，研究鹽酸沙拉沙星在鯽魚體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，然后結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)結(jié)果,確定鹽酸沙拉沙星防治嗜水氣單胞菌引起的鯽魚細(xì)菌性敗血癥的合理給藥方案?！窘Y(jié)果】 鹽酸沙拉沙星對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC為0.5 μg/mL，MBC為2.0 μg/mL，MPC為2.5 μg/mL，MSW為0.5～2.5 μg/mL。按20，30，40 mg/kg劑量給鯽魚經(jīng)口灌服鹽酸沙拉沙星后,鯽魚體內(nèi)的血藥質(zhì)量濃度大于MPC的維持時(shí)間分別為0，4.0，24.0 h；AUC24/MIC分別為8.44，78.20，164.96；Cmax/MIC 分別為4.496，6.662，15.294?！窘Y(jié)論】 40 mg/kg灌服劑量能使鯽的血藥濃度維持在MPC以上的時(shí)間 ≥(24-PAE) h、AUC24/MIC≥100或Cmax/MIC>8,因此建議鹽酸沙拉沙星防治嗜水氣單胞菌引起的鯽魚細(xì)菌性敗血癥的防突變用藥方案為：給藥劑量40 mg/kg，每日給藥1次，休藥期不低于10 d。

[關(guān)鍵詞]鯽；鹽酸沙拉沙星；防耐藥突變濃度；嗜水氣單胞菌；藥代動(dòng)力學(xué)；藥效動(dòng)力學(xué)

Medication regimen of Sarafloxacin againstAeromonashydrophila

infection in crucian carp (Carassiusauratus)

ZONG Qian-kun,XU Li-juan,Lü Li-qun

鯽(Carassiusauratus)因肉味鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，是我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖品種。鯽在我國(guó)分布廣泛，其環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)，但近年來(lái)隨著集約化高密度養(yǎng)殖模式的快速推廣，養(yǎng)殖水體環(huán)境持續(xù)惡化，鯽的各種病害尤其是細(xì)菌性疾病時(shí)常發(fā)生，嚴(yán)重阻礙了鯽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。在細(xì)菌性病原中，嗜水氣單胞菌作為一種主要的致病性細(xì)菌[2]，極易感染魚只，且致死率較高。鹽酸沙拉沙星(Sarafloxacin)是第3代喹諾酮(Quinolones)類化合物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、吸收快、生物利用度高、組織分布廣、半衰期長(zhǎng)、殘留少等特點(diǎn)[3]，其作用點(diǎn)是細(xì)菌的細(xì)胞核，與其他氟喹諾酮類藥物不會(huì)產(chǎn)生明顯的交叉耐藥性[4],因此適用于鯽魚細(xì)菌性疾病的防治。當(dāng)前針對(duì)鹽酸沙拉沙星的研究很多, 但多是研究其體外藥效學(xué)參數(shù)，即最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)以及其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),并據(jù)此制定給藥方案。如彭家紅等[5]開(kāi)展了鹽酸沙拉沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)研究,并確定了30 mg/kg 的用藥劑量。王翔凌等[6]研究制定了鹽酸沙拉沙星治療鯽魚細(xì)菌出血性敗血病的劑量為每日20 mg/kg,休藥期為14 d。上述研究更多地考慮了臨床藥物療效，卻忽視了臨床中會(huì)產(chǎn)生耐藥突變體的問(wèn)題,所以為了避免鹽酸沙拉沙星在臨床使用中引起致病菌耐藥性問(wèn)題，有必要研究確定防止耐藥菌產(chǎn)生的用藥方案。國(guó)內(nèi)徐麗娟等[7]在制定恩諾沙星用藥方案時(shí)，最先引入了防耐藥突變理論,其主要參考了Dong等[8]和Drlica[9]先后提出的藥物防耐藥突變濃度(Mutant prevention concentration,MPC)和防耐藥突變選擇窗(Mutant selection window,MSW)理論，MPC是抑制細(xì)菌耐藥突變體被選擇性富集所需的最低抗菌藥物濃度，MSW是最低抑菌濃度MIC和MPC之間的濃度范圍[7]。防耐藥突變理論提供了一個(gè)遏制細(xì)菌耐藥的新策略,也為鹽酸沙拉沙星臨床使用方案研究提供了更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)依據(jù)。

