王　旭，陳　新，李　龍，寇蕓蕓，張曉琳

(1 武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2 國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

多殺菌素C-9不同糖基衍生物的合成及殺蟲活性分析

王旭1，陳新1，李龍1，寇蕓蕓1，張曉琳2

(1 武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2 國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

[摘要]【目的】 尋找具有更高殺蟲活性的新型多殺菌素衍生物?！痉椒ā?以鹽酸水解獲得的多殺菌素C-9假糖苷配基為受體，以3種單糖(D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖)為供體，采用三氯乙酰亞胺法進(jìn)行糖苷化反應(yīng)得到C-9位不同糖基大環(huán)內(nèi)酯類衍生物；用核磁共振譜(1H-NMR、13C-NMR)，MS和IR對所合成衍生物進(jìn)行表征，并分別測定所合成衍生物的殺蟲活性?！窘Y(jié)果】1H-NMR、13C-NMR、MS和IR譜圖分析表明，新合成的3種多殺菌素衍生物分別為9-0-(β-D-吡喃葡萄糖)多殺菌素衍生物、9-0-(β-D-吡喃半乳糖)多殺菌素衍生物、9-0-(β-L-吡喃鼠李糖)多殺菌素衍生物；殺蟲活性測定表明，3種新型多殺菌素衍生物在20 mg/L劑量下對鋸谷盜、赤擬谷盜、米蛾等均表現(xiàn)出一定的殺蟲活性，致死率為31%～59%?！窘Y(jié)論】 新合成的多殺菌素衍生物均具有一定的殺蟲活性，其構(gòu)效關(guān)系還具有進(jìn)一步研究的價值。

[關(guān)鍵詞]多殺菌素；糖基衍生物；殺蟲活性

多殺菌素是一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物殺蟲劑[1-3]，是土壤放線菌刺糖多孢菌[4-6]在培養(yǎng)介質(zhì)中經(jīng)有氧發(fā)酵所獲得的次級代謝產(chǎn)物。多殺菌素能有效防治雙翅目和纓翅目害蟲，也能很好地防治鞘翅目和直翅目中某些大量取食葉片的害蟲，其殺蟲活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)地超過了通常用于防治棉花害蟲的多種有機(jī)磷、氨基甲酸酯類、環(huán)戊二烯類和其他殺蟲劑，且毒力和殺蟲活性與擬除蟲菊酯類殺蟲劑相當(dāng)。由于多殺菌素兼有生物農(nóng)藥的安全性和化學(xué)農(nóng)藥的速效性[7-8]，因而獲得了美國“總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎”。相關(guān)領(lǐng)域在關(guān)注多殺菌素對有益昆蟲高效選擇性的同時，很少注意其獨特的分子結(jié)構(gòu)[9-11]。因目前多殺菌素生物合成繁雜，產(chǎn)率也因之受到一定影響，尋找高產(chǎn)、低毒、低殘留的新型多殺菌素活性物質(zhì)倍受關(guān)注。通過提高多殺菌素化合物的親脂性和減小偶極矩，對其進(jìn)行合理的化學(xué)修飾，是篩選多殺菌素類高活性化合物的一個重要途徑。本研究在多殺菌素作用機(jī)理[12]分析的基礎(chǔ)上，利用三氯乙酰亞胺法[13-15]，保留多殺菌素母核結(jié)構(gòu)及其氨基糖部位，對其C-9位的鼠李糖部位進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，合成了3種新型多殺菌素衍生物，并對其衍生物構(gòu)效關(guān)系和殺蟲活性進(jìn)行了分析，以期為更高活性的多殺菌素衍生物的合成和篩選提供參考。

