李 川，李二星，劉 洋，吳群軍，殷越閱

（1.安康學院現代農業(yè)與生物科技學院，陜西安康725000；2.旬陽縣新森林生態(tài)農業(yè)有限責任公司，陜西旬陽725772）

白芨實生種子的快速繁殖技術

李 川1，李二星1，劉 洋1，吳群軍2，殷越閱1

（1.安康學院現代農業(yè)與生物科技學院，陜西安康725000；2.旬陽縣新森林生態(tài)農業(yè)有限責任公司，陜西旬陽725772）

為白芨種質資源的保存和大面積種植提供依據，以白芨種子作為接種材料，利用正交試驗研究在不同條件下白芨種子的萌芽率，不同激素濃度白芨種子成苗率及白芨種子實生苗煉苗成活率的條件。結果表明：貯藏條件為20℃，30d的白芨種子在培養(yǎng)溫度為25℃，光照16h／d的萌發(fā)率最高；培養(yǎng)基配比為MS＋6－BA 3.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%，光照16h／d，溫度25℃條件下白芨種子的萌發(fā)最快，長勢較好，而MS＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%對于誘導生根效果明顯；煉苗基質以腐葉土∶鋸末＝1∶1為最好，控制溫濕度，成活率超85%。

白芨種子；實生苗；原球莖

白芨〔Bletilla striata（thunb）Reichb.f.〕蘭科植物，別名地螺絲、刀口藥和白芨子。主產于貴州、云南和四川等地，在長江流域及以南各省亦有分布［1］。白芨種子細小，在自然條件下萌發(fā)率極低，繁殖困難，野生資源較稀少，而白芨用途廣，需求量極大，長期掠奪式的采挖導致其野生資源已瀕臨枯竭，無法滿足市場需求。因此，必須探索白芨實生種子繁殖技術，在相對較短的時間內進行白芨苗的快速繁殖，增大白芨產量，以解決白芨缺乏的現狀。石云平［2］等研究表明，以白芨側芽為外植體并采用0.2%升汞消毒滅菌8min的效果較好；側芽的叢生芽誘導以培養(yǎng)基MS＋1.5mg／L 6－BA＋0.1mg NAA的效果較好；繼代增殖以培養(yǎng)基MS＋2.0mg／L 6－BA＋0.2mg／L NAA較適合，30d為1個周期，增殖系數為5.0；生根培養(yǎng)基以1／2MS＋1.0mg／L NAA＋0.1mg／L 6－BA較好，生根率為83.3%。付志惠［3］等研究表明：白芨種子萌發(fā)率與其胚齡和有胚率成正相關，萌發(fā)時間則與胚齡和有胚率成負相關；胚齡16周的種子在1g／L花寶1號＋2g／L花寶2號的培養(yǎng)基上萌發(fā)率達84%；胚齡≥20周的種子萌發(fā)率不受培養(yǎng)基成分的影響，均達100%，萌發(fā)時間只需7d；叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為1／2MS＋4.0mg／L 6－BA＋0.2mg／L NAA＋100g／LCM，其增殖倍數達4.41倍；誘導生根較好的培養(yǎng)基為1／2MS＋0.2mg／L NAA，生根率達90%。但目前對于白芨實生種子方面研究尚少。因此，筆者以白芨種子作為接種材料，利用正交試驗研究不同條件下白芨種子的萌芽率，不同激素濃度對白芨種子萌發(fā)及實生苗煉苗成活率的影響，旨在討論利用白芨種子進行實生苗組織培養(yǎng)快速繁殖，為該物種種質資源的保存和大面積栽培利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為黃花白芨（當地品種）種子，由旬陽縣新森林生態(tài)農業(yè)有限公司提供。

1.2 無菌材料的獲得

將未開裂白芨蒴果果莢用毛筆輕輕掃去附著在表面的灰塵，在超凈工作臺上用75%的酒精棉擦拭表面消毒3min，再用0.15%的HgCl2擦拭表面約10min（操作過程中只需擦濕表面即可，以防試劑浸入蒴果內部導致種子失去萌發(fā)能力）。然后用鑷子縱向剖開蒴果，用鑷子夾住蒴果，將碎末狀的種子輕輕抖落在培養(yǎng)基表面。利用pH為5.8，瓊脂為8.0g／L的培養(yǎng)基培養(yǎng)果莢里粉末狀白芨種子，以獲取白芨苗。

