成小璐，魏怡冰，魏升華，檀龍顏

（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550002）

羊耳菊種子生活力的最佳測(cè)定條件

成小璐，魏怡冰，魏升華＊，檀龍顏

（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550002）

為獲得羊耳菊種子生活力的最佳測(cè)定條件，采用四唑染色法，以氯化三苯基四氮唑（TTC）濃度、染色溫度和染色時(shí)間為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：TTC濃度1.5%、染色溫度40℃、染色時(shí)間3h為羊耳菊種子生活力測(cè)定的最佳條件，3個(gè)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)種子生活力測(cè)定的影響為染色溫度＞染色時(shí)間＞TTC濃度。

羊耳菊；種子；生活力；TTC染色法

羊耳菊又名羊耳風(fēng)（貴州）、山白芷等，為菊科（Compositae）旋覆花屬（Inula）植物羊耳菊〔Inula cappa（Buch.Ham.）DC.〕的根或全草［1］。具有除風(fēng)散寒、行氣止嘔、止咳定喘、止汗、止瀉、止血、消腫解毒及利濕的功效［2］。羊耳菊分布于四川、云南、貴州、廣西、廣東、江西、福建及浙江等地［1］。近年來(lái)，對(duì)羊耳菊的研究主要涉及化學(xué)成分、藥理學(xué)和生藥學(xué)方面［3－10］。因?yàn)檠蚨站哂辛己玫目咕拖椎人幱脙r(jià)值，所以多種中成藥把羊耳菊作為主要的原料藥，如蓮菊感冒膠囊［11］、甘菊滴丸［12］、菊黃上清含片［13］及貴州百靈藥業(yè)的雙羊喉痹通顆粒等。盡管對(duì)羊耳菊化學(xué)成分和藥理學(xué)等方面進(jìn)行了諸多研究，但有關(guān)羊耳菊引種馴化和人工栽培方面鮮有報(bào)道。

隨著市場(chǎng)需求量的增加，對(duì)羊耳菊的采挖力度逐年加大，但其野生資源有限，且目前各地尚未有人工種植。因此，對(duì)羊耳菊進(jìn)行引種馴化研究十分必要［14］。而藥用植物種子、種苗的生產(chǎn)是藥材生產(chǎn)的基礎(chǔ)，其質(zhì)量是藥材產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要前提和基礎(chǔ)［15］。種子質(zhì)量對(duì)羊耳菊規(guī)?；鸵?guī)范化種植起著關(guān)鍵性的作用，發(fā)芽率是檢測(cè)種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，但由于羊耳菊的發(fā)芽試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)而不能快速得到結(jié)果。測(cè)定種子生活力可以快速確定種子發(fā)芽能力，是種子生產(chǎn)和貿(mào)易的重要技術(shù)［16－17］。因此，筆者等對(duì)羊耳菊種子發(fā)芽能力的最佳測(cè)定條件進(jìn)行了試驗(yàn)，為客觀(guān)評(píng)價(jià)羊耳菊種子的發(fā)芽能力，預(yù)測(cè)其播種量和出苗率提供理論依據(jù)，為其大田播種育苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

羊耳菊種子于2014年12月29日采自貴州省安順市西秀區(qū)龍宮片區(qū)，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院鑒定為羊耳菊的種子，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，憑證標(biāo)本保存于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院標(biāo)本館。

試劑為氯化三苯基四氮唑（TTC）。

1.2 種子預(yù)處理

1）浸泡。將經(jīng)觀(guān)察到具胚、較飽滿(mǎn)的種子除去冠毛，置于濾紙上，加入蒸餾水，加水量以剛沒(méi)過(guò)種子為宜，待其吸脹后取出，用刀片切去種子靠近冠毛部位的1／4，置于直徑10cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿按10×10順序放置100粒種子，供染色用。

2）染色。每個(gè)培養(yǎng)皿加入不同濃度的TTC溶液，分別置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中避光染色，達(dá)到時(shí)間后取出種子，用清水沖洗，將種子放在濾紙上，根據(jù)染色面積大小及程度判斷種子生活力。另取100粒種子在沸水中煮10min后取出，染色，作為對(duì)照組。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 種子生活力測(cè)定適宜條件的試驗(yàn)