1材料與方法

1.1試劑

D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖，上海國藥集團(tuán)；多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品(Spinosad)，Dow AgroSciences；蟲卵和酵母粉，武漢市疾病預(yù)防控制中心；甲醇、乙腈(色譜純)，上海國藥集團(tuán)；乙酸銨(分析純)、石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯，科密歐試劑有限公司；烯丙基溴、苯甲酰氯、DBU(1,8-二氮雜二環(huán)[5.4.4]十一碳-7-稀)、TMSOTF(三氟甲磺酸三甲基硅醇酯)、甲胺乙醇溶液(30%)、三氯乙腈、4,4-二甲基吡啶(DMAP)、DMF(氮氮二甲基甲酰胺)，阿拉?。籇owex-50WX8型陽離子交換樹脂，陶氏化學(xué)；柱層析硅膠(111～166 μm)、薄層層析硅膠(10～40 μm)，青島海洋化工有限公司。

1.2儀器

紫外-可見分光光度儀，Perkin Elmer spectrophotomoter；79-1磁力加熱攪拌器，金壇市醫(yī)療儀器廠；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；高效液相色譜儀1260，安捷倫科技(中國)有限公司；分析天平，瑞士梅特勒托利多儀器；0.22 μm微濾膜，天津津騰試驗設(shè)備有限公司。

1.3合成路線的設(shè)計

經(jīng)查閱多殺菌素結(jié)構(gòu)修飾的相關(guān)文獻(xiàn)[13-15]，葡萄糖等若要以β連接的方式形成糖苷鍵，受體上的3-H、5-H和供體上的1-H都處于直立鍵，3個靠近的H產(chǎn)生很大的位阻，連接苷元后分子量更大，骨架難以扭轉(zhuǎn)以致反應(yīng)的難度增加。因此以苯甲酰基保護(hù)的糖三氯乙酰亞胺酯作為糖基供體。多殺菌素局部酸水解[16]去除甲氧基化α-L-鼠李糖獲得C-9假糖苷配基，與單糖經(jīng)過三步反應(yīng)合成糖基配體，即苯甲?；犬惏孵ミM(jìn)行糖苷化反應(yīng)得到多殺菌素的糖苷化衍生物。糖基供體、受體的制備以及供體與受體的結(jié)合見圖1～3，其中化合物1為全苯甲?；奶腔衔?為選擇性游離1-OH的糖基，化合物3為乙?；奶腔衔?為游離C-9位羥基的多殺菌素糖基受體。

1.4多殺菌素的水解

1.4.1鹽酸水解工藝的確定多殺菌素大環(huán)結(jié)構(gòu)上的9-羥基連接的是一個甲氧基化的α-L-鼠李糖，通過酸性條件水解多殺菌素的糖苷鍵，游離出活性羥基，再在一定條件下將不同糖基與多殺菌素水解產(chǎn)物結(jié)合，即可得到不同結(jié)構(gòu)的多殺菌素衍生物。

圖 1　糖基供體的制備

圖 2　糖基受體的制備

圖 3　糖基供體與糖基受體的結(jié)合

基于糖苷鍵能夠被三氟乙酸、硫酸、鹽酸等催化水解，本研究選擇鹽酸作為試驗水解用酸，并選取鹽酸濃度(A)、水解時間(B)、水解溫度(C)3個因素設(shè)計正交試驗，以水解后得到的多殺菌素C-9假糖苷配基的產(chǎn)率作為評價指標(biāo)，確定多殺菌素的最佳水解工藝。正交試驗的因素及水平見表1。

表 1　多殺菌素水解正交試驗的因素及水平

1.4.2多殺菌素的水解稱取多殺菌素2 g,用 1 000 mL濃度0.5 mol/L的鹽酸溶解，在水浴溫度為85 ℃的條件下反應(yīng)5 h后，TLC監(jiān)測至目標(biāo)水解產(chǎn)物的量不再增加時，加入氨水調(diào)pH=7，終止反應(yīng)。將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至適量體積，用乙酸乙酯反復(fù)萃取。乙酸乙酯萃取部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，產(chǎn)物經(jīng)過硅膠柱層析分離純化，流動相體系為石油醚-丙酮溶液(V(石油醚)∶V(丙酮)=5∶1)，檢測體系為石油醚-丙酮溶液(V(石油醚)∶V(丙酮)=3∶1)，石油醚-丙酮溶液洗脫后收集水解產(chǎn)物洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，經(jīng)高效液相色譜和核磁波譜解析為去除甲氧基化α-L-鼠李糖的C-9假糖苷配基化合物4(1.76 g)。分別稱取多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品及酸水解后產(chǎn)物各1 mg溶于2 mL甲醇溶液，將甲醇溶液濾過微孔濾膜后作為液相檢測液。色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB柱；流動相為甲醇-乙腈-水溶液(0.5 g/L 乙酸銨水溶液)(V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=45∶45∶10)，流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。然后提取多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品及水解產(chǎn)物的液相圖。

