韋建喬　韋波

[摘要]高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）將高效液相色譜的高分離效能與質(zhì)譜的強(qiáng)大結(jié)構(gòu)測(cè)定功能組合起來(lái)，不僅實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析，而且簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，樣品分析更簡(jiǎn)便，為中藥組分的分析及結(jié)構(gòu)的鑒定提供了一個(gè)重要和全新的技術(shù)支撐。該技術(shù)對(duì)中藥化學(xué)成分的分析及鑒定，中藥指紋圖譜的研究，中藥藥代動(dòng)力學(xué)的研究有應(yīng)用價(jià)值。論述了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，闡述了各方法的特點(diǎn)、應(yīng)用范圍及研究現(xiàn)狀，旨在為中藥研究者提高參考依據(jù)。促進(jìn)中藥研究向現(xiàn)代化的發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；中藥；指紋圖譜；藥代動(dòng)力學(xué)

[中圖分類號(hào)]R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2095-0616（2016）05-44-03

作為一種新的現(xiàn)代技術(shù)分析手段，高效液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)在分離效能、靈敏度和專屬性等方面都有著巨大的優(yōu)勢(shì)，展現(xiàn)出強(qiáng)大的定性、定量分析能力，從而在藥物分析特別是中藥分析得到廣泛的運(yùn)用。本文就近年來(lái)HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)在中藥成分分析及結(jié)構(gòu)的鑒定、中藥指紋圖譜研究、中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究3個(gè)方面的應(yīng)用作一論述。

1高效液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)

當(dāng)用傳統(tǒng)的高效液相色譜（HPLC）測(cè)定樣品時(shí)，樣品中的雜質(zhì)對(duì)主成分有較大的干擾，主峰不易分離，峰型也不好，準(zhǔn)確性有影響但卻找不到好的辦法時(shí)，高效液相色譜一質(zhì)譜（LC-MS）可以排除其他雜質(zhì)的干擾，即使主成分在色譜上沒有完全分離開，但通過(guò)MS的特征離子質(zhì)量色譜圖也能給出它的色譜圖來(lái)進(jìn)行定性定量。采用高效液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析時(shí)其流動(dòng)相主份相對(duì)于傳統(tǒng)高效液相色譜（HPLC）法更少更簡(jiǎn)單，色譜柱更短更?。ǔＳ靡?guī)格是2.1mm×50mm，1.8μm），出峰時(shí)間大大縮短，卻可以得到很好的分離效果，短時(shí)間內(nèi)可完成對(duì)一個(gè)樣品的分析，操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。更適合于大批量樣品的測(cè)定。高效液相色譜一質(zhì)譜（LC-MS）還可以用相對(duì)簡(jiǎn)單的色譜條件對(duì)中藥中多種成分的定性、定量分析，比如分析西青果中的訶子酸、訶黎勒酸、鞣云實(shí)精、原訶子酸等化合物，方法簡(jiǎn)便，分析時(shí)間短。而用傳統(tǒng)的高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定時(shí)不僅要用到不同的色譜條件，且洗脫、分離效果往往不好，分析時(shí)間也很漫長(zhǎng)。

2液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥研究中應(yīng)用進(jìn)展

2.1在中藥成分分析以及中藥結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用

中藥的成分多而復(fù)雜，且傳統(tǒng)的分離鑒定方法（提取一分離一結(jié)構(gòu)鑒定）耗時(shí)、耗力、重復(fù)性強(qiáng)，技術(shù)難度也較大。因此，其化學(xué)成分的檢測(cè)成為中藥研究中主要解決的問(wèn)題。而LC-MS將LC的高分離效能與MS的測(cè)定功能組合起來(lái)，不僅可以對(duì)復(fù)雜混合物進(jìn)行定性和定量分析，而且對(duì)樣品的前處理要求不是很高，為中藥組分分析、結(jié)構(gòu)鑒定等，提供了一個(gè)全新的技術(shù)支撐。