1.3 白芨種子最適萌發(fā)條件的確定

采用3因素3水平正交設計法L9（33）考察不同條件對白芨種子萌發(fā)的影響因素水平（表1）。在墊有3層濾紙直徑90mm的培養(yǎng)皿中按10×10方陣精量播100粒種子，每個處理培養(yǎng)2皿，每天灑水1次，保證100%的濕度。接種15d后統(tǒng)計9個處理白芨種子的萌發(fā)個數，計算不同處理的萌發(fā)率：

萌發(fā)率＝（萌發(fā)的種子數／接種的種子數）× 100%

表1 白芨種子萌發(fā)的L9（33）正交試驗設計Table 1 L9（33）orthogonal experimental design table for Bletillaseeds germination

1.4 白芨種子萌發(fā)的最佳濃度激素配比的確定

選擇萌發(fā)率較高的白芨種子在6－BA （1～3mg／L）和NAA（1～2mg／L）不同激素濃度配比的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，激素濃度為6－BA∶NAA＝1∶1，1∶2，2∶1，2∶2，3∶1，3∶2），篩選出培育白芨種子組培苗的最佳配比濃度。其他條件為pH 5.8，蔗糖30g／L，瓊脂8g／L。在25℃，光照16h／d，光強2500～3000lx環(huán)境條件下培養(yǎng)。

1.5 不同濃度NAA對白芨生根的影響

待白芨幼苗生長到2～3cm時，將幼苗轉接入生根培養(yǎng)基誘導生根（NAA激素濃度分別為0.5mg／L，1mg／L，1.5mg／L，2mg／L）。試驗所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH 5.8，蔗糖含量為30g／L，瓊脂為8g／L。在25℃，光照16h／d，光強2 500～3 000lx環(huán)境條件下培養(yǎng)。

1.6 煉苗

當白芨組培苗生根達4～5條，平均根長度達1.5cm，株高約5cm時，即可進行移栽。移栽前打開組培瓶蓋，在自然環(huán)境下放置3d，小心取出白芨幼苗，用自來水將根系上的培養(yǎng)基沖洗干凈，最后定植于已高溫消毒的基質中，基質為鋸末∶腐葉土＝1∶1較好，室溫，光照16h／d，光強2 500～3 000lx的光照培養(yǎng)箱中煉苗。

1.7 數據處理

采用EXCEL2010和SPSS 19.0軟件進行數據統(tǒng)計分析。

表2 不同處理對白芨種子的萌發(fā)率Table 2 Germination rate of Bletillaseeds of different treatment

2 結果與分析

2.1 不同處理白芨種子萌發(fā)率與長勢

2.1.1 不同培養(yǎng)條件 由表2可見，不同成熟度的白芨種子在不同培養(yǎng)溫度和不同光照時間中均能萌發(fā)，但萌發(fā)率有所差異。不同處理白芨種子的萌發(fā)力影響依次為培養(yǎng)溫度＞貯藏條件＞光照時間，選擇貯藏條件20℃，貯藏30d當年的白芨種子，培養(yǎng)溫度為25℃，光照16h／d的處理組合萌發(fā)率最高，達95%。

表3 不同激素和濃度配比白芨種子生長情況Table 3 Growing status of Bletillaseeds treated with different hormone and concentration ratio

圖示 白芨種子在培養(yǎng)基上不同時期生長情況Fig. Growth of different periods of Bletillaseeds in culture medium

經方差分析，溫度（A）和光照（C）對白芨種子萌發(fā)影響達顯著水平（P＜0.05），種子成熟度（B）對白芨種子萌發(fā)影響不顯著。由溫度和光照條件多重比較結果可知，溫度為25℃與30℃時差異不顯著，但溫度為20℃時與前兩者差異顯著；光照時長為0與16h／d時差異不顯著，但光照時長為24h／d時與前兩者差異顯著。