1.5多殺菌素葡萄糖基衍生物的合成

1.5.1苯甲?；咸烟堑闹苽浞Q取D-葡萄糖18 g(0.1 mol)于反應(yīng)瓶中，加入吡啶400 mL、DMAP 13.5 g(0.044 mol)，室溫攪拌后60 ℃水浴條件下加入35 mL(0.3 mol)苯甲酰氯，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯-HOAc溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(HOAc)=3∶1∶0.2)，室溫攪拌24 h后反應(yīng)結(jié)束。將反應(yīng)液倒入水中，靜止固化后倒去上清液，用稀鹽酸反復(fù)洗滌固化后的產(chǎn)物至無吡啶味，再用水反復(fù)洗滌，干燥。柱層析分離，得全苯甲?；咸烟前咨腆w化合物1a：67.29 g(0.096 mol)。

1.5.21-OH苯甲?；咸烟堑闹苽湓?00 mL THF(四氫呋喃)溶液中溶入全苯甲酰化葡萄糖30.12 g(0.043 mol)，加入33%甲胺乙醇溶液31 mL (0.13 mol)后室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1),5 h后反應(yīng)結(jié)束，柱層析分離(柱層析用硅膠111～166 μm，過柱體系為石油醚-乙酸乙酯溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1)，得1-OH苯甲?；咸烟前咨腆w化合物2a：12.52 g(0.021 mol)。

1.5.3葡萄糖三氯異胺酯的合成無水二氯甲烷中溶入1-OH苯甲?；咸烟?.56 g(0.013 mol)，在無氧環(huán)境中加入三氯乙腈11.8 mL(0.117 mol)，室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1)，28 h后反應(yīng)結(jié)束，柱層析分離(柱層析用硅膠111～166 μm，過柱體系為石油醚-乙酸乙酯溶液((V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1)得到葡萄糖三氯異胺酯白色固體化合物3a：5.55 g(7.63 mol)。1H-NMR(CDCl3,400 MHZ)δ：8.64(s，1H)，8.04(d，2H，J=7.4 Hz)，7.95(dd，4H，J=8.3，3.1 Hz)，7.87(d，2H，J=7.4 Hz)，7.56～7.26(m，12H)，6.28(t，1H，J=10.1 Hz)，5.84(t，1H，J=9.8 Hz)，4.64(d，2H，J=10.3 Hz)，4.48(dd，1H，J=12.8，5.4 Hz)，與參考文獻(xiàn)[17]一致。

1.5.4多殺菌素C-9全苯甲?；疍-葡萄糖衍生物的合成稱取2 000 mg(2.76 mmol)葡萄糖三氯異胺酯和880 mg(1.55 mmol)C-9假糖苷配基，溶入20 mL無水二氯甲烷中，室溫下攪拌5 min后，在無氧條件下加入4A(分子篩孔徑)分子篩約4.2 g。將反應(yīng)管放入制備好的冰鹽浴中繼續(xù)攪拌，加入TMSOTF 57 μL(0.27 mmol)，1 h后室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1)，18 h后反應(yīng)結(jié)束，柱層析分離，得到多殺菌素C-9全苯甲?；咸烟茄苌锇咨腆w化合物5a：510 mg(0.40 mmol)。