白雪等采用液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LCMC-IT-TOF）對(duì)金銀花中的化學(xué)成分進(jìn)行快速準(zhǔn)確地定性分析，得到高分辨、高精度的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-DAD）數(shù)據(jù)分析以及Formula Predictor分子式預(yù)測(cè)，鑒定了金銀花中的17種化學(xué)成分，包括6個(gè)有機(jī)酸類成分，3個(gè)黃酮類成分和8個(gè)環(huán)烯醚萜成分。孫冬梅等使用超高效液相色譜一四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS）測(cè)定銀杏磷脂軟膠囊甲醇提取物中化學(xué)成分，在優(yōu)化的液質(zhì)聯(lián)用條件下，通過(guò)對(duì)照品、數(shù)據(jù)庫(kù)匹配及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，鑒定為槲皮素（quercetin）、芹菜素（apigenin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素-3-0-[2-0-（β-D-葡萄糖基）]-α-L-鼠李糖苷（quercetin 3-0-[2-0-（B-D-glucosyl）-α-L-rhamnoside]）等12種黃酮類成分。譚銀豐等運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS），在電噴霧離子源正離子模式下（ESI+），采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）對(duì)可能的化合物進(jìn)行針對(duì)性分析。結(jié)果在高良姜葉的甲醇提取液中共鑒定出分屬于兩類成分的16個(gè)化合物，其中黃酮類物質(zhì)白楊素、喬松素、楊芽黃素、芹菜素、高良姜素、高良姜素-3-0-甲醚、金合歡素、山柰酚、山柰素、槲皮素、異鼠李素、蘆丁。二芳基庚烷類成分包括益智酮甲、益智醇、六氫姜黃素和hannokinol。王樂奇等采用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-ESI-MS）對(duì)鉤藤藥材的乙醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果共分離鑒定出6個(gè)化學(xué)成分，主要為生物堿類成分，分別為：鉤藤堿、烏索酸、異鉤藤堿、柯諾辛堿B和二氫柯楠因堿。

2.2在中藥指紋圖譜研究的應(yīng)用

指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評(píng)價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。其主要特點(diǎn)表現(xiàn)在“整體性”“模糊性”。中藥成分復(fù)雜，含雜質(zhì)多，分離提純難度大。研究表明，中藥的藥效是多成分共同作用的結(jié)果，不可能是某幾個(gè)主要成分或者指標(biāo)成分在起作用，中藥指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)逐步成為技術(shù)檢測(cè)中成藥特別是中藥材質(zhì)量的有效手段。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在對(duì)未知成分的研究中，其原理就是由串聯(lián)質(zhì)譜得到的特征碎片離子等結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解等規(guī)律，來(lái)對(duì)未知成分進(jìn)行定性、定量分析整好滿足中藥指紋圖譜研究的需要。

曹樹萍等采用超高液相色譜（UPLC）技術(shù)建立參麥注射液的指紋圖譜快速檢測(cè)方法，并利用離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其特征性成分進(jìn)行分析，結(jié)果建立了全國(guó)3個(gè)廠家19批參麥注射液UPLC譜指紋圖譜，利用多級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)對(duì)12個(gè)共有峰進(jìn)行指認(rèn)。19批參麥注射液除2批外相似度均高于0.85。聚類分析結(jié)果顯示不同廠家的參麥注射液各自聚為一類。汪祺等采用超高效液相色譜建立生脈注射液指紋圖譜，并應(yīng)用超高效液相色譜一離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)主要色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，標(biāo)定了18個(gè)共有峰，8個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的相似度除2個(gè)企業(yè)外均高于0.9；利用二級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合對(duì)照品及文獻(xiàn)報(bào)道，確定18個(gè)共有峰化合物的可能結(jié)構(gòu)。超高效液相指紋圖譜可快速有效地評(píng)價(jià)生脈注射液的產(chǎn)品質(zhì)量。韋英杰等用高效液相色譜方法（帶有二極管陣列檢測(cè)器），以川續(xù)斷皂苷Ⅵ為參照物建立續(xù)斷色譜指紋。采用高效液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)首次分析其中化學(xué)成分的質(zhì)譜特征。最后確定了續(xù)斷藥材的17個(gè)共有峰，由于該方法（指紋圖譜）具有較高的精密度，較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，對(duì)續(xù)斷藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有很大意義。高效液相色譜一質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)鑒定了該藥材中30多個(gè)化合物的相對(duì)分子量，通過(guò)多種方式對(duì)照，對(duì)其中10個(gè)具有特征的成分進(jìn)行了推測(cè)，并確認(rèn)。并用高效液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)續(xù)斷指紋圖譜中的特征峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，可使其色譜指紋圖譜的特征性更強(qiáng)，對(duì)續(xù)斷藥材的質(zhì)量控制得到一個(gè)很大的提高。

