余進(jìn)龍，　阮靜瑤，　李松翰，　何邦杰，　朱娉逸，　薛向陽，　鄒阮敏，　林刻智

(溫州醫(yī)科大學(xué)1第一臨床醫(yī)學(xué)院，2微生物與免疫學(xué)教研室，3附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325035)

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趨化因子CXCL17在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床相關(guān)性研究*

余進(jìn)龍1，阮靜瑤1，李松翰1，何邦杰1，朱娉逸1，薛向陽2，鄒阮敏3△，林刻智4△

(溫州醫(yī)科大學(xué)1第一臨床醫(yī)學(xué)院，2微生物與免疫學(xué)教研室，3附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325035)

[摘要]目的： 分析趨化因子CXCL17在胃癌及癌旁正常組織的表達(dá)及分布情況，并探討其差異表達(dá)的臨床意義。方法: 分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化對40例術(shù)后切除的胃癌及相應(yīng)癌旁正常胃組織CXCL17的表達(dá)及分布情況進(jìn)行檢測。通過臨床病理分析及Kaplan-Meier生存曲線的分析，明確CXCL17在胃癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義。結(jié)果: CXCL17蛋白和mRNA的表達(dá)在胃癌組織較癌旁正常組織明顯降低(P<0.05)。臨床病理數(shù)據(jù)分析顯示，CXCL17表達(dá)的下調(diào)與胃癌分化程度有關(guān)(P<0.01)，與病人性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)部位腫瘤大小、腫瘤分期、癌胚抗原表達(dá)水平等未見明顯相關(guān)性。Kaplan-Meier生存分析顯示，CXCL17高表達(dá)組相對低表達(dá)組有明顯的生存延長(P<0.05)。結(jié)論: CXCL17可作為胃癌預(yù)后的關(guān)鍵因素之一參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]胃癌； 趨化因子CXCL17； 生存分析

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一。尤其在我國胃癌死亡率是歐美發(fā)達(dá)國家的4～8倍，近30年來胃癌的發(fā)病率及死亡率一直位居惡性腫瘤的前三位，是危害我國人民身體健康的重大疾病[1-2]。目前的研究顯示，腫瘤微環(huán)境在胃癌形成過程中發(fā)揮了重要的作用，特別是局部低氧、酸性微環(huán)境和間質(zhì)高壓等特性均十分有利于腫瘤的增殖、侵襲和惡性轉(zhuǎn)化[3]。腫瘤微環(huán)境主要包括基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、腫瘤細(xì)胞、趨化因子及其受體等，其中趨化因子的表達(dá)水平改變，可影響局部的抗腫瘤免疫反應(yīng)以至于腫瘤治療的轉(zhuǎn)歸[4]。

CXCL17又名血管內(nèi)皮生長因子共調(diào)節(jié)趨化因子1[vascular endothelial growth factor (VEGF) co-regulated chemokine 1，VCC-1]，最初于2006年發(fā)現(xiàn)，在正常人體的呼吸、消化以及部分泌尿生殖系統(tǒng)有不同程度的表達(dá)[5-6]，具有募集免疫細(xì)胞、抗炎、抗菌、促進(jìn)血管生成等多種生物學(xué)功能[6-7]，其中促進(jìn)血管生成的活性與腫瘤血管生成密切相關(guān)，引起了研究人員的關(guān)注。目前，CXCL17與肝癌、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等部分腫瘤的關(guān)系已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，而在胃癌組織中的表達(dá)水平及臨床意義未見相關(guān)報(bào)道。本課題組在研究趨化因子CXCL14與胃癌的關(guān)系時(shí)[8]，意外地發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL17在基因表達(dá)譜中呈下調(diào)趨勢，這使我們猜測其是否可能與胃癌的發(fā)展相關(guān)？為探討CXCL17與胃癌的關(guān)系，本研究主要通過免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)并結(jié)合臨床病理數(shù)據(jù)分析以及生存分析，明確CXCL17在胃癌組織中蛋白和mRNA的表達(dá)水平及其臨床意義。

材料和方法

1主要試劑

TRIzol試劑購自Invitrogen；ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Master Mix熒光定量PCR試劑盒購自Toyobo；小鼠抗人CXCL17蛋白Ⅰ抗購自R&D；HRP標(biāo)記羊抗小鼠Ⅱ抗、羊血清和DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物公司；引物由華大基因科技股份有限公司合成。

2組織標(biāo)本采集及處理

40例胃癌及相應(yīng)癌旁正常組織均取自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的胃癌術(shù)后標(biāo)本。胃癌的病理學(xué)診斷由醫(yī)院病理科術(shù)后根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)。所有患者術(shù)前未接受放療或化療，且在術(shù)后根據(jù)NCCN胃癌指南接受嚴(yán)格化療。以上胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織(取自距癌灶5 cm處)的配對標(biāo)本(胃癌及其癌旁正常組織)均被分為2個(gè)部分：一部分標(biāo)本在手術(shù)切除后30 min內(nèi)在液氮中保存，以備RNA提??；另一部分標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

