常 亮，黨 巖，郭海龍

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?44000)

羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR檢測方法建立及初步應(yīng)用

常 亮，黨 巖，郭海龍

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?44000)

以GenBank上羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒(ORFV)B2L基因序列,用Primer premier 5.0軟件設(shè)計1對引物并合成,經(jīng)PCR條件優(yōu)化，確定了最佳的PCR反應(yīng)條件,建立了羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR檢測方法。結(jié)果顯示,設(shè)計的引物能擴增出的PCR產(chǎn)物為540bp左右，與預(yù)期大小一致；同時檢測山羊痘病毒，結(jié)果均為陰性；該方法能檢出羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒最低量為5pg。經(jīng)證實，建立起羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR方法具有良好的特異性和敏感性,可用于臨床病料檢測。

羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒；PCR；特異性；靈敏度

羊接觸傳染性膿皰皮炎，又稱羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿瘡、羊口瘡，是由羊傳染性膿皰病毒又稱羊口瘡病毒感染引起綿羊、山羊的接觸性、嗜上皮性傳染病[1]，以口唇等處的皮膚和粘膜形成丘疹、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂為特征，羊群的發(fā)病率高達90%,病死率1%-25%[2],給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。人、犢牛、駱駝等也可感染本病。目前本病診斷有電子顯微鏡檢查、病毒分離、接種試驗和AGP等方法[3-7]。由于本病與羊感染口蹄疫病毒、羊痘病毒臨床癥狀相似,特別在繼發(fā)感染或混合感染難以區(qū)分，這就為本病的確診增加了難度。為了準確、快速檢測本病，本研究建立了羊傳染性膿皰皮炎病毒PCR方法，經(jīng)初步應(yīng)用取得良好的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株及臨床樣品

羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒、山羊痘病毒毒株,由本實驗室保存；臨床血樣采集甘肅省平?jīng)鍪?、慶陽市和張掖市肅南裕固族自治縣等地羊只,低溫保存。

1.1.2 試劑盒及試劑

Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、DNA Marker、瓊脂糖等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中ORFV的全基因序列中較保守的B2L基因序列，設(shè)計引物1對，預(yù)計擴增目的片段大小為 540bp。上游引物為 P1:5’-CACGGCCACGAACTTCCACCTCAA-3’, 下游引物 P2:5’-TCCCGCTCGAAGACCGCAGACAG-3’,預(yù)計產(chǎn)物大小為540bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成提供。

1.2.2 病毒DNA的提取

羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒細胞毒DNA提?。喝?00μL細胞毒液于離心管中，煮沸10min，冰水水浴3min，10000r/min離心10min,取上清做模板。

臨床樣品血樣DNA提?。喝⊙獦?00μL至2.0mL離心管中，依次加入00μL滅菌雙蒸水、400μL6mol/L的碘化鈉、800μL氯仿-異戊醇（24:1），顛倒混勻，14000r/min 離心 10min；吸上層水相500μL于另一離心管中，加入300μL異丙醇，80μL3mol/L醋酸鈉，混勻后 -20℃靜置10min，14000r/min離心 10min；棄上清，加 70%乙醇 1mL，混勻，14000r/min離心 5min，棄去乙醇，晾干，加20μL滅菌雙蒸水4℃保存。

1.2.3 PCR擴增

25μL 反應(yīng)體系：10×PCR Buffer(含 Mg2+)2.5μL、dNTP 混 合 物 (各 2.5mmol/L)3μL、Taq DNA 聚合酶 (2.5U/μL)0.2μL、上引物 P1、P2(10pmol/μL)各 1.0μL、DNA 模板 2.5μL、滅菌雙蒸水(ddH2O)加至 25μL。

經(jīng)優(yōu)化后PCR條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性 30s,56℃退火 30s，72℃延伸 30s，32個循環(huán),最后72℃延伸10min。

取擴增產(chǎn)物8μL與溴酚藍緩沖液2μL混勻,加樣于2%瓊脂糖凝膠中，電泳后,觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR擴增的特異性試驗

用建立的PCR方法分別檢測羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒、山羊痘病毒和健康羊血樣。

1.2.5 PCR擴增的敏感性試驗

以羊接觸傳染性膿皰皮炎DNA為樣本,經(jīng)722型紫外可見分光度計測定OD260nm值,計算出樣本DNA的含量。按10倍比稀釋樣本,分別以不同含量的羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒的DNA為模板進行PCR擴增,以檢測所建立方法的敏感性。

1.2.6 臨床樣品的檢測

用建立的PCR方法對收集的10份發(fā)病羊的血樣進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增

從圖1看出,用ORFV提取的病毒DNA，經(jīng)PCR擴增出約540bp的特異性條帶,與預(yù)期擴增的目的片段大小相吻合；健康羊血樣DNA未擴增出條帶。結(jié)果與預(yù)期一致,說明建立的該方法可用于羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒的擴增。

圖1 ORFVB2L基因序列PCR擴增

注：M.DNA 標準 DL600；1.空白對照；2.陰性對照（山羊痘病毒）；3.陽性對照（ORFV病毒煮沸稀釋 103倍）；4-5.ORFV 病毒 DNA；6-7.健康羊血樣提取DNA后擴增產(chǎn)物

2.2 PCR的特異性

從圖2可知,采用PCR方法擴增山羊痘病毒和健康羊血樣DNA提取物,除羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒擴增出約540bp的條帶外,山羊痘病毒、健康羊血樣均為陰性。結(jié)果顯示,該方法具有良好的特異性,如病料中含山羊痘病毒不受影響。

