白玉娟，李琦軍，周紅艷，李　炎，張國亮

(河北省石家莊市第三醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

神經(jīng)肽Y對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的調(diào)節(jié)作用研究

白玉娟，李琦軍，周紅艷，李炎，張國亮

(河北省石家莊市第三醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

[摘要]目的探討神經(jīng)肽Y(NPY)對大鼠神經(jīng)小膠質(zhì)細胞生成白細胞介素-1β(IL-1β)的影響以及對神經(jīng)元凋亡的調(diào)節(jié)作用。方法培養(yǎng)原代大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞，分為5組，對照組以無血清培養(yǎng)基孵育，LPS組以含脂多糖(LPS)的無血清培養(yǎng)基孵育，NPY+LPS組先后予含NPY和LPS的無血清培養(yǎng)基孵育，NPY組以含NPY的無血清培養(yǎng)基孵育，BIBP3226+NPY+LPS組先后用含BIBP3226、NPY和 LPS的無血清培養(yǎng)基孵育。孵育6 h后，ELISA方法檢測各組培養(yǎng)液中IL-1β蛋白含量，RT-PCR方法檢測各組小膠質(zhì)細胞中IL-1β mRNA表達水平。然后用各組培養(yǎng)液分別孵育原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，采用Hoechst33258染色鑒定神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果LPS組培養(yǎng)液中IL-1β蛋白含量及小膠質(zhì)細胞中IL-1β mRNA表達水平均顯著高于對照組(P均<0.05)，神經(jīng)元凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。NPY+LPS組培養(yǎng)液中IL-1β蛋白含量和小膠質(zhì)細胞中IL-1β mRNA表達水平均明顯低于LPS組(P均<0.05)，神經(jīng)元凋亡率明顯低于LPS組 (P<0.05)。BIBP3226+NPY+LPS組培養(yǎng)液中IL-1β蛋白含量及小膠質(zhì)細胞中IL-1β mRNA表達水平明顯高于NPY+LPS組(P均<0.05)，神經(jīng)元凋亡率顯著高于NPY+LPS組(P<0.05)。結(jié)論NPY有可能通過其Y1受體降低過度激活的小膠質(zhì)細胞免疫活性，抑制其生成IL-1β，從而減少大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡。

[關(guān)鍵詞]小膠質(zhì)細胞;神經(jīng)肽Y;IL-1β;神經(jīng)元;凋亡

小膠質(zhì)細胞(MG)是巨噬細胞的一種，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。小膠質(zhì)細胞還是大腦中產(chǎn)生炎癥因子的主要細胞之一，當受到刺激后成活化狀態(tài)，可釋放白細胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α等細胞因子以及其他一些生物活性物質(zhì)，其中有些物質(zhì)會導(dǎo)致神經(jīng)元受損。神經(jīng)肽Y(NPY)是一種多肽，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布，對神經(jīng)系統(tǒng)有保護作用，其作用機制需要進一步研究。本研究探討了NPY對大鼠神經(jīng)小膠質(zhì)細胞生成IL-1β的影響以及對神經(jīng)元凋亡的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1實驗資料

1.1實驗動物及試劑24 h內(nèi)新生SD大鼠30只，清潔級，河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(冀)2013-1-03。主要試劑：小鼠單克隆抗體IBA-1，脂多糖(LPS，美國Sigma公司)，F(xiàn)ITC標記的山羊抗小鼠IgG(美國Proteintech公司)，胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，BIBP3226(美國Tocris Bioscience公司)，NPY(美國ENZO公司)，ELISA試劑盒(中國Bio-Swamp公司)。

1.2混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及小膠質(zhì)細胞的分離純化參照Nakajima等[1]所述方法。24 h內(nèi)新生SD大鼠無菌環(huán)境下開顱取腦，剝除腦膜及血管，取部分大腦皮質(zhì)，剪碎后用0.125%胰蛋白酶37 ℃消化15 min，終止消化后反復(fù)吹打成懸液，1 000 r/min離心5 min后過濾，棄上清，在沉淀物中加入含10%胎牛血清和1 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基制成細胞懸液，接種于大培養(yǎng)瓶(75 cm2,250 mL)中，置于培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中進行培養(yǎng)，第2天全量換液1次，以后每3 d更換1/2體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第14天，看到細胞充分分層生長后， 置于37 ℃恒溫搖床中180 r/min振搖2 h，收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清，用DMEM/F12全培養(yǎng)基吹打成細胞懸液，接種于底部預(yù)涂多聚賴氨酸的培養(yǎng)板，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置30 min后完全換液1次，去除少突膠質(zhì)細胞,加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，供實驗用。