1.3.1 正交試驗(yàn) 以TTC濃度、染色溫度和染色時(shí)間3個(gè)直接影響生活力測(cè)定結(jié)果的因素作為檢測(cè)指標(biāo)，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平（表1）。

表1 羊耳菊種子生活力測(cè)定條件正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment for seed viability testing of I.cappa

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1）染色溫度 取羊耳菊種子100粒，TTC濃度為0.5%，染色時(shí)間為1h，染色溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，測(cè)定種子生活力。

2）染色液濃度 取羊耳菊種子100粒，染色溫度為35℃，染色時(shí)間為1h，TTC濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%，測(cè)定種子生活力。

3）染色時(shí)間 取羊耳菊種子100粒，染色溫度為35℃，TTC濃度為1.5%，染色時(shí)間分別為1h、2h、3h、4h及5h，測(cè)定種子生活力。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以染色溫度度（x1）、TTC濃度（x2）、染色時(shí)間（x3）3個(gè)因素為變量，以種子染色率（y）為響應(yīng)值。根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素5水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（表2）。

表2 羊耳菊種子生活力測(cè)定條件響應(yīng)面試驗(yàn)的因素及水平Table 2 Factors and levels in Box－Behnken experimental design for seed viability testing of I.cappa

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析軟件采用SPSS16.0和Design Expert 8.0.6軟件，P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，羊耳菊種子生活力最高（92%）的處理組合染色溫度40℃，TTC濃度1.0%，染色時(shí)間3h；生活力最低（29%）的組合為染色溫度30℃，TTC濃度0.5%，染色時(shí)間1h。將所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析結(jié)果（表4）表明，染色溫度差異極顯著，TTC濃度和染色時(shí)間均差異不明顯，3個(gè)因素對(duì)羊耳菊種子生活力測(cè)定影響的大小排序?yàn)槿旧珳囟龋救旧珪r(shí)間＞TTC濃度。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1看出，染色溫度在25～40℃時(shí)，種子的染色率隨溫度升高而升高。但當(dāng)溫度達(dá)到40℃后，隨著溫度升高，種子染色率增加緩慢。因此最佳測(cè)定溫度定為40℃左右。羊耳菊種子染色率隨著TTC濃度的增加而升高，當(dāng)TTC濃度達(dá)到1.5%時(shí)，種子染色率最高，當(dāng)濃度再增大時(shí)，種子染色率反而降低，因此將最佳測(cè)定濃度定為1.5%。染色時(shí)間在1～3h時(shí)，種子的染色率隨染色時(shí)間延長(zhǎng)而升高。但當(dāng)時(shí)間達(dá)3h后，時(shí)間再延長(zhǎng)，種子染色率增加緩慢。因此最佳測(cè)定時(shí)間定為3h左右。

表3 羊耳菊種子生活力測(cè)定正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment for seed viability testing of I.cappa

表4 羊耳菊種子生活力測(cè)定正交法試驗(yàn)的方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA for orthogonal experiment for seed viability testing of I.cappa

圖1 不同染色溫度、TTC濃度和染色時(shí)間種子的染色率Fig.1 Dyeing rate with different dyeing temperature，TTC concentration and dyeing time

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 模型的建立 利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得回歸方程為。對(duì)模型進(jìn)行方差分析（表6），F(xiàn)＝ 80.59，且P＜0.001，模型差異極顯著。模型中決定系數(shù)R2為0.986 4，調(diào)整決定系數(shù)RAdj2為0.974 2，表明響應(yīng)值為89.67%的變化來(lái)源于所選變量。模型的變異系數(shù)為5.16%（＜10%），表明試驗(yàn)有良好的穩(wěn)定性。模型的信噪比為29.406（＞4），表明該模型適用于種子生活力測(cè)定指標(biāo)的優(yōu)化。對(duì)模型系數(shù)的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明和x3對(duì)羊耳菊種子生活力測(cè)定影響極顯著，各因素及其一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)羊耳菊種子生活力測(cè)定的影響顯著，且3個(gè)因素對(duì)種子生活力測(cè)定的影響順序?yàn)槿旧珳囟龋救旧珪r(shí)間＞TTC濃度。