2.3中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用

藥物代謝動(dòng)力學(xué)（Pharmacokinetic）是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，并運(yùn)用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律。LC-MS技術(shù)由于其具有快速、微量、專屬、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，除了可確定分子量之外，還可以根據(jù)特異性斷裂規(guī)律推導(dǎo)出重要部分結(jié)構(gòu)甚至是完整的結(jié)構(gòu)。因此，LC-MS技術(shù)已成為藥物代謝研究中不能替代的一種強(qiáng)有力的分離分析工具。

皮子鳳等采用基于超高效液相色譜與串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC/Q-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法，進(jìn)行了五味子治療糖尿病腎病大鼠血清代謝組學(xué)研究。共鑒定了7種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，分別為黃尿酸、油酰胺、棕櫚酰胺、尿素、5-羥基己酸、硫酸對(duì)甲酚和對(duì)甲酚葡萄糖苷酸，說(shuō)明五味子通過(guò)影響色氨酸代謝、嘌呤代謝、脂肪酸代謝、腸內(nèi)菌代謝等通路發(fā)揮治療作用，其中嘌呤代謝、腸內(nèi)菌代謝通路是其減少腎病損傷的重要作用途徑。從五味子整體作用角度初步闡明了其治療糖尿病腎病的作用機(jī)制。

秦春雨等建立大鼠血漿中雷公藤內(nèi)酯醇的超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）法測(cè)定大鼠灌胃給藥與靜脈注射給藥后的血漿藥物濃度，并進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià)。Sprague Dawley大鼠分別經(jīng)灌胃與尾靜脈注射給藥，經(jīng)頸靜脈取血，測(cè)定不同時(shí)間的大鼠血漿藥物濃度，并計(jì)算其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果在0.1～200.0ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，血漿雷公藤內(nèi)酯醇線性關(guān)系良好，血漿中雷公藤內(nèi)酯醇的定量限為0.1g/ml，該藥穩(wěn)定性良好，回收率均在95%以上，日內(nèi)與日間差異均小于15%?？诜c靜脈給藥后，雷公藤內(nèi)酯醇在大鼠體內(nèi)的消除均較快，口服生物利用度為9.5%。本研究結(jié)果為雷公藤內(nèi)酯醇的結(jié)構(gòu)優(yōu)化、劑型改進(jìn)以及臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

辛楊等采用液-液萃取法對(duì)灌胃給予次烏頭堿的大鼠尿液樣品進(jìn)行純化，利用高效液相色譜一離子阱串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)純化樣品，根據(jù)各保留時(shí)間對(duì)應(yīng)化合物的多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)對(duì)照，推斷次烏頭堿在大鼠尿液中代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果與空白組大鼠尿液相比，在次烏頭堿給藥大鼠的尿液中共檢測(cè)到4個(gè)烏頭類生物堿，分別為次烏頭堿原型化合物，18-0-去甲基次烏頭堿，N-去甲基次烏頭堿，被標(biāo)識(shí)為羥基化的代謝物。研究表明次烏頭堿在大鼠體內(nèi)可能發(fā)生了去甲基、羥基化代謝反應(yīng)，為該成分的藥效作用研究提供參考。

3小結(jié)

綜上所述高效液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)以其高分離能力、高靈敏度以及高選擇性，并且應(yīng)用范圍廣，具有強(qiáng)的專屬性等特點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)中藥的研究會(huì)是一個(gè)很大的突破，在中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。此外，高效液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)無(wú)論在藥物的分析、篩選方面，還是在農(nóng)藥殘留、環(huán)境安全以及食品分析等方面也得到了廣泛的應(yīng)用。隨著技術(shù)的更新發(fā)展，相信高效液相色譜一質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的作用和美好的應(yīng)用前景。