3方法

3.1免疫組化實(shí)驗(yàn)5 μm的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶。微波修復(fù)，冷卻至室溫后，羊血清封閉1 h。甩去血清，滴加CXCL17特異性抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。次日，室溫下復(fù)溫30 min。參照說明書，滴加羊抗鼠II抗，37 ℃孵育30 min。PBS清洗，甩干。DAB顯色。蘇木素復(fù)染、中性樹膠封片。每次實(shí)驗(yàn)均以已知免疫組化染色陽性的切片作陽性對照,以PBS代替I抗作陰性對照以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性。平均吸光度值由Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算所得。

3.2RNA抽提和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)總RNA的抽提參照TRIzol試劑說明書，提自液氮保存的胃癌及其相應(yīng)癌旁正常組織；經(jīng)異丙醇離心沉淀后置于-20 ℃過夜；次日，去上清，75%乙醇再次離心沉淀并棄上清。將RNA沉淀溶于DEPC水，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測RNA的純度及濃度，并于-80 ℃儲(chǔ)存，用于定量PCR實(shí)驗(yàn)。

cDNA第一鏈由提取自組織的RNA參照ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄而來。反應(yīng)結(jié)束后置于-20 ℃保存。以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行real-time PCR。相關(guān)引物序列信息見表1。反應(yīng)體系包括 1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、2×SYBR Green I Master Mix、0.5 μmol/L上游引物和0.5 μmol/L下游引物。程序設(shè)定為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)40次(StepOnePlusTMReal-Time PCR system)。所有樣品均嚴(yán)格按照3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，采用相對定量法，以2-ΔΔCt表示標(biāo)本中CXCL17相對表達(dá)量，其中ΔΔCt=(CtCXCL17-CtGAPDH)腫瘤-(CtCXCL17-CtGAPDH)癌旁。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對免疫組化結(jié)果與各臨床病理因素的相關(guān)性進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier法對CXCL17高表達(dá)組與低表達(dá)組生存分析進(jìn)行5年生存率分析，組間差異比較用log-rank檢驗(yàn)。所涉及的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1胃癌組織中CXCL17 mRNA的表達(dá)下調(diào)

RT-PCR電泳結(jié)果顯示在255 bp左右的癌旁正常組織電泳結(jié)果可見明亮的單一條帶，而癌組織在相應(yīng)位置處的條帶微弱或無條帶。為了檢測CXCL17在胃癌組織中的表達(dá)量，我們建立了特異且敏感的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，CXCL17與GAPDH的熔解曲線均為單一尖峰，證明我們所建立的體系能夠特異地?cái)U(kuò)增目的基因,用以分析mRNA的相對表達(dá)量。2-ΔΔCt法分析顯示，腫瘤組織中CXCL17的mRNA表達(dá)量相對于癌旁正常組織而言明顯降低，僅為癌旁正常組織的0.68,見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of CXCL17 in human gastric cancer and gastric tissues. N: normal; T: tumor; blank: blank control. Mean±SD.n=40.*P<0.05vsnormal.

圖1胃癌及癌旁組織CXCL17的mRNA表達(dá)水平

2免疫組化結(jié)果表明CXCL17蛋白在胃癌組織中表達(dá)下降

免疫組化結(jié)果顯示在癌旁正常胃組織中，CXCL17主要表達(dá)在胃壁組織黏膜部位細(xì)胞胞漿中，染色顆粒呈棕褐色強(qiáng)陽性顯色。然而，在腫瘤組織中，CXCL17的表達(dá)顯著降低甚至不表達(dá)，免疫組化染色呈淡黃色或不著色。用Image-Pro Plus 6.0半定量分析免疫組化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CXCL17蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平(0.20±0.08)顯著低于癌旁正常組織(0.38±0.06)，且兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01),見圖2。

Figure 2.The protein expression of CXCL17 in the gastric cancer and normal tissues (immunohistochemical staining, ×400). A: normal (n=40); B: well-differentiated (n=7); C: moderately-differentiated (n=12); D: poorly-differentiated (n=11); E: undifferentiated (n=10). Mean±SD.**P<0.01vsB;##P<0.01vsC.