本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的致病性嗜水氣單胞菌(AH10)為試驗(yàn)菌株[10]，測(cè)定了鹽酸沙拉沙星對(duì)AH10的體外藥效學(xué)參數(shù)(包括MPC、MSW)及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，制定了鹽酸沙拉沙星治療鯽魚細(xì)菌性疾病的防耐藥用藥方案,以期為鹽酸沙拉沙星的臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)用鯽魚(體質(zhì)量120～170 g/尾)，從上海南匯某養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)得，挑選健康的個(gè)體，暫養(yǎng)于0.4 m×0.5 m×1.0 m 的水族箱內(nèi)，試驗(yàn)水溫(22±1) ℃。嗜水氣單胞菌(菌株代號(hào)為AH10)，由上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)分離保存。

1.2主要試劑與儀器

鹽酸沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.0%，購(gòu)于Sigma 公司；鹽酸沙拉沙星原料藥，純度≥97%，購(gòu)于南京精瑞久安生物技術(shù)有限公司；乙腈(色譜純)、二氯甲烷(分析純)、四丁基溴化銨(分析純)、正己烷(分析純)，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器有Agilent 1100 高效液相色譜儀(配有紫外檢測(cè)器)、渦旋振蕩器、高速離心機(jī)和水浴鍋等。

1.3鹽酸沙拉沙星對(duì)嗜水氣單胞菌的體外藥效試驗(yàn)

1.3.1MIC和MBC的測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]的方法測(cè)定鹽酸沙拉沙星的MIC和MBC，試驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

1.3.2體外抗菌后效應(yīng)的測(cè)定抗菌后效應(yīng)(Post-anti-biotic effect,PAE)參考劉遠(yuǎn)飛[12]的方法測(cè)定。試驗(yàn)設(shè)置試驗(yàn)組T1、T2、T3及對(duì)照組C1和殘留對(duì)照組C2，各組菌液(細(xì)菌含量均為107CFU/mL)中鹽酸沙拉沙星的含量分別為2MIC、4MIC、8MIC、0MIC和0.08MIC。所有處理組菌液于30 ℃恒溫孵育1 h，然后采用400倍稀釋法除藥，取上述各試驗(yàn)組菌液0.1 mL，分別加到含有1.9 mL 30 ℃預(yù)熱的MH肉湯中并混勻，同樣的過(guò)程再重復(fù)1次即達(dá)到400倍的除藥效果，各管混勻后于30 ℃恒溫孵育。于除藥后0，1，2，3，4，5和6 h時(shí)分別對(duì)每組進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，重復(fù)3次取平均值。繪制除藥后的細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，計(jì)算PAE：PAE=T-C，其中T、C分別為試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)菌含量等于重建后達(dá)到10倍初始含量(即0 h細(xì)菌含量)所需的時(shí)間。

1.3.3MPC、MSW的測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]，分別配制鹽酸沙拉沙星質(zhì)量濃度為1MIC、2MIC、3MIC、4MIC、5MIC、6MIC、7MIC、8MIC、9MIC、10MIC的瓊脂平板備用。挑取單個(gè)AH10菌落接種于MH肉湯過(guò)夜培養(yǎng)，3 000 r/min離心5 min，細(xì)菌沉淀用10倍體積的原液MH肉湯懸浮，振蕩培養(yǎng)6 h，3 000 r/min離心5 min后將細(xì)菌含量調(diào)整為3×1010CFU/mL。各管分別取100 μL濃度為3×1010CFU/mL的菌液，均勻涂抹在含上述質(zhì)量濃度鹽酸沙拉沙星藥物的瓊脂平板上，每種藥物濃度涂抹4個(gè)平板，使得單個(gè)平板的細(xì)菌總接種量達(dá)到3×109CFU。30 ℃孵育，72 h后無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物質(zhì)量濃度即為鹽酸沙拉沙星對(duì)致病菌AH10的MPC，MPC與MIC之間的質(zhì)量濃度范圍即為MSW。試驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