1.6多殺菌素半乳糖基衍生物的合成

1.6.1苯甲?；肴樘堑闹苽浞Q取D-半乳糖16 g(0.089 mol)于反應(yīng)瓶中，加入吡啶350 mL、DMAP 12.1 g(0.039 mol)。室溫攪拌后冰浴條件下加入98 mL(0.84 mol)苯甲酰氯，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯-HOAc溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(HOAc)=3∶1∶0.2)，室溫攪拌10 h后反應(yīng)結(jié)束。然后同1.5.1節(jié)，得全苯甲?；肴樘前咨腆w化合物1b：60.29 g(0.08 mol)。

1.6.21-OH苯甲?；肴樘堑闹苽湓?00 mL THF溶液中溶入全苯甲?；肴樘?2.78 g(0.047 mol)，加入33%甲胺乙醇溶液66 mL(0.28 mol)后室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1)，3 h后反應(yīng)結(jié)束。柱層析分離，得到1-OH苯甲?；肴樘前咨腆w化合物2b：12.72 g(0.021 4 mol)。

1.6.3半乳糖三氯異胺酯的合成無水二氯甲烷中溶入1-OH苯甲?；肴樘?.56 g(0.014 4 mol)，在無氧環(huán)境中加入三氯乙腈17.4 mL(0.139 mol)、DBU 1.8 mL(0.013 mol)，室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯溶液(溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1)，12 h后反應(yīng)結(jié)束，柱層析分離，得到半乳糖三氯異胺酯產(chǎn)物——白色固體化合物3b：6.45 g(8.87 mol)，與參考文獻(xiàn)[17]一致。

1.6.4多殺菌素C-9 全苯甲?；疍-半乳糖衍生物的合成稱取2 283.3 mg(3.137 mmol)半乳糖三氯異胺酯和574.4 mg(1.01 mmol)C-9假糖苷配基，溶入20 mL無水二氯甲烷中，室溫下攪拌5 min，之后繼續(xù)攪拌，加入TMSOTF 11 μL(0.06 mol)，1 h后室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1)，16 h后反應(yīng)結(jié)束，柱層析分離，得到多殺菌素全苯甲酰化半乳糖衍生物——白色固體化合物5b：1.005 g(0.786 mmol)。

1.7多殺菌素鼠李糖基衍生物的合成

1.7.1苯甲?；罄钐堑闹苽浞Q取L-鼠李糖14 g(0.085 mol)于反應(yīng)瓶中，加入吡啶230 mL、DMAP 10.5 g(0.034 mol)。室溫攪拌后冰浴下加入98 mL(0.535 mol)苯甲酰氯，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯-HOAc溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(HOAc)=4∶1∶0.2)，室溫下攪拌36 h后反應(yīng)結(jié)束。然后同1.5.1節(jié)，得全苯甲?；罄钐前咨腆w化合物1c：43.38 g(0.08 mol)。

1.7.21-OH苯甲?；罄钐堑闹苽湓?00 mL THF溶液中溶入全苯甲酰化鼠李糖35.46 g(0.535 mol)，加入33%甲胺乙醇溶液114 mL(0.49 mol)后室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1)，1 h后反應(yīng)結(jié)束。柱層析分離得1-OH苯甲酰化鼠李糖白色固體化合物2c：11.89 g(0.025 mol)。

1.7.3鼠李糖三氯異胺酯的合成無水二氯甲烷中溶入1-OH苯甲?；罄钐?.31 g(0.015 4 mol)，在無氧環(huán)境中加入三氯乙腈22 mL(0.215 mol)、DBU 2.2 mL(0.015 mol)，室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1)，20 h后反應(yīng)結(jié)束，柱層析分離，得鼠李糖三氯異胺酯白色固體化合物3c：5.96 g(0.009 8 mol)，與參考文獻(xiàn)[17]一致。