圖2胃癌和癌旁正常組織CXCL17表達(dá)水平

3CXCL17蛋白表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征分析

通過對40例腫瘤組織中CXCL17蛋白表達(dá)水平與其臨床病理特征的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CXCL17與胃癌腫瘤的病理分化類型密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為腫瘤分化程度越高，CXCL17蛋白表達(dá)越高。并且低分化或不分化的腫瘤組織蛋白表達(dá)明顯低于高分化或中分化組織，高分化胃癌組織染色為深黃色，中分化、低分化組織為淡黃色，低分化組織幾乎不表達(dá)CXCL17蛋白，表達(dá)水平差異顯著(P<0.01)。對CXCL17蛋白表達(dá)與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和腫瘤分期等的相關(guān)性進(jìn)行分析未見統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表2。

4腫瘤組織中CXCL17表達(dá)水平與胃癌預(yù)后相關(guān)性

根據(jù)40例腫瘤組織中CXCL17表達(dá)的平均吸光度值數(shù)據(jù)分布情況，以平均值A(chǔ)=0.251為界限，A低于0.251為CXCL17低表達(dá)組(20例)，其余為高表達(dá)組(20例)。以Kaplan-Meier法對2組生存情況進(jìn)行5年生存率分析，并使用log-rank檢驗(yàn)對生存曲線的差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示不同CXCL17蛋白表達(dá)水平的胃癌患者術(shù)后總生存之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性 (P<0.05)，高表達(dá)組相對低表達(dá)組而言有明顯的生存延長，表明CXCL17高表達(dá)的胃癌患者手術(shù)預(yù)后情況更優(yōu)。高、低表達(dá)組生存期分別為(26.2±3.8)月和(10.4±3.1)月,見圖3。

討論

CXCL17是趨化因子CXC家族最新發(fā)現(xiàn)的一員，是由多種細(xì)胞分泌的，能夠使不同細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞因子，其在腫瘤中的分泌能夠影響腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，且與腫瘤血管生成密切相關(guān)[4-5]。相關(guān)報(bào)道指出，在胰腺癌中，隨著腫瘤惡性程度的提升，CXCL17的表達(dá)反而降低[9],而在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中，CXCL17表達(dá)卻上升[10-11]。CXCL17在不同腫瘤組織中呈現(xiàn)的不同表達(dá)情況，Weinstein等[5]認(rèn)為CXCL17能夠誘導(dǎo)VEGF等因子表達(dá)從而間接促進(jìn)腫瘤血管生成，加速腫瘤瘤體生長；而Hiraoka等[9]則認(rèn)為，CXCL17可募集樹突狀細(xì)胞浸潤腫瘤組織，介導(dǎo)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗腫瘤免疫作用。

Figure 3.Survival curves of the gastric cancer patients with different expression levels of CXCL17.

圖3胃癌患者CXCL17不同表達(dá)水平的生存曲線比較

為研究CXCL17在胃癌中的表達(dá)情況，本課題組通過real-time PCR和免疫組化等技術(shù)檢測胃癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中CXCL17的表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果顯示，在癌旁正常胃組織中CXCL17蛋白呈棕黃色，且主要表達(dá)在黏膜部，這與Burkhardt等[6]的研究結(jié)果相符；在胃癌組織中CXCL17的表達(dá)較癌旁正常組織有明顯下降，并且隨著腫瘤惡性度的增高，CXCL17的表達(dá)也相應(yīng)下降，這種表達(dá)下調(diào)的情況與Hiraoka等[9]在胰腺癌的研究類似。RT-PCR電泳，胃癌癌旁正常組織在255 bp處可見一清晰條帶，而胃癌組織中僅隱約可見或無；且實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在胃癌組織中CXCL17的表達(dá)較癌旁正常組織有明顯下降。可見，CXCL17在胃癌及癌旁正常胃組織中蛋白與基因表達(dá)結(jié)果一致?；贖iraoka等[9]在胰腺癌中的研究，我們推測CXCL17在胃癌中的表達(dá)下調(diào)，極有可能與腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)視并形成腫瘤免疫耐受有關(guān)。

通過近5年臨床隨訪資料，進(jìn)一步進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL17在胃癌組織蛋白的表達(dá)與腫瘤分化程度具有顯著相關(guān)性，而與與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和腫瘤分期等無關(guān)。生存分析顯示腫瘤組織CXCL17蛋白高表達(dá)水平患者生存期相對較長，這提示CXCL17可能參與了胃癌發(fā)展的過程，且發(fā)揮一定的抗腫瘤作用。

綜上所述，CXCL17在胃癌中可能扮演了一個(gè)抑癌角色，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。在今后的研究中，我們將進(jìn)一步探索腫瘤組織中免疫細(xì)胞與CXCL17的關(guān)系，并深入從基因水平探討CXCL17在胃癌中下調(diào)的具體機(jī)制，為胃癌臨床治療及預(yù)后提供新靶點(diǎn)，為胃癌的臨床藥物研發(fā)提供新思路。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Expression of chemokine CXCL17 and its clinical relevance in gastric carcinoma

YU Jin-long1, RUAN Jing-yao1, LI Song-han1, HE Bang-jie1, ZHU Ping-yi1, XUE Xiang-yang2, ZOU Ruan-min3, LIN Ke-zhi4

(