圖2 ORFV病毒B2L基因序列PCR特異性檢測

注：M.DNA標準 DL600；1-4.山羊痘病毒PCR擴增產(chǎn)物；5.陽性對照（ORFV病毒煮沸稀釋103倍）；6-9.ORFV病毒 DNA擴增產(chǎn)物；10-13.健康羊血樣提取DNA后擴增產(chǎn)物

2.3 PCR擴增的敏感性

按DNA的含量,依次進行10倍比稀釋,PCR擴增結(jié)果為5pg模板仍可見清晰目的條帶,說明有較好的敏感性,病毒含量極少的情況且下也可被檢出(圖 3)。

圖3 ORFV病毒B2L基因序列PCR敏感性檢測

注：M.DNA 標準 DL600；1.空白對照；2.陰性對照（山羊痘病毒）；3.陽性對照（ORFV病毒煮沸稀釋 103倍）；4-9. 為 ORFV 病毒 DNA50ng、5ng、0.5ng、50pg、5pg、0.5pg

2.4 臨床樣品的檢測

對收集的2個規(guī)模養(yǎng)羊場的10頭臨床發(fā)病山羊的血樣進行檢測,9份PCR擴增為ORFV陽性,1份擴增為陰性,陽性檢出率為90%(9/10)(圖4),說明該方法在臨床上陽性檢出率高,適合于臨床診斷。

圖4 ORFV病毒臨床樣品檢測

注：M.DNA 標準 DL600；1.空白對照；2.陰性對照（山羊痘病毒）；3.陽性對照（ORFV病毒煮沸稀釋103倍）；4-13 10只發(fā)病羊血樣提取DNA擴增后PCR產(chǎn)物條帶

3 小結(jié)與討論

目前,羊接觸傳染性膿皰皮炎病在所有養(yǎng)羊的國家和地區(qū)均有發(fā)生,以澳大利亞、新西蘭等國最為嚴重。我國甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、西藏、四川和云南等省區(qū)廣泛流行,給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。羊接觸傳染性膿皰皮炎臨床上分為唇型、蹄型和外陰型,以唇型感染為主,其特征為口唇等處皮膚和粘膜形成丘疹、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂。羊痘、羊口蹄疫的臨床癥狀與羊接觸傳染性膿皰皮炎極為相似,臨床上容易誤診。實驗室檢測羊接觸傳染性膿皰皮炎的方法較多，如電鏡觀察、病毒分離、接種試驗、血清學(xué)、瓊脂免疫擴散法等[3-7]。目前,常用瓊脂免疫擴散法診斷ORFV,但因ORFV是局部免疫發(fā)揮主要作用,感染羊血清中約需要3－6周的時間才可出現(xiàn)較高效價的抗體,故結(jié)果判定中常出現(xiàn)假陰性結(jié)果；副痘病毒具有典型的外觀特征,可用電子顯微鏡簡單直觀檢查,但電子顯微鏡價位較高,操作復(fù)雜等缺點,臨床應(yīng)用上受到限制；病毒分離培養(yǎng)主要用羊、犢牛睪丸細胞進行培養(yǎng),需要較高的要求和較長的時間,且在培養(yǎng)過程中也有可能出現(xiàn)因組織毒性作用使細胞受損而誤判為病毒分離性,因此也不宜進行推廣。

本研究采用PCR方法對羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒、山羊痘病毒、健康羊血樣DNA提取物同時進行擴增,除羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒能擴增出約540bp的條帶外,山羊痘病毒、健康羊血樣均為陰性,結(jié)果表明,該方法對檢測羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒具有快速、準確、特異和靈敏的特點,是ORFV及時確診的可靠手段。

針對目前國內(nèi)存在ORFV檢測方法不完善和檢測時間較長等缺點,本研究針對ORFV的B2L基因是主要保守基因特點，設(shè)計ORFV特異性引物,擴增目的片段大小為540bp。本研究建立的PCR方法易于擴增,試驗條件要求不高,適合于一般的實驗室,易于推廣。該方法對羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒的檢測敏感性高,最小檢出量為5pg,且對模板的要求很低,只需對組織樣品進行簡單處理便可使用,可對疑似病例做出快速診斷。本研究應(yīng)用建立的PCR方法對10份臨床樣品，陽性檢出率為90%。因此,本研究所建立的PCR方法快速、準確、靈敏度高、特異性好，可為ORFV確診提供保證。

[1]殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1997.

[2]陳燕軍.羊口瘡的研究血清學(xué)方法的研究[J].獸醫(yī)科技雜志,1982(7):14-19.

[3]白積榮,沈正達,王錫貞,等.羊口瘡病毒形態(tài)發(fā)生的電鏡觀察[J].中國獸醫(yī)科技,1985(11):34-36.

[4]王良娟,馬維卿,張再清.應(yīng)用對流免疫電泳檢測細胞培養(yǎng)物中羊口瘡病毒抗原[J].甘肅畜牧獸醫(yī),1992(3):7-8.

[5]何水林,陳杰,蔡玉書,等.羊口瘡病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)科技,2002,3(9):21-23.

[6]龐理化,程慶華,侯秀芬,等.羊口瘡病毒組織培養(yǎng)初報[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,1982(3):66-69.

[7]張素珍,張惠安,鄺明慧,等.羊口瘡病原的分離與鑒定的研究[J].中國獸醫(yī)科技,1987(4):3-4.

S858.26

A

1003-8655（2016）05-0024-03

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目（項目編號：GNSW-2013-25）。

常亮（1982-），甘肅靜寧人，本科，助理研究員，主要從事動物病毒性傳染病防治技術(shù)的研究工作。