1.7.4多殺菌素C-9全苯甲?；疞-鼠李糖衍生物的合成稱取1 680 g(1.47 mol)鼠李糖三氯異胺酯、280 mg (0.49 mmol) C-9假糖苷配基，溶入20 mL無水二氯甲烷中，室溫攪拌5 min后在無氧環(huán)境中加入4A(分子篩孔徑)分子篩約1.4 g。將反應(yīng)管放入制備好的冰鹽浴中繼續(xù)攪拌，加入TMSOTF 9 μL (0.050 mmol)，1 h后室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測體系為石油醚-乙酸乙酯溶液(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1)，12 h后反應(yīng)結(jié)束，柱層析分離，得到多殺菌素C-9 L-鼠李糖衍生物白色固體化合物5c：198 g(0.172 mmol)。

1.8目標(biāo)化合物殺蟲活性的測定

以多殺菌素原料為對照品，采用96孔板法初步測定合成的新型多殺菌素衍生物對鋸谷盜(Oryzae-philussurinamensis)、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum(Herbst))、米蛾(Corcyracephalonica)等儲糧蟲害的攝食殺蟲活性。將多殺菌素原料及合成的目標(biāo)產(chǎn)物溶解在蒸餾水中(超聲，溫度<70 ℃)，配制成質(zhì)量濃度20 mg/L的藥物溶液，幼蟲卵在純水恒溫箱(35 ℃)中培養(yǎng)孵化8 h待用，期間用酵母粉提供營養(yǎng)。測試時每孔最佳幼蟲個數(shù)為5只，每種成蟲有1個孔，重復(fù)3次。將酵母粉噴灑樣品后供試蟲攝食，于室溫光源下連續(xù)觀察24 h，記錄試蟲的活動情況，并計算幼蟲、成蟲的死亡率。以撥動蟲子不再活動作為蟲子死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)，死亡率為每個孔板中死亡蟲子數(shù)除以每孔板的總蟲數(shù)。連續(xù)7～10 d在相同溫度及濕度等外因條件下進(jìn)行重復(fù)試驗。

2結(jié)果與分析

2.1多殺菌素最佳水解工藝的確定

多殺菌素最佳水解工藝的三因素三水平正交試驗結(jié)果及方差分析結(jié)果見表2～3。

表 2　多殺菌素水解工藝的正交試驗結(jié)果

表 3　多殺菌素水解工藝正交試驗結(jié)果的方差分析

從表2,3可知，多殺菌素水解工藝正交試驗的3個因素對水解率的影響程度依次為B>C>A，3個因素、水平的最佳組合為A2B2C3，即鹽酸水解的最佳工藝條件為：鹽酸濃度為0.5 mol/L，水解時間為5.0 h，水解溫度為95 ℃。

2.2多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品及水解產(chǎn)物的液相分析

多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品及水解產(chǎn)物的液相圖如圖4～5所示。

圖 4　多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品的液相圖

圖 5　多殺菌素水解產(chǎn)物的液相圖

比較圖4和圖5可以看出，圖4中2個物質(zhì)的出峰時間均明顯晚于圖5中2個物質(zhì)的出峰時間，而多殺菌素水解后游離出羥基，極性變大，與之相對應(yīng)其在HPLC中的出峰時間有所提前。因此，通過HPLC可初步判斷多殺菌素已成功水解游離出羥基。

2.3多殺菌素衍生物的理化性質(zhì)

化合物4和多殺菌素衍生物5a、5b、5c的相關(guān)理化性質(zhì)和核磁共振數(shù)據(jù)、質(zhì)譜和紅外分析數(shù)據(jù)見表4和表5。