1.4鹽酸沙拉沙星在鯽魚體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立樣品定量采用外標(biāo)試驗(yàn)法。準(zhǔn)確稱取0.02 g鹽酸沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，用足量0.1 moL/L氫氧化鈉溶液溶解，配制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的鹽酸沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋成200，50，20，10，1，0.5，0.1，0.05 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)質(zhì)量濃度取3組平行的樣品，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾于樣品瓶中，分別進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)。以HPLC峰面積為縱坐標(biāo)(y)、藥物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程并確定相關(guān)系數(shù)。

1.4.2給藥與樣品采集取配制好的藥物，按20，30，40 mg/kg的劑量經(jīng)口灌入鯽魚前腸，選擇無(wú)回吐者用于試驗(yàn)。于給藥后0.5，1，2，4，6，8，10，12，16，24，48 h尾靜脈采集鯽魚血液2.0 mL/尾，同時(shí)取肌肉樣品2.0 g/尾，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集血液和肌肉樣品各5份。血液樣品置1.5 mL離心管中于4 ℃靜置8 h，離心后取上層血清置新的離心管中；肌肉組織保存在樣品袋中，所有樣品均于-20 ℃保存。同時(shí)采集未用藥的空白樣品作為對(duì)照。

1.4.3樣品處理與檢測(cè)參考王翔凌等[6]的方法，將冷凍保存的鯽魚血清、肌肉樣品自然解凍，分別取血清1 mL和肌肉組織2 g于50 mL離心管中，按 1∶1 (血清樣品為體積比，肌肉樣品為質(zhì)量(g)體積(mL)比)分別加入1 moL/L氯化鈉溶液，按1∶5(血清樣品為體積比，肌肉樣品為質(zhì)量(g)體積(mL)比)分別加入二氯甲烷，混合2 min，液體快速混合器上中速混合10 min，12 000 r/min離心10 min，棄去上層水相，將下層有機(jī)相倒入15 mL具塞離心管中，向殘?jiān)俅渭尤胍陨显噭?，試劑量減半，重復(fù)以上操作步驟，進(jìn)行第二次萃取。合并2次萃取所得的有機(jī)相，在60 ℃恒溫水浴鍋中蒸干。蒸殘物用流動(dòng)相(1 mL)溶解，渦旋混合器上混勻2 min，加入2 mL正己烷去脂，液體快速混合器上混勻10 min，12 000 r/min離心10 min，棄去上層液體，下層再次加入相同體積的正己烷進(jìn)行第2次去脂，混勻，離心后取下清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相一次性針頭過(guò)濾器過(guò)濾后，4 ℃保存待測(cè)。

參考邱銀生等[14]的方法進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：色譜柱為RP-ODS C18分析柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-2%四丁基溴化銨溶液(V(乙腈)∶V(2%四丁基溴化銨)=1∶9)，用磷酸調(diào)pH 至2.5，流速為1.2 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.4.4回收率和精密度分別取100，10，1 μg/mL鹽酸沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液各100 μL，分別加入到1 g的空白肌肉或1 mL血清中，使其理論藥物含量分別為10，1，0.1 μg/g (肌肉)或10，1，0.1 μg/mL(血清)，按照上述樣品處理方法處理后進(jìn)行HPLC分析，測(cè)算鹽酸沙拉沙星的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，計(jì)算相對(duì)回收率(相對(duì)回收率=樣品實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度/樣品理論質(zhì)量濃度×100%)。為了衡量檢測(cè)方法的精密度，在1 d內(nèi)的3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)上述樣品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，并連續(xù)3 d重復(fù)檢測(cè)，以此來(lái)計(jì)算檢測(cè)方法的日內(nèi)平均變異系數(shù)和日間平均變異系數(shù)：變異系數(shù)(CV)=S/X×100%，其中S為標(biāo)準(zhǔn)偏差，X為平均值。

