閆　哲，彭麗麗，申　婷，張洪珍，2

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050017；2. 河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

康萊特注射液對(duì)Lewis 肺癌小鼠TAM及HIF-1α的影響

閆哲1，彭麗麗1，申婷1，張洪珍1，2

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050017；2. 河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的研究康萊特注射液對(duì)Lewis 肺癌小鼠腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)的影響。方法將造模成功Lewis 肺癌荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型組、康萊特組、順鉑組及康萊特+順鉑組，模型組給予生理鹽水腹腔注射，其余組均分別給予相應(yīng)藥物腹腔注射。干預(yù)14 d后處死各組小鼠取瘤組織，流式細(xì)胞儀檢測(cè)TAM的比例，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HIF-1αmRNA的表達(dá)情況。結(jié)果康萊特組、順鉑組及康萊特+順鉑組小鼠瘤質(zhì)量均明顯低于模型組(P均<0.05)；康萊特+順鉑組與順鉑組抑瘤率均明顯高于康萊特組(P均<0.05)，但康萊特+順鉑組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。順鉑組小鼠脾指數(shù)明顯低于其他3組(P均<0.05)，康萊特組小鼠脾指數(shù)明顯高于其他3組(P均<0.05)，而康萊特+順鉑組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？等R特組和康萊特+順鉑組TAM比例均明顯低于模型組(P均<0.05)，康萊特組和康萊特+順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，康萊特+順鉑組明顯低于順鉑組(P<0.05)?？等R特組、順鉑組、康萊特+順鉑組HIF-1α表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，康萊特+順鉑組HIF-1α表達(dá)量均明顯低于康萊特組、順鉑組(P均<0.05)，而康萊特組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論康萊特注射液具有抗腫瘤作用，與順鉑聯(lián)用可增強(qiáng)化療療效、提高小鼠免疫功能，可能是通過降低TAM水平、改善缺氧實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]康萊特注射液；Lewis 肺癌；腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

肺癌在世界范圍內(nèi)死亡率居惡性腫瘤的首位。鉑類為主的化療藥物在肺癌綜合治療中占有重要地位，但毒副作用限制了其應(yīng)用。多項(xiàng)研究表明康萊特注射液對(duì)化療具有增效減毒作用[1]，但具體機(jī)制尚不十分明確。本研究從腫瘤免疫微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)和缺氧微環(huán)境標(biāo)志之一缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)出發(fā)，研究了康萊特注射液聯(lián)合順鉑對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠的影響及其相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1動(dòng)物健康雄性昆明種小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量18～24 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證編號(hào)：1409008)，給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，不控制飲水，由河北省人民醫(yī)院臨研中心提供SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室。

1.2細(xì)胞株小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3主要藥品及試劑康萊特注射液購(gòu)于浙江康萊特藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10970091；注射用順鉑購(gòu)于齊魯制藥有限公司，規(guī)格:10 mg,國(guó)藥準(zhǔn)字H20023461。四季青胎牛血清為浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；DMEM高糖培養(yǎng)液為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自R&D Systems,Inc.USA。PE-CD11b、FITC-F4/80 mAb購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1模型的建立及分組干預(yù)Lewis肺癌細(xì)胞株復(fù)蘇后傳代，取傳至3～4代生長(zhǎng)良好的Lewis肺癌細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活性>95%，配制細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，0.2 mL/只注射于小鼠左前腋窩皮下。接種6～7 d后，小鼠左前腋皮下可觸及2～3 mm直徑硬結(jié)，證實(shí)移植瘤模型建立成功。隔日定時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑(a)及最短徑(b)，待最長(zhǎng)徑為0.8～1 cm時(shí)，舍棄腫瘤過大(ab>2.5 cm2) 或過小(ab<0.20 cm2) 的小鼠,挑選腫瘤大小較均一的荷瘤小鼠24只，隨機(jī)分為模型組、康萊特組、順鉑組及康萊特+順鉑組，每組6只。模型組給予生理鹽水腹腔注射，其余組均分別給予相應(yīng)藥物腹腔注射。其中生理鹽水、康萊特注射液按12.5 mL/kg，順鉑按1 mg/kg(將10 mg順鉑溶于125 mL氯化鈉注射液中)每天腹腔注射，兩次注射之間間隔12 h，連續(xù)注射14 d。

1.4.2腫瘤抑制率及脾臟指數(shù)計(jì)算干預(yù)第15天脫頸處死小鼠，完整剝離腫瘤及脾臟，分別稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率及脾臟指數(shù)。抑瘤率= (模型組平均瘤質(zhì)量-干預(yù)組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。脾臟指數(shù)=脾質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

1.4.3腫瘤組織TAM比例檢測(cè)將腫瘤組織機(jī)械法制備成細(xì)胞懸液，加入PE-F4/80+和FITC-CD11b+抗體各2 μL，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b+ F4/80+細(xì)胞含量。