表 4　化合物4及化合物5a～5c的理化和質(zhì)譜分析

表 5　化合物4及化合物5a～5c的核磁共振譜和紅外光譜分析

由表4和表5可知，新合成的3種多殺菌素衍生物經(jīng)核磁共振譜、質(zhì)譜和IR表征為9-0-(β-D-吡喃葡萄糖)多殺菌素、9-0-(β-D-吡喃半乳糖)多殺菌素、9-0-(β-L-吡喃鼠李糖)多殺菌素，其結(jié)構(gòu)如圖6所示。本研究采用三氯乙酰亞胺法進(jìn)行糖苷化反應(yīng)，反應(yīng)可在相對穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，并通過反應(yīng)條件的控制得到所需的立體構(gòu)型，在酯化時采用的是堿性相對較強的DBU，同時選擇反應(yīng)活性較高的苯甲?；Ｗo(hù)的糖三氯乙酰亞胺酯作為糖基的供體，并與高效催化劑TMSOTF配合使用可使位阻較大的受體發(fā)生糖苷化反應(yīng)，得到熱力學(xué)比較穩(wěn)定的α構(gòu)型的產(chǎn)物，但當(dāng)糖環(huán)2位帶有鄰基參與功能的保護(hù)基如?；鶗r，易形成β構(gòu)型的糖苷鍵[16-17]。因為L-鼠李糖C2-OH位于a鍵上，所以以最難確定的L-吡喃鼠李糖為例進(jìn)行分析，在CDCl3中，C-1’、C-2’、C-3’、C-41’、C-5’和C-6’分別為95.5，7.5，72.9，70.3，70.2，20.1 ppm(ppm為核磁中化學(xué)位移單位)，與文獻(xiàn)[16-17]一致，且與原料對比鼠李糖異頭碳的質(zhì)子信號為4.39(J=7.7 Hz)，所以確定為9-0-(β-L-吡喃鼠李糖)多殺菌素，以此類推D-葡萄糖和D-半乳糖的C2-OH位于e鍵上，即可通過葡萄糖和半乳糖異頭碳質(zhì)子信號分別為4.89(J=8.2 Hz)、4.65(J=7.7 Hz)推斷出其分別為9-0-(β-D-吡喃葡萄糖)多殺菌素和9-0-(β-D-吡喃半乳糖)多殺菌素。

圖 6　化合物5a～5c的結(jié)構(gòu)式

2.4多殺菌素衍生物的殺蟲活性

以多殺菌素原料為對照品，采用96孔板法測定新合成的多殺菌素衍生物對鋸谷盜(Oryzaephilussurinamensis)、赤擬谷盜(TriboliumcastaneumHerbst)、米蛾(Corcyracephalonica)等儲糧蟲害的殺蟲活性，結(jié)果如表6所示。

表 6　多殺菌素及衍生物的殺蟲活性

由表6可以看出，合成的目標(biāo)化合物在20 mg/L 劑量下對鋸谷盜、赤擬谷盜和米蛾等害蟲均表現(xiàn)出一定的攝食殺蟲活性，死亡率為31%～59%，有效性可持續(xù)7～8 d，且對米蛾的殺蟲活性高于鋸谷盜和赤擬谷盜。

3結(jié)論與討論

1)通過水解去除多殺菌素的甲氧基化α-L-鼠李糖獲得多殺菌素的C-9假糖苷配基，多殺菌素的最佳水解工藝條件為：鹽酸濃度0.5 mol/L，水解時間為5.0 h，水解溫度為95 ℃。在此條件下多殺菌素的水解產(chǎn)率大、效率高、條件穩(wěn)定，更有利于保證后期合成所需的糖苷鍵量。

2)以水解獲得的多殺菌素C-9假糖苷配基為受體，以D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖 3種單糖為供體，采用三氯乙酰亞胺法進(jìn)行糖苷化反應(yīng)，經(jīng)過五大反應(yīng)步驟，即假糖苷的制備、糖的全苯甲酰化、游離羥基的選擇、酯化、新糖苷鍵的形成，可以得到3種新型化合物，酯化和糖苷鍵形成時要嚴(yán)格控制無水無氧環(huán)境，糖苷鍵立體構(gòu)型可控制。通過核磁共振譜1H-NMR、13C-NMR、MR和IR等分析，確認(rèn)成功得到了具有殺蟲活性的9-0-(β-D-吡喃葡萄糖)多殺菌素衍生物、9-0-(β-D-吡喃半乳糖)多殺菌素衍生物、9-0-(β-L-吡喃鼠李糖)多殺菌素衍生物。如果將酯化反應(yīng)中的DBU換成弱無機(jī)堿K2CO3等，也可以提供以β構(gòu)型為主的異構(gòu)體。