2.1.2 不同激素濃度 由表3可見，在培養(yǎng)基中添加適量激素對白芨的萌發(fā)有促進作用，萌發(fā)率相對于無激素的培養(yǎng)基有所提高，萌發(fā)速度較快。不同激素和濃度配比對白芨的萌發(fā)與幼苗的形成效果有明顯的差異。當培養(yǎng)基中NAA含量較高時白芨種子萌發(fā)較慢，萌發(fā)率相對較低，在種子萌發(fā)形成原球莖表面逐漸長出一些乳白色瘤狀小突起，繼續(xù)培養(yǎng)可發(fā)育成叢生苗；其次發(fā)現，一定范圍內當6－BA含量逐漸升高時形成的原球莖逐漸增大，在激素濃度較高時幼苗生長較高。觀察發(fā)現，當6－BA∶NAA＝3∶1時白芨幼苗長勢最好，35～40d后可見2～3片葉，幼苗平均可達3.1cm且葉為深綠色，長勢健壯（圖示）。

2.2 不同激素和濃度白芨根的長勢

將白芨幼苗轉入生根培養(yǎng)基20～30d后可觀察到在不同激素濃度下白芨幼苗生根率均在95%以上，生根率較高，且幼苗高度達5cm左右，得到壯苗，可看到膨大的原球莖（圖示）。由不同激素和濃度配比白芨種子的萌發(fā)與長勢可見，添加NAA對白芨生根有顯著作用，當NAA濃度高于1mg／L時幼苗逐漸出現黃化現象，不利于日后幼苗成活。當NAA濃度為1mg／L時幼苗生根效果最好，幼苗健壯。

2.3 白芨煉苗的培養(yǎng)條件

將白芨幼苗移栽到腐葉土∶鋸末＝1∶1的基質中保證遮光率達90%左右的環(huán)境下，用黑色遮陽網全遮蓋，每天噴霧狀水，空氣濕度在80%～90%即可，過濕則幼苗很快爛根死亡，溫度一般保持在（25±2）℃，30d后白芨可長出新根系。

3 結論與討論

1）張建霞［5］等研究表明，隨著白芨胚齡增大，胚成熟度逐漸增加，有胚率逐漸提高，種子萌發(fā)時間逐漸變短。胚齡為20周時采收最好，有胚率最高，萌發(fā)率100%，萌發(fā)只需1周。白芨果莢一般在每年7－9月成熟［6］，本發(fā)芽率試驗在11月進行，通過試驗發(fā)現，不同貯藏條件的白芨種子均能萌發(fā)，但以室溫20℃，貯藏期較短的萌發(fā)率最高，溫度較低和儲藏時間過長發(fā)芽率相對較低，結果與趙仁全［7］等研究相似，說明白芨種子不存在后熟，貯藏時間越長，種子易老化或發(fā)生劣變影響萌發(fā)率。

2）當培養(yǎng)基配比為MS＋6－BA3.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%，培養(yǎng)條件為光照16h／d，溫度25℃時，白芨種子萌發(fā)最快，幼苗生長最佳。而MS＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%時，對于誘導生根效果明顯，說明NAA在白芨叢生芽增殖中期主導作用，與袁寧［8］等得到的結果相似，其他結果與前人研究結果存在差異［4－5，9－11］，可能與種子的選擇和地域差異有關。

3）張建霞等［5］發(fā)現，白芨種子在萌發(fā)過程中對培養(yǎng)基的依賴性很低，萌發(fā)后可直接分化出葉原基和根原基，長成健苗。吳華芬等［12］研究表明，白芨原球莖誘導、增殖及分化成芽等過程可在同一培養(yǎng)基上進行。在此試驗之前，在大田條件下利用腐殖土直接播種，約14d后利用放大鏡可觀察到白芨已經形成黃綠色的原球莖，60d后可明顯觀察到白芨幼苗1片子葉展開，高2mm左右，說明，完全成熟的白芨種子含有的營養(yǎng)物質能夠提供種子萌發(fā)需要，但由于白芨自身營養(yǎng)不足在種子萌發(fā)的后期不足以維持幼苗繼續(xù)生長，故幼苗生長到一定時間會逐漸黃化死亡。在白芨種子萌發(fā)形成幼苗后通過放大鏡可以觀察都莖基部有白色絨毛狀物，可能為原球莖表皮發(fā)生的表皮毛，是具有吸收能力的“假根”［5］。試驗中用肉眼同樣可觀察到白芨根部存在白色絨毛狀物，可能與其自然生長中情況下的“菌根”有關，利于共生菌的附著，可深入研究形成機理及其共生菌類型及對白芨生長的作用。白芨實生種子快速繁殖幼苗長勢較好，能順利移栽到大田，進行大田生產。