1.5數(shù)據(jù)處理

用Excel對(duì)Agilent 1100 高效液相色譜儀得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，應(yīng)用 Kinetic 4.4 藥代動(dòng)力學(xué)軟件擬合藥代動(dòng)力學(xué)模型，計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1鹽酸沙拉沙星對(duì)嗜水氣單胞菌的體外藥效學(xué)研究

2.1.1MIC、MBC和PAE的測(cè)定根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以得出，鹽酸沙拉沙星對(duì)嗜水氣單胞菌AH10的MIC為0.5 μg/mL， MBC為2.0 μg/mL。藥物濃度分別為2MIC、4MIC、8MIC的鹽酸沙拉沙星藥液與嗜水氣單胞菌AH10菌懸液接觸1 h后，用400倍稀釋除藥法去除鹽酸沙拉沙星，對(duì)照組C1與殘留藥物對(duì)照組C2中的細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線幾乎一致(圖1),表明400倍稀釋足以除去藥物。2MIC、4MIC和8MIC 處理的PAE分別為1.12，1.51，1.92 h，表明隨著藥物濃度的升高PAE明顯延長(zhǎng)。

圖 1　鹽酸沙拉沙星作用1 h除去藥物后

2.1.2MPC、MSW的測(cè)定鹽酸沙拉沙星對(duì)嗜水氣單胞菌(AH10)的MPC為2.5 μg/mL，MSW為0.5～2.5 μg/mL，表明當(dāng)鹽酸沙拉沙星藥物質(zhì)量濃度為0.5～2.5 μg/mL時(shí)會(huì)產(chǎn)生耐藥突變菌株，只有當(dāng)藥物濃度高于2.5 μg/mL時(shí)，才能抑制突變菌株的出現(xiàn)，達(dá)到完全殺菌的效果。

2.2鹽酸沙拉沙星在鯽魚體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

2.2.1 鹽酸沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)工作曲線以鹽酸沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x)，以其HPLC峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖 2　鹽酸沙拉沙星的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

由圖2可知，鹽酸沙拉沙星的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為y=88.026x+24.038(r=0.999 9)，可見(jiàn)在 0.1～200 μg/mL，鹽酸沙拉沙星的HPLC峰面積與其質(zhì)量濃度呈良好的線性相關(guān)，可以滿足定量分析的需要。

2.2.2回收率和精密度鹽酸沙拉沙星在血清、肌肉中的平均回收率分別為85.81%和82.21%，日內(nèi)變異系數(shù)為1.39%，日間變異系數(shù)為2.89%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度都能夠達(dá)到殘留分析的要求。

2.2.3鹽酸沙拉沙星在鯽魚血清中的代謝規(guī)律對(duì)鯽魚灌服20，30，40 mg/kg劑量的鹽酸沙拉沙星，按各時(shí)間點(diǎn)采樣后，經(jīng)Agilent 1100 高效液相色譜檢測(cè)儀檢測(cè)出鹽酸沙拉沙星的藥物峰時(shí)間數(shù)據(jù)，擬合藥-時(shí)曲線。結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，不同灌服劑量下，鹽酸沙拉沙星在鯽魚血清中的含量變化呈先上升后又下降的變化趨勢(shì)，分別灌服20，30，40 mg/kg劑量鹽酸沙拉沙星后鯽血清內(nèi)的藥物質(zhì)量濃度迅速上升，分別在1，4，1 h時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)藥物質(zhì)量濃度分別為1.230，4.124，7.021 μg/mL，此后隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)藥物質(zhì)量濃度開(kāi)始下降，48 h后藥物質(zhì)量濃度低于2.0 μg/mL(圖3)。3個(gè)不同用藥劑量相比，隨著給藥劑量的增加，血清中的藥物質(zhì)量濃度也隨之增大。