表5 羊耳菊種子生活力測(cè)定響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experimental results of Box－Behnken for seed viability testing of I.cappa

2.3.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖能直觀(guān)體現(xiàn)各兩個(gè)因素的交互作用對(duì)種子生活力響應(yīng)值的影響，響應(yīng)曲面的坡度越陡峭，則表明兩個(gè)因素的交互作用對(duì)種子生活力測(cè)定響應(yīng)值的影響越顯著。從圖2看出，染色溫度和TTC濃度、染色溫度和染色時(shí)間、TTC濃度和染色時(shí)間對(duì)種子生活力測(cè)定可產(chǎn)生影響，這與方程的方差分析結(jié)果一致。

表6 羊耳菊種子生活力測(cè)定響應(yīng)面試驗(yàn)的方差分析結(jié)果Table 6 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table for seed viability of I.cappa

圖2 各因素交互作用對(duì)生活力測(cè)定影響的響應(yīng)面Fig.2 Response surface of interaction between every two factors on testing seed viability

2.3.3 最佳測(cè)定條件確定 經(jīng)過(guò)Design Expert8.0.6軟件的分析，羊耳菊種子生活力測(cè)定的最佳條件為染色溫度40.84℃，TTC濃度1.578%，染色時(shí)間3.15h，在此測(cè)定條件下羊耳菊的生活力為98.396 5%。為驗(yàn)證方法的可行性，采用上述方法測(cè)定羊耳菊種子生活力，將其條件改為染色溫度40℃，TTC濃度1.5%，染色時(shí)間3h，在此條件下測(cè)定生活力進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，平均生活力為98.05%。該結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值相差0.346 5%，充分說(shuō)明響應(yīng)面分析法對(duì)羊耳菊生活力測(cè)定條件進(jìn)行的優(yōu)化可靠，有實(shí)用性。

3 結(jié)論與討論

1）盡管不同植物的種子用四唑染色法測(cè)定生活力時(shí)其適宜的測(cè)定條件各不相同，但一般選取TTC濃度、染色溫度和染色時(shí)間為檢測(cè)指標(biāo)。如白花前胡種子生活力測(cè)定的最佳條件以浸泡時(shí)間、TTC溶液濃度、染色溫度和染色時(shí)間為檢測(cè)指標(biāo)［18］；測(cè)定巨紫荊種子生活力的最佳條件以TTC濃度、染色溫度和染色時(shí)間為檢測(cè)指標(biāo)［19］。因此，筆者等以TTC濃度、染色溫度和染色時(shí)間為考察因素，測(cè)定羊耳菊種子生活力的最佳測(cè)定條件。白花前胡［18］和巨紫荊［19］種子生活力測(cè)定的最佳條件分別為T(mén)TC濃度1g／L、染色溫度35℃、染色16h 和TTC濃度0.1%、染色溫度35℃、染色時(shí)間為8h。由此可知，TTC濃度、染色時(shí)間和染色溫度的不同都會(huì)影響種子生活力的判斷，何伶俐［18］研究得出，染色溫度低于30℃和TTC液濃度高于5g／L時(shí)，白花前胡種子不染色或染色情況極差，將溫度設(shè)置在35℃左右，TTC液濃度在5g／L以下。凌敏［19］發(fā)現(xiàn)，TTC濃度低于0.10%和染色溫度高于50℃時(shí)，巨紫荊種子不染色或者染色情況較差，故將TTC濃度設(shè)置高于0.10%，染色溫度低于50℃。本試驗(yàn)在種子生活力測(cè)定前，也對(duì)羊耳菊種子生活力的TTC濃度及染色溫度做了簡(jiǎn)單對(duì)比，結(jié)果表明TTC濃度低于0.5%，溫度高于50℃時(shí)，羊耳菊種子不染色或染色情況差，因此試驗(yàn)時(shí)將TTC濃度設(shè)置高于0.5%，溫度低于50℃。