4）根據白芨生長習性可知，白芨喜歡生長在濕潤疏松的土壤中，余朝秀等［4］經過多次對比試驗發(fā)現，煉苗前期的空氣濕度在80%～90%，溫度一般保持在（25±2）℃，使用腐葉土∶鋸末＝1∶1的基質中白芨成活率最高，達85%以上。但通過本試驗研究發(fā)現，將白芨幼苗移栽到遮光率達90%時，每天噴霧狀水，濕潤即可，過濕則幼苗很快爛根死亡。經過30d左右的精心管理白芨可長出新根系，煉苗階段結束，即可轉入常規(guī)管理。

［1］謝鳳勛，胡廷松.中藥原色圖譜及栽培技術［M］.北京：金盾出版社，2002：217－218.

［2］石云平，李 鋒，凌征柱.白芨組織培養(yǎng)與快速繁殖技術研究［J］.廣西農業(yè)科學，2009，40（11）：1408－1409.

［3］付志惠，張建霞，李洪林，等.白芨種子萌發(fā)與快速繁殖技術的研究［J］.武漢植物學研究，2006，24（1）：80－82.

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［5］張建霞，付志惠，李洪林，等.白芨胚發(fā)育與種子萌發(fā)的關系［J］.亞熱帶植物科學，2005，34（4）：32－35.

［6］張衛(wèi)明.中國植物膠資源開發(fā)研究與利用［M］.南京：東南大學出版社，2008（11）：161.

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［12］吳華芬，姚 宏，劉南祥，等.離體培養(yǎng)麗水野生白芨快速繁殖［J］.北方園藝，2008（6）：180－182.

（責任編輯：劉忠麗）

Rapid Propagation Technique of Bletilla Seeds

LI Chuan1，LI Erxing1，LIU Yang1，WU Qunjun2，YIN Yueyue1
（1.School of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University，Ankang，Shaanxi 725000；2.Xunyang New Forest Ecological Agriculture Co.Ltd.，Xunyang，Shaanxi 725772，China）

To provide references for germplasm resources preservation and large area planting of Bletilla，taking Bletilla seeds as the inoculating materials，orthogonal experiments were employed to study the germination rates of Bletilla seeds under different conditions，seedling rates of Bletilla seeds treated with different concentrations of hormones and the surviving rates of hardening－seedlings.Results：Germination rates of Bletillaseeds stored at 20℃for 30dreached the highest when culture temperature and illumination were 25℃and 16h／d respectively；Bletilla seeds germinated the fastest with good growth vigor under conditions of culture medium MS＋6－BA 3.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋sucrose 30%，illumination 16h／d，temperature 25℃.Culture medium MS＋NAA 1.0mg／L＋sucrose 30%had significant root inducting effects；The matrix leaf mould∶saw dust＝1∶1had the best hardening－seedling effects，the surviving rate could be above 85%when the temperature and humidity were controlled properly.

Bletillaseeds；seedling；protocorm

S567.23＋9

A

1001－3601（2016）08－0351－0105－04

2015－06－25；2016－07－02修回

陜西省科技廳項目“白及種苗繁殖及標準化栽培技術研究”（2015SF305）；陜西省教育廳項目“白及種質資源保護與馴化快繁技術研究”（2013JK0730）；安康學院項目“白及種子繁殖技術研究”（AYQDZR201004）；陜西省大學生科技創(chuàng)新項目（2014Sxjy－1799）

李 川（1976－），副教授，碩士，從事植物種質資源遺傳育種研究。E－mail：cyberlc＠163.com