圖 3　不同給藥劑量下鯽血清中

2.2.4鹽酸沙拉沙星在鯽魚血清和肌肉中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定在不同給藥劑量下，對(duì)鹽酸沙拉沙星在鯽魚血清中的藥時(shí)數(shù)據(jù)用 Kinetica 4.4 軟件進(jìn)行房室模型擬合。結(jié)果(表1，表2)表明，在3種灌服劑量下，鹽酸沙拉沙星在鯽魚血清中的藥物代謝均屬于一級(jí)吸收二室模型，而在肌肉中則屬于一級(jí)吸收一室模型。

表 1　鹽酸沙拉沙星在鯽魚血清和肌肉中的藥代動(dòng)力學(xué)方程

注：C.藥物含量(μg/mL 或μg/g)；t.給藥后時(shí)間(h)。

Note:C.Concentration of drug (Unit: μg/mL or μg/g);t.Time after administration.

表 2　鹽酸沙拉沙星在鯽魚血清和肌肉中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注：A.分布相零時(shí)截距；B.消除相零時(shí)截距；α.分布速率常數(shù)；β.消除速率常數(shù)；Ka.吸收速率常數(shù)；Kel.藥物在中央室的消除速率常數(shù)；T1/2α.分布半衰期；T1/2β.消除半衰期；Tmax.達(dá)峰時(shí)間；MRT.平均滯留時(shí)間；Cmax.達(dá)峰濃度；AUC24.0～24 h藥時(shí)曲線下面積；AUC.藥時(shí)曲線下總面積；CLs.總體清除率；Vd.表觀分布容積；S1、S2、S3.分別為灌服20，30，40 mg/kg鹽酸沙拉沙星的血清樣品；M.灌服40 mg/kg鹽酸沙拉沙星的肌肉樣品。

Note:A.Intercept of the linear equation on log transformed data;B.Slope of the linear equation on log transformed data;α.Distribution rate constant;β.Elimination rate constant from the central compartment;Ka.Absorption rate constant;Kel.Elimination rate constant from the central compartment;T1/2α.Half-life of distribution;T1/2β.Half-life of elimination;Tmax.Time required to reachCmaxin the interval;MRT.Mean residue time of drug in body;Cmax.Maximum concentration in the interval;AUC24.Area under the drug concentration-time curve from the time zero to twenty-four;AUC.Area under the drug concentration-time curve from the time zero to last time point;CLs.Total body clearance;Vd.The apparent volume of distribution during the terminal phase;S1,S2,and S3.The serum of crucian carp after administration of Sarafloxacin at 20,30,40 mg/kg body weight,respectively;M.The muscle samples of crucian carp after administration of Sarafloxacin at 40 mg/kg body weight.

2.2.5藥代/藥效動(dòng)力學(xué)聯(lián)合參數(shù)研究不同灌服劑量的鹽酸沙拉沙星在鯽魚血清中的PK-PD聯(lián)合參數(shù)見(jiàn)表3和圖4。表3顯示，按20，30，40 mg/kg劑量灌服鹽酸沙拉沙星后，鯽魚體內(nèi)的AUC24/MIC分別為8.44，78.20，164.96；Cmax/MIC 分別為4.496，6.662，15.294；圖4顯示，從血藥濃度>MPC的持續(xù)時(shí)間來(lái)看，20 mg/kg給藥劑量下的時(shí)間為0 h，30 mg/kg給藥劑量下的時(shí)間為4 h，40 mg/kg給藥劑量下可以持續(xù)近24 h。由此可確定最佳的給藥劑量為40 mg/kg，每日給藥1次，根據(jù)治療效果連續(xù)給藥3～5 d。

表 3　PK-PD聯(lián)合模型的主要相關(guān)參數(shù)