1.4.4腫瘤組織HIF-1αmRNA表達(dá)量檢測(cè)提取細(xì)胞總RNA，電泳鑒定完整性和純度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán)，后延伸72 ℃ 10 min。按照RQ=2-△△Ct計(jì)算HIF-1α mRNA表達(dá)水平的RQ值，用于統(tǒng)計(jì)分析。GAPDH作內(nèi)參照，上游引物序列為5’-TGAACGGGAAGCTCACTG-3’，下游為5’-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3’，片段長(zhǎng)度為121 bp；HIF-1α上游引物序列為5’-TCAAAGTCGGACAGCCTCA-3’，下游為5’-CCCTGCAGTAGGTTTCTGCT-3’，片段長(zhǎng)度為90 bp。

2結(jié)果

2.1各組小鼠一般情況接種癌細(xì)胞后，早期無明顯變化，接種6～7 d后，小鼠左前腋皮下可觸及2～3 mm直徑硬結(jié)，皮下移植瘤生長(zhǎng)，進(jìn)食、活動(dòng)較前減少，毛發(fā)欠光澤，有脫落。第10天絕大部分小鼠腫瘤最長(zhǎng)徑0.8～1.0 cm。后期模型組部分荷瘤小鼠反應(yīng)遲鈍，腫瘤局部皮膚可見點(diǎn)片狀潰爛、滲血、滲液，少數(shù)因瘤體積過大而出現(xiàn)左前肢運(yùn)動(dòng)障礙。而各給藥組小鼠較模型組小鼠進(jìn)食多、活動(dòng)敏捷。

2.2各組腫瘤抑制率比較康萊特組、順鉑組及康萊特+順鉑組小鼠瘤質(zhì)量均明顯低于模型組(P均<0.05)；康萊特+順鉑組與順鉑組抑瘤率均明顯高于康萊特組(P均<0.05)，但康萊特+順鉑組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組小鼠瘤質(zhì)量及腫瘤抑制率比較

注：①與模型組比較，P<0.05；②與康萊特組比較，P<0.05。

2.3各組小鼠脾臟指數(shù)比較模型組、康萊特組、順鉑組、康萊特+順鉑組脾臟指數(shù)分別為(7.31±1.50)mg/g、(9.70±1.53)mg/g、(4.58±1.29)mg/g、(6.54±1.68)mg/g 。順鉑組小鼠脾指數(shù)明顯低于其他3組(P均<0.05)，康萊特組小鼠脾指數(shù)明顯高于其他3組(P均<0.05)，而康萊特+順鉑組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4各組腫瘤組織TAM比例模型組、康萊特組、順鉑組、康萊特+順鉑組TAM比例分別為(6.41±1.73)%、(4.27±1.44)%、(6.52±1.77)%、(4.08±0.67)%。康萊特組和康萊特+順鉑組TAM比例均明顯低于模型組(P均<0.05)，康萊特組和康萊特+順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，康萊特+順鉑組明顯低于順鉑組(P<0.05)。雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見圖1～4。

圖1　模型組腫瘤組織TAM比例

圖2　康萊特組腫瘤組織TAM比例

圖3　順鉑組腫瘤組織TAM比例

圖4　康萊特+順鉑組腫瘤組織TAM比例

2.5各組腫瘤組織中HIF-1αmRNA表達(dá)情況模型組、康萊特組、順鉑組、康萊特+順鉑組HIF-1αmRNA表達(dá)量分別為2.47±0.57，1.59±0.39，1.76±0.49，1.03±0.21?？等R特組、順鉑組、康萊特+順鉑組HIF-1α表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，康萊特+順鉑組的HIF-1α表達(dá)量均明顯低于康萊特組、順鉑組(P均<0.05)，而康萊特組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展和醫(yī)療水平的提高，肺癌的治療已從單一方法治療逐步發(fā)展成手術(shù)、放化療、靶向治療、免疫治療等綜合治療[2]。2006年世界衛(wèi)生組織將包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的定位從“不治之癥”轉(zhuǎn)變?yōu)椤翱梢钥刂频穆约膊　盵3]，但肺癌患者確診時(shí)30%～40%已是局部晚期，40%有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，整體5年生存率并未隨治療手段的多樣化而顯著改善，其原因也與治療主要著眼于腫瘤細(xì)胞本身，而極少考慮其所處微環(huán)境有關(guān)。腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細(xì)胞及其周圍的成纖維細(xì)胞、固有及特異性免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)、血管和淋巴管結(jié)構(gòu)的組成細(xì)胞(上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管外膜細(xì)胞等) 及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等[4]，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其關(guān)系密切，按照其特點(diǎn)可分為腫瘤缺氧微環(huán)境、腫瘤酸性微環(huán)境及腫瘤免疫微環(huán)境。