2）測(cè)定種子生活力染色前不同種子切割方法不同。白花前胡種子吸水膨大后取出，用刀片沿種子胚的中心線(xiàn)縱切為兩半［18］。梔子種子［20］用刀片沿種子胚中軸縱切成兩半。益母草種子［21］用刀片在距胚端3／4橫切，帶種胚部分進(jìn)行染色。本研究中羊耳菊種子細(xì)小，胚難以取出，橫切面直徑很小，因此靠近胚端方向1／4縱切，帶種胚部分進(jìn)行染色。

3）中心復(fù)合設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法是近年來(lái)應(yīng)用較多的一種優(yōu)化方法。優(yōu)化當(dāng)歸多糖提取工藝時(shí)，盛小莉等［22］用正交法，以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為考察因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)因素對(duì)結(jié)果均無(wú)顯著性影響，只能依據(jù)直觀(guān)分析結(jié)果確定最佳條件；但王艷艷等［23］和紀(jì)鵬等［24］分別用效應(yīng)面法時(shí)，均得到4個(gè)因素對(duì)當(dāng)歸多糖得率影響均較顯著，并結(jié)合回歸方程和響應(yīng)面結(jié)果圖確定最佳工藝條件。此外，在優(yōu)化丹參提取工藝時(shí)，李紹林等［25］用正交法，以提取次數(shù)、提取時(shí)間、醇濃度和溶媒量作為考察因素，只有提取次數(shù)對(duì)提取結(jié)果具有顯著性影響；而黃元紅等［26］用效應(yīng)面法得到4個(gè)因素影響均較顯著，并結(jié)合回歸方程和響應(yīng)面結(jié)果圖確定最佳工藝條件。效應(yīng)面法能考察各因素間的相互作用，試驗(yàn)次數(shù)少，精密度高。將效應(yīng)值對(duì)影響因素作曲面圖，直接讀取，有直觀(guān)、精密的優(yōu)點(diǎn)。集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體使結(jié)果更加科學(xué)可靠，在藥學(xué)應(yīng)用上成效顯著［27］。但至今未有將此方法應(yīng)用于種子方面的研究。筆者分別用正交法和效應(yīng)面法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以生活力大小為指標(biāo)考察羊耳菊種子生活力的最佳測(cè)定條件，得到染色溫度40℃、TTC濃度1.5%、染色時(shí)間3h為羊耳菊種子生活力測(cè)定的最佳條件，且3個(gè)因素對(duì)種子生活力測(cè)定的影響順序?yàn)槿旧珳囟龋救旧珪r(shí)間＞TTC濃度。與正交設(shè)計(jì)分析法相比較，響應(yīng)面分析法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果表達(dá)方面更加優(yōu)良，可作為四唑染色法測(cè)定羊耳菊種子生活力的方法。

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（責(zé)任編輯：聶克艷）

Optimal Determination Method of Seed Viability of Inula cappa

CHENG Xiaolu，WEI Yibing，WEI Shenghua＊，TAN Longyan

（College of Pharmacy，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou550002，China）

In order to find out the best determination conditions of seed viability of I.cappa，the method of 2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride（TTC）was employed with indicators of TTC concentration，dyeing temperature and dyeing time，and the determination conditions were optimized by using orthogonal method and response surface methodology.Results：1.5%，40℃，3hwere the best dyeing conditions of TTC concentration，dyeing temperature and dyeing time respectively.And the order of the three factors influencing seed viability test is dyeing temperature＞dyeing time＞TTC concentration.

Inula cappa；seed；viability；2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride dyeing method

S567

A

1001－3601（2016）08－0350－0100－05

2015－12－30；2016－08－08修回

國(guó)家中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目“國(guó)家基本藥物目錄原料種子種苗繁育（貴州）基地建設(shè)”（2014－2015）；貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院博士基金項(xiàng)目“羊耳菊野生變家種技術(shù)研究”（2015）

成小璐（1991－），女，在讀碩士，研究方向：中藥與民族藥品質(zhì)量及鑒定。E－mail：930368512＠qq.com

＊通訊作者：魏升華（1965－），男，副教授，從事藥用植物資源、引種馴化、中藥材生產(chǎn)與民族醫(yī)藥開(kāi)發(fā)等的教學(xué)和研究。E－mail：weishenghua6512＠126.com