圖 4　不同灌服劑量下鯽血清中的鹽酸沙拉沙星質(zhì)量濃度及MIC、MPC與MSW

2.2.6鯽休藥期的確定為了確保市場(chǎng)上食用水產(chǎn)品的安全，國(guó)家或者國(guó)際上通常會(huì)制定一些針對(duì)水產(chǎn)品中藥物最大殘留限量(MRL)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)此并結(jié)合動(dòng)物對(duì)藥物的殘留消除規(guī)律人們可確定藥物的休藥期。我國(guó)暫時(shí)還未制定鹽酸沙拉沙星在水產(chǎn)上的MRL標(biāo)準(zhǔn)，但是根據(jù)歐盟(EEC)的規(guī)定，魚肌肉中鹽酸沙拉沙星的MRL為30.0 μg/kg。休藥期通常根據(jù)藥物允許殘留量以及藥物在食用動(dòng)物組織中的消除速度來(lái)確定，本研究將肌肉組織作為藥物殘留的檢測(cè)組織，選取最佳的給藥劑量40 mg/kg來(lái)計(jì)算休藥期。灌服劑量40 mg/kg鹽酸沙拉沙星在鯽肌肉中的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖5。

圖 5　灌服40 mg/kg鹽酸沙拉沙星后鯽肌肉的藥時(shí)曲線

由圖5可知，鹽酸沙拉沙星在鯽肌肉內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間為4 h，達(dá)峰含量為(9.67±0.07) μg/g。根據(jù)推算出的藥動(dòng)學(xué)方程可知，達(dá)到歐盟(EEC)規(guī)定的魚肌肉鹽酸沙拉沙星MRL(30.0 μg/kg)所需的時(shí)間為10 d，殘留量幾乎為0的時(shí)間為50 d。據(jù)此可以確定鹽酸沙拉沙星在水產(chǎn)上的休藥期至少為10 d。

3討論

嗜水氣單胞菌能夠感染各種淡水魚，被感染的魚表現(xiàn)為慢性皮膚潰瘍，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致魚患敗血癥而死亡，給我國(guó)鯽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[2]。鹽酸沙拉沙星屬于喹諾酮類廣譜抗菌藥，由于其較好的臨床應(yīng)用效果而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[3]。本實(shí)驗(yàn)室從瀕死的鯽魚體內(nèi)分離得到1株典型致病嗜水氣單胞菌AH10[10],藥敏試驗(yàn)顯示鹽酸沙拉沙星對(duì)該致病菌具有很好的抗菌作用,所以本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定鹽酸沙拉沙星對(duì)病原菌AH10的體外藥效學(xué)參數(shù)，并結(jié)合其在鯽體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，制定了鹽酸沙拉沙星治療鯽細(xì)菌性疾病的防耐藥用藥方案。

傳統(tǒng)的鹽酸沙拉沙星給藥方案主要依據(jù)藥物的體外藥效學(xué)參數(shù)MIC、MBC以及其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)[5-6]來(lái)確定，這些將PK/PD結(jié)合起來(lái)得到的參數(shù)更多地用于預(yù)測(cè)臨床藥物療效(達(dá)到抑制或者殺滅細(xì)菌的效果)，但是忽視了臨床中耐藥突變體的產(chǎn)生問(wèn)題，因?yàn)镸IC的測(cè)定使用104～105CFU細(xì)菌,而細(xì)菌自發(fā)突變的頻率僅為10-7,因此臨床中參照這樣的測(cè)定參數(shù)易造成耐藥突變菌株的產(chǎn)生。為了解決這一問(wèn)題，近年來(lái)科學(xué)家們提出了MPC和MSW的新理論，認(rèn)為只有當(dāng)藥物的質(zhì)量濃度高于MIC的臨界值即MPC時(shí)，才能達(dá)到完全殺滅病原菌的效果，MIC和MPC之間的范圍即為MSW，MPC、MSW為臨床上抗生素給藥方案的制定提供了新的指導(dǎo),這使得藥物在臨床中達(dá)到治療效果的同時(shí)又能夠抑制耐藥突變菌株的選擇性富集擴(kuò)增, 從而限制了細(xì)菌耐藥現(xiàn)象的進(jìn)一步發(fā)展。在新近的研究中，李夢(mèng)影等[1]和徐麗娟等[7]在制定藥物給藥方案時(shí)成功引入了這一新理論,參考上述研究,本試驗(yàn)在制定鹽酸沙拉沙星治療鯽細(xì)菌性疾病的用藥方案時(shí)采用了MPC、MSW這一新理論, 臨床中參考該用藥方案就能夠在殺滅細(xì)菌的同時(shí)有效避免耐藥菌的出現(xiàn)。