3)采用96孔板法測定所獲得的多殺菌素衍生物對儲食害蟲的攝食殺蟲活性，表明其對鋸谷盜、赤擬谷盜、米蛾等儲糧蟲害均具有一定的攝食毒殺活性，致死率為31%～59%。合成的多殺菌素衍生物的殺蟲活性研究補充了多殺菌素在鋸谷盜和赤擬谷盜中的殺蟲譜，但其起效時間和與其他類型殺蟲劑的毒力比較及其對蟲害的熏蒸及趨避毒性等，均有待于進(jìn)一步探究。盡管多殺菌素衍生物對鋸谷盜和赤擬谷盜的殺蟲活性稍差于成熟產(chǎn)品多殺菌素，但仍可對其衍生物做進(jìn)一步的殺蟲毒力研究，推測 C-9 糖基的變化對其殺蟲活性的影響較小，還可以考慮單獨將母環(huán)C-17或同時對C-9和C-17位的糖基進(jìn)行修飾改造，對于其有關(guān)糖取代基更深一步的構(gòu)效關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]夏立秋，張友明，黃科學(xué),等.多殺菌素研究進(jìn)展 [C]//中國微生物學(xué)會.2009中國微生物學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文集．北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社,2011:16-17.

Xia L Q,Zhang Y M,Huang K X,et al.Research progression of spinosad [C]//Chinese Society for Microbiology.Chinese society of microbiology academic annual meeting of memoir in 1999．Beijing:China Science and Technology Press,2011:16-17.(in Chinese)

[2]王潔靜，呂建華.多殺菌素在儲糧害蟲防治中的研究及應(yīng)用進(jìn)展 [J].糧食與飼料工業(yè)，2012，19(4):19-22.

Wang J J,Lü J H.Research progression and usedof spinosad in prevention and control of pests [J].Cereal & Feed Industry,2012,19(4):19-22.(in Chinese)

[3]梁權(quán).引人注目的儲糧害蟲防治研究進(jìn)展評述 [J].糧食儲藏，2001(1)：6-11.

Liang Q.Research progress of remarkable grain storage pest control are reviewed [J].Food Storage,2001(1)：6-11.(in Chinese)

[4]Geber B,Emmerling A,Becker.Koenigs-knorr reaction of fusel alcohols with methyl (1-bromo-2,3,4-tri-O-acetyl-α-d-glucopyra spinosid)uronate leading to the protected alkyl glucuronides-crystal structures and high resolution ～1H and ～13CNMR data [J].Carbohydrate Research,2012,352:186-190.

[5]Munyololo M，Gammon D W，Mohrholz I.Extending the scope of the ferrierreaction:fragmentation-rearrangement reactions of selectivel substitute1,2-cyclopropanated glucose derivatives [J].Carbohydrate Research,2012,351(4):49-55.

[6]SparkstcT D.Spinosad a case study:an example from a nature products discovery programme [J].Pest Management Science,2000,56：696-702.

[7]蔡恒，王燕，萬紅貴，等.刺糖多孢菌生產(chǎn)多殺菌素的研究進(jìn)展 [J].中國生物工程雜志，2011，31(2)：124-129.

Cai H,Wang Y,Wan H G,et al.Research progress of Thorn sugar more bacteria produce sterilization [J].Journal of Chinese Bio-Technology,2011,31(2)：124-129.(in Chinese)

[8]Lowe L B.Pesticidal spinosyn derivates：US，8048861 [P].2001-11-01.

[9]Peter B A,Creemer L C，Gary D,et al.Synthetic modification of Spinosyn compounds：US，6001981 [P].1999-12-14.

[10]聶果，王廣成，張忠明，等.多殺菌素高效液相色譜分析 [J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2003，24(8)：6-8.

Nie G,Wang G C,Zhang Z M,et al.High performance liquid chromatograph of spinosad [J].Pesticide Science and Admini-Stration,2003,24(8)：6-8.(in Chinese)

[11]張苑，金志華，林建平，等.多殺菌素的高效液相色譜法測定 [J].農(nóng)藥，2003，42(10)：27-28.