TAM是腫瘤免疫微環(huán)境中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞群，主要由外周循環(huán)中的單核細(xì)胞在多種趨化因子作用下招募至腫瘤組織，并分化增殖而來，在腫瘤微環(huán)境中，TAM具有抑制免疫、促進(jìn)血管生成和組織重塑的作用[5]。研究認(rèn)為TAM通過誘導(dǎo)多種生長(zhǎng)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解、介導(dǎo)免疫逃逸、促進(jìn)血管和淋巴管生成等方式，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致不良預(yù)后[6]；其還可通過削弱Caspase凋亡信號(hào)通路[7]、高表達(dá)半胱氨酸組織蛋白酶[8]等途徑參與化療耐藥。HIF-1是在缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中的一種具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，由功能型α亞基和構(gòu)成型β亞基組成，其生物效應(yīng)由α亞基完成。HIF-1α通過激活下游靶基因如促紅細(xì)胞生成素(EPO)、葡萄糖載體蛋白1,3(GLUT1,3)、p53等，影響腫瘤及周圍組織的血管發(fā)生、紅細(xì)胞生成、糖代謝、細(xì)胞凋亡、上皮間質(zhì)化等[9-10]，或調(diào)節(jié)酶活性降低活性氧簇(ROS)水平[11]促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移。

近年來，“補(bǔ)充替代醫(yī)學(xué)”在惡性腫瘤的治療中應(yīng)用越來越廣泛，中藥作為補(bǔ)充替代醫(yī)學(xué)的一大主要形式正逐步被廣泛應(yīng)用?？等R特注射液是目前臨床用于肺癌的中藥制劑之一，提取自傳統(tǒng)利水滲濕類中藥薏苡仁，大量的基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)康萊特注射液具有抗腫瘤、化療增效減毒[11]、增強(qiáng)免疫、提高生活質(zhì)量[12]等作用，有關(guān)機(jī)制涉及降低耐藥相關(guān)因子MDR1/P-gp、NF-κB/IκB等的水平，阻斷有絲分裂，促腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制血管和淋巴管生成，抑制COX-2表達(dá)等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，康萊特+順鉑組與順鉑組抑瘤率均明顯高于康萊特組，但康萊特+順鉑組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；順鉑組小鼠脾指數(shù)明顯低于其他3組，康萊特組小鼠脾指數(shù)明顯高于其他3組，而康萊特+順鉑組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；康萊特組和康萊特+順鉑組TAM比例均明顯低于模型組，康萊特組和康萊特+順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，康萊特+順鉑組明顯低于順鉑組；康萊特組、順鉑組、康萊特+順鉑組HIF-1α表達(dá)量均明顯低于模型組，康萊特+順鉑組HIF-1α表達(dá)量均明顯低于康萊特組、順鉑組，而康萊特組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

提示康萊特注射液?jiǎn)斡眉芭c順鉑聯(lián)用均可抑制腫瘤生長(zhǎng)，能降低Lewis肺癌組織中TAM比例及HIF-1αmRNA表達(dá)量，兩者聯(lián)合應(yīng)用效果更明顯，且康萊特注射液與順鉑聯(lián)用可顯著升高脾臟指數(shù)，說明康萊特除本身具有抗腫瘤作用外，還可改善化療藥物所致的免疫抑制。

綜上所述，康萊特注射液的抗腫瘤機(jī)制可能是通過提高機(jī)體免疫功能、降低腫瘤微環(huán)境中的TAM水平、改善缺氧實(shí)現(xiàn)的。

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Effects of Kanglaite injection on TAM and expression of HIF-1α in vivo in Lewis lung carcinoma mice

YAN Zhe1, PENG Lili1, SHEN Ting1, ZHANG Hongzhen1,2

(1. Graduate School of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China；2. Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of Kanglaite injection (KLT) on tumor associated macrophage (TAM)and expression of hypoxia inducible factor-1 alpha(HIF-1α) in Kunming mice with Lewis lung carcinoma. Methods The models sucessfully established of Kunming mice with Lewis lung carcinoma were randomly divided into four groups: the control (NS)group, KLT group, cisplatin(DDP) group and DDP+KLT group. Tumors were harvested 14 days after corresponding interventions. The percentage of TAM was determined by flow cytometry and HIF-1αmRNA was detected by realtime-PCR. Results Tumor weight of mice in KLT group, DDP group and DDP+KLT group was significantly lower than that of NS group(P<0.05); Tumor growth inhibition rate in DDP+KLT group was higher than DDP group,without statistical significance(P>0.05). The spleen index was lower in DDP group than in NS group(P<0.05),but was significantly increased when combined with KLT (P<0.05). The percentage of TAM was higher in DDP group than in NS group, but was not statistically significant(P>0.05), and the combination with KLT significantly decreased the percentage(P<0.05). Expression of HIF-1αwas lower in KLT group,DDP group and DDP+KLT group than in NS group,and it decreased more in DDP+KLT group(P<0.05). Conclusion KLT has pronounced antitumor activity in mice with Lewis lung carcinoma.It enhances the chemotherapy effect and improve immunity function when combined with cisplatin,which can be accomplished by decreasing the TAM level and improving hypoxia status.

Key words:Kanglaite; Lewis lung carcinoma；tumor associated macrophage; hypoxia inducible factor-1α

[作者簡(jiǎn)介]閆哲，女，碩士，研究方向?yàn)榉暖煘橹鞯膼盒阅[瘤綜合治療。 [通信作者]張洪珍，E-mail: 1256596529@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.10.007

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)10-1047-04

[收稿日期]2015-10-30