本研究結(jié)合以上藥效學(xué)/藥代學(xué)聯(lián)合模型,同時(shí)根據(jù)徐麗娟等[7]提出的氟喹諾酮類藥物AUC24/MIC≥100或Cmax/MIC>8的標(biāo)準(zhǔn)[15-16]，綜合血藥質(zhì)量濃度在MPC以上的時(shí)間大于(24-PAE)h，以確定臨床中鹽酸沙拉沙星治療鯽細(xì)菌性疾病的防耐藥用藥方案。在經(jīng)口灌服20，30和40 mg/kg給藥劑量下，參考鹽酸沙拉沙星對(duì)嗜水氣單胞菌AH10的體外藥效學(xué)參數(shù)以及不同給藥劑量情況下的藥時(shí)曲線，發(fā)現(xiàn)3種給藥劑量中只有40 mg/kg劑量下血藥質(zhì)量濃度保持在MPC以上的時(shí)間超過(guò)24 h。因此建議鹽酸沙拉沙星治療嗜水氣單胞菌AH10引起的鯽出血性敗血癥的最佳給藥劑量為40 mg/kg，給藥間隔時(shí)間為1 d。根據(jù)其藥動(dòng)學(xué)方程可計(jì)算出達(dá)到歐盟(EEC)規(guī)定的魚肌肉鹽酸沙拉沙星殘留限量(MRL)為30.0 μg/kg所需的時(shí)間為10 d，殘留量幾乎為0的時(shí)間為50 d，所以建議休藥期至少為10 d。

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(NationalPathogenCollectionCenterforAquaticAnimals，CollegeofFisheriesand
LifeScience，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China)
Abstrast: 【Objective】 This study investigatedinvitropharmacodynamics (PD) parameters andinvivopharmacokinetics (PK) parameters to determine the rational dosage of Sarafloxacin in crucian carp (Carassiusauratus).【Method】 The pharmacodynamics of Sarafloxacin onAeromonashydrophilawere studiedinvitroand the parameters were monitored after a single oral gavage of 20,30,and 40 mg per kg body weight to determine a medication regimen to prevent bacterial sepsis in crucian carp.【Result】 The minimal inhibitory concentration (MIC) of Sarafloxacin on AH10 was 0.5 μg/mL,the minimum bactericidal concentration (MBC) was 2.0 μg/mL,the mutant prevention concentration (MPC) was 2.5 μg/mL,and the mutant selection window (MSW) for the pathogenic bacterial strains was 0.5-2.5 μg/mL.The time for Sarafloxacin concentration of >MPC in serum of crucian carp were 0,4.0,and 24.0 h at the dosages of 20,30,and 40 mg/kg,respectively.The AUC24/MIC values were 8.44,78.20 and 164.96,and theCmax/MIC values were of 4.496,6.662,and 15.294,respectively.【Conclusion】 The dosage of 40 mg/kg resulted in MPC≥(24-PAE)h,AUC24/MIC≥100 orCmax/MIC>8.Thus,the applicable regimen for prevention and treatment of bacterial diseases of crucian carp is 40 mg/kg,once per day,and no less than 10 d for withdrawal period.

Key words:Carassius auratus;Sarafloxacin;mutant prevention concentration;Aeromonas hydrophila;pharmacodynamics;pharmacokinetic

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.008

[收稿日期]2014-11-05

[基金項(xiàng)目]農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-46-12)

[作者簡(jiǎn)介]宗乾坤(1991-),男，江蘇溧陽(yáng)人,在讀碩士，主要從事水生動(dòng)物傳染病學(xué)研究。 [通信作者]呂利群(1971-),男，湖北武穴人,教授，博士，主要從事水生動(dòng)物傳染病學(xué)研究。E-mail：lqlv@shou.edu.cn

[中圖分類號(hào)]S943.117.41+3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)06-0046-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.016.html