1.3原代神經(jīng)元的培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的分離培養(yǎng)按照Yang等[2]所述的方法。24 h內(nèi)新生SD大鼠無菌環(huán)境下開顱取腦，沖洗干凈后取雙側(cè)海馬組織，仔細去除血管及腦膜，將海馬組織剪碎后0.125%胰蛋白酶37 ℃消化15 min，終止消化后打成細胞懸液，過濾去除細胞團塊，濾液接種于底部放置預(yù)涂多聚賴氨酸圓玻片的6孔培養(yǎng)板, 置于培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中進行混合細胞培養(yǎng)。24 h后全量換成含2%B27、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)液，根據(jù)情況2～3 d換液1次，培養(yǎng)7～9 d，即可獲得純化的海馬神經(jīng)元。

1.4細胞形態(tài)學(xué)觀察及純度鑒定原代小膠質(zhì)細胞接種于內(nèi)置預(yù)涂多聚賴氨酸蓋玻片的培養(yǎng)板，培養(yǎng)3 d后取出蓋玻片，經(jīng)PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30 min，0.3%Triton×100破膜10 min，3%山羊血清封閉30 min，加IBA-1抗體(1∶200),4 ℃過夜;熒光二抗,37 ℃孵育1 h，Hoechst33258染色細胞核5 min，山羊血清封閉后除外，余各步驟之間用PBS沖洗3遍，封片后熒光顯微鏡觀察原代小膠質(zhì)細胞細胞形態(tài)。用WAP-2抗體免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元,步驟同小膠質(zhì)細胞。陽性率計數(shù)方法:熒光顯微鏡下隨機選取，計數(shù)5個高倍視野,計算原代小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元陽性細胞的百分率。

1.5小膠質(zhì)細胞分組及處理方法以1×105mL-1的濃度將小膠質(zhì)細胞種于預(yù)鋪多聚賴氨酸的六孔板內(nèi)，每孔3 mL，培養(yǎng)3 d后換新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)孵育12 h,將各孔隨機分為對照組、LPS組、NPY+LPS組、NPY組、BIBP3226+NPY+LPS組。對照組以無血清培養(yǎng)基孵育6 h，LPS組以含終濃度為100 ng/mL LPS的無血清培養(yǎng)基孵育6 h，NPY+LPS組先以含終濃度1 μmol/L NPY的無血清培養(yǎng)基孵育0.5 h，然后加入終濃度為100 ng/mL LPS繼續(xù)孵育6 h，NPY組以含終濃度1 μmol/L NPY無血清培養(yǎng)基孵育6 h，BIBP3226+NPY+LPS組先用含終濃度1 μmol/L BIBP3226的無血清培養(yǎng)基孵育0.5 h，余步驟同NPY+LPS組。

1.6培養(yǎng)液中IL-1β蛋白含量的測定用ELISA法檢測。將酶標板分為陽性對照孔、空白對照孔和待測樣品孔，將不同濃度的標準品加入陽性對照孔，每孔50 μL，空白對照孔不加樣品、酶標試劑及生物素標記的抗IL-1β抗體，待測樣品孔中先加各組樣品40 μL，然后再加生物素標記的抗IL-1β抗體10 μL。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。重復(fù)洗板5次，拍干。每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。溫育30 min，洗板，加入顯色劑，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。酶標儀檢測，以空白對照孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進行。以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線。根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度。

1.7小膠質(zhì)細胞中IL-1β mRNA表達水平的測定采用實時熒光定量PCR法檢測上述各組小膠質(zhì)細胞中IL-1β mRNA表達水平。小膠質(zhì)細胞加入Trizol(1 mL/孔)，吹打后移至去核酶的離心管中，靜置5 min。每管加入0.2 mL氯仿，震蕩15 s，靜置5 min。12 000 r/min離心15 min，把上層無色液體移到新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，管底可見羽毛狀白色沉淀物，完全棄去上清。加入1 mL 75%乙醇(DEPC水配置)，洗滌沉淀。4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清。靜置晾干3～5 min，加入20～30 μL DEPC水充分溶解RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳證實RNA完整性較好，無污染。紫外分光光度計檢測RNA濃度。引物由上海生工生物公司合成。IL-1β上游引物為5’-CTCCATGAGC TTTGTACAAGG-3’，IL-1β下游引物為5’-TGCTGATGTACCAGTTGGG-3’，擴展長度為245 bp。GAPDH上游引物為5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG -3’，GAPDH下游引物為5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’，擴增長度為120 bp。實時PCR反應(yīng)中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總RNA 8 μL，隨機引物1 μL，2×ESReaction Mix 10 μL，RT/RI Enzyme Mix 1 μL，總體積20 μL。擴增體系：2×UltraSYBR Mixture(with ROX)10 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，cDNA 8 μL，總體積20 μL。RT-PCR反應(yīng)程序參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 15 s，退火58 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 27 s，40個循環(huán)。用ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City,CA,USA)檢測并計算目的基因表達量與內(nèi)參GAPDH比較的相對值(RQ值)，用于統(tǒng)計分析。