Zhang Y,Jin Z H,Lin J P,et al.Determination of spinosyns by high performance liquid [J].Pesticide,2003,42(10)：27-28.(in Chinese)

[12]王彥華，王鳴華.多殺菌素的作用機(jī)理及其執(zhí)藥性的研究進(jìn)展 [J].農(nóng)業(yè)科學(xué)與管理，2006，25(11)：12-15.

Wang Y H,Wang M H.Research progress of the mechanism and research progress of medicinal properties about spinosad [J].Pesticide Science and Administration,2006,25(11)：12-15.(in Chinese)

[13]Breslin W J，Marty M S，Vedula U V，et al.Developmental toxicity of spinosad administered by gavage to CD rats and New Zealand white rabbits [J].Food & Chemical Toxicology,2001,38(12):1103-1112.

[14]李月，常城，楊克遷.多殺菌素生物合成途徑及改造策略 [J].微生物學(xué)報，2011，51(11)：1431-1439.

Li Y,Chang C,Yang K Q.The biosynthetic pathway and transformation strategy of spinosad [J].Acta Microbiologica Sinica,2011,51(11)：1431-1439.(in Chinese)

[15]胡西洲.多殺菌素分離純化的工藝研究 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005：76-80.

Hu X Z.The research aimed to study the separation and purification techniques of spinosad [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2005：76-80.(in Chinese)

[16]Lawrence C,Herbert A.Conversion of Spinosyn A and Spinosyn D to their respective 9- and 17- Pseudoaglycones and their aglycones [J].The Journal of Antibiotics,1998,51(8):795-800.

[17]裴月湖，華會明，李占林.核磁共振譜法在糖苷鍵構(gòu)型確定中的應(yīng)用 [J].藥學(xué)學(xué)報，2011,46(2)：127-131.

Pei Y H,Hua H M,Li Z L.NMR in the application of the glycosidic bond [J].Acta Pharmaceutica Sinica,2011,46(2)：127-131.(in Chinese)

Synthesis and insecticidal activity of different aglycones derivatives of spinosad C-9

WANG Xu1,CHEN Xin1,LI Long1,KOU Yun-yun1,ZHANG Xiao-lin2

(1SchoolofBiologyandPharmaceuticalEngineering,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan,Hubei430023,China;2AcademyofStateAdministrationofGrain,Beijing100037,China)

Abstract：【Objective】 The purpose of this study was to synthesize spinosad with better insecticidal activity.【Method】 Using C-9 aglycone as receptor and three monosaccharaides (D-gluclse,D-galactose,and L-rhamnose) as donor, different aglycones derivatives of spinosad C-9 were synthesized using trichloroacetimidate method.All compounds were confirmed by1H-NMR,13C-NMR,MS and IR and their insecticidal activities were determined. 【Result】 Spectra analysis with1H NMR,13C-NMR,MS and IR confirmed that the new synthesized three derivatives were 9-0 (β-D-pyran glucose),9-0-(β-D-pyran galactose),and 9-0-(β-L-pyran rat lee sugar).The new compounds exhibited intertidal activities against Oryzaephilus surinamensis,Tribolium castaneum (Herbst),Corcyra cephalonica at concentration of 20 mg/L,and the lethality was 31%-59%.【Conclusion】 The compounds synthesized in this study had good insecticidal activity and the structure activity relationship should be further studied.

Key words：spinosad;glycosyl derivatives;insecticidal activity

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.020

[收稿日期]2014-10-24

[基金項目]國家糧食公益性行業(yè)科研專項“儲糧蟲霉監(jiān)測與生態(tài)控制技術(shù)研究”(201313002)

[作者簡介]王旭(1987-)，男，湖北隨州人，碩士，主要從事藥學(xué)研究。E-mail：wangxu54ep@126.com [通信作者]陳新(1978-)，男，福建龍海人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥學(xué)研究。E-mail：chenxin_0001@126.com

[中圖分類號]S482.2+8

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)06-0141-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.040.html