1.8神經(jīng)元凋亡和壞死的檢測將LPS組、NPY+LPS組、NPY組、BIBP3226+NPY+LPS組原代小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液分別與神經(jīng)元培養(yǎng)液1∶1混合，將對照組培養(yǎng)液與神經(jīng)元培養(yǎng)液1∶1混合后分為對照組、對照+LPS組、對照+NPY組,在對照+LPS組、對照+NPY組中分別加入終濃度50 ng/mL LPS和終濃度0.5 μmol/L NPY,每組5個樣本。用各組混合培養(yǎng)液孵育純化好的神經(jīng)元細胞。12 h后取出蓋玻片，行Hoechst 33258染色：①將取出的蓋玻片用1×PBS洗3遍，沖洗要溫柔，防止細胞脫落，將沖洗好的蓋玻片放在干凈的載玻片上。②加入預(yù)冷的純丙酮固定30 min，然后用1×PBS洗3遍。③在避光條件下，加入Hochst染色，室溫，染色5 min，用1×PBS洗3遍。④防淬滅水溶性封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1大鼠大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細胞胞體小，胞體有細長突起(箭頭)，IBA-1染色陽性，見圖1。

圖1　小膠質(zhì)細胞IBA-1染色表現(xiàn)(×400，25 μm)

2.2神經(jīng)元形態(tài)學(xué)表現(xiàn)WAP-2免疫染色后的神經(jīng)元，細胞被染成綠色，細胞核染色后成藍色，神經(jīng)元具有細長的軸突(箭頭)和長的樹突，見圖2。經(jīng)鑒定，純度大于95%，滿足實驗需要。

圖2　大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞MAP-2免疫熒光染色表現(xiàn)(×400，25 μm)

2.3培養(yǎng)液中IL-1β蛋白含量及各組細胞中IL-1β mRNA表達水平LPS組培養(yǎng)液中IL-1β蛋白含量及小膠質(zhì)細胞中IL-1β mRNA表達水平均顯著高于對照組(P均<0.05),NPY+LPS組培養(yǎng)液中IL-1β蛋白含量和小膠質(zhì)細胞中IL-1β mRNA表達水平均明顯低于LPS組及BIBP3226+NPY+LPS組(P均<0.05)，NPY組培養(yǎng)液中IL-1β蛋白含量和小膠質(zhì)細胞中IL-1β mRNA表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1　各組培養(yǎng)液中IL-1β蛋白含量及細胞中IL-1β mRNA表達水平比較

注：①與對照組比較，P<0.05；②與LPS+NPY組比較，P<0.05。

2.4神經(jīng)元凋亡和壞死情況LPS組神經(jīng)元凋亡率為(67.74±11.88)%，LPS+NPY組為(13.35±1.13)%，NPY組為(1.63±0.33)%，BIBP3226+NPY+LPS組為(72.05±4.73)%，對照組為(0.97±0.39)%，對照+LPS組為(1.07±0.15)%，對照+NPY組為(2.01±0.32)%。LPS組神經(jīng)元凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。NPY+LPS組神經(jīng)元凋亡率明顯低于LPS組及BIBP3226+NPY+LPS組(P均<0.05)。與對照組相比，對照+LPS組和對照+NPY組神經(jīng)元凋亡率沒有明顯變化(P均>0.05)。

3討論

小膠質(zhì)細胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。當中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生變化時，小膠質(zhì)細胞呈激活狀態(tài)，產(chǎn)生一系列變化，起到中樞神經(jīng)系統(tǒng)感受器的作用[3]。例如有人使用海人酸誘發(fā)癲癇大發(fā)作，觀察到癲癇傳播區(qū)域分布的小膠質(zhì)細胞很早就被激活[4]，且小膠質(zhì)細胞生物活性與癲癇的發(fā)作頻率及持續(xù)時間有密切關(guān)系[5]。很多資料顯示小膠質(zhì)細胞激活還和中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病有關(guān)[6-8]。LPS可以激活小膠質(zhì)細胞，使之處于活化狀態(tài)，分泌相關(guān)炎癥因子。NPY對神經(jīng)系統(tǒng)有保護作用，其與位于突觸上的Y2受體相結(jié)合，減少細胞釋放谷氨酸，減輕神經(jīng)元的興奮性損傷[9]。NPY Y1與細胞免疫反應(yīng)密切相關(guān)，直接影響小膠質(zhì)細胞細胞因子與多種抗體釋放以及細胞遷移活動[10-12]。周江睿等[13]對RAW264.7細胞的研究結(jié)果說明，NPY可以抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和前列腺素B2的釋放，且能夠促進炎癥因子HMGB1的釋放。Ferreira等[14]研究表明，NPY可以抑制LPS所致的小鼠小膠質(zhì)細胞N9細胞株的激活，減少NO的生成；且給予NPY后，N9細胞的吞噬作用以及遷移能力明顯下降，這種作用與NPY Y1受體有關(guān)[15-17]。

本實驗采用LPS激活小膠質(zhì)細胞，干預(yù)6 h后，小膠質(zhì)細胞的免疫活性明顯增強，小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中IL-1β含量明顯高于對照組。給予NPY后，LPS對小膠質(zhì)細胞的激活作用明顯降低，小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中IL-1β蛋白量和小膠質(zhì)細胞內(nèi)的IL-1β水平也隨之下降，阻斷NPY Y1受體后，LPS作用完全消失，說明NPY Y1受體在NPY降低小膠質(zhì)細胞的免疫活性，減少IL-1β產(chǎn)生的過程中起著關(guān)鍵作用，這與Ferreira等[14]研究N9細胞株的結(jié)果一致。筆者用各組小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液去孵育原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，Hoechst33258染色示 LPS組刺激后神經(jīng)元凋亡率明顯高于對照組，提前給予NPY能夠明顯抑制小膠質(zhì)細胞的激活，其培養(yǎng)液孵育的神經(jīng)元凋亡率明顯降低，在加入BIBP3226阻斷NPY Y1受體后，NPY的這種作用消失。與對照組相比，對照+LPS組和對照+NPY組神經(jīng)元凋亡率沒有明顯變化，說明神經(jīng)元凋亡的變化不是由LPS和NPY引起的，而是由激活后小膠質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)液中的活性物質(zhì)導(dǎo)致，IL-1β可能在其中起著重要作用。本實驗說明NPY在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著調(diào)節(jié)免疫功能的重要作用，它有可能通過對小膠質(zhì)細胞的功能調(diào)節(jié)，進而減少神經(jīng)元的凋亡，起到保護神經(jīng)元的作用。

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Regulation of neuropeptide Y on the apotosis of cerebral cortical neurons in rats

BAI Yujuan, LI Qijun, ZHOU Hongyan, LI Yan, ZHANG Guoliang

(The Third Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to explore the effect of neuropeptide Y (NPY)on IL-1B produced by microgliacytes in rats and the regulation on the apotosis of neurons. Methods The rat primary microgliacytes were cultured and divided into 5 groups: control group, lipopolysaccharide (LPS) group， NPY+LPS group, NPY group, BIBP3226+NPY+LPS group, which were respectively cultured by serum-free medium (SFM), SFM+LPS, SFM+NPY+LPS, SFM+NPY, BIBP3226+NPY+LPS. After culture for 6h, the content of IL-1B in culture liquid in every group were detected by ELISA, the expression of IL-1B were detected by RT-PCR. The apotosis of neurons were evaluated by Hoechst32258 staining. Results The contents of IL-1B in culture liquid and the expression level of IL-1B mRNA in microgliacytes in LPS group and apotossi rate were significantly higher than that in control group (P<0.05), and these indexes in NPY+LPS group were significantly lower than those in LPS group (P<0.05), these indexes in BIBP3226+NPY+LPS group were also higher than those in NPY+LPS group (all P<0.05). Conclusion NPY can low down the over-activity of immunity of microgliacytes by its Y1 receptor, inhibit production of IL-1B, thus to decrease the apotosis of neurons in the rats.

Key words:microgliacytes; neuropeptide Y; IL-1B; neurons; apotosis

[作者簡介]白玉娟，女，從事神經(jīng)電測聽工作。 [通信作者]李琦軍，E-mail：13832121438@163.com

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.10.005

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)10-1040-04

[收稿日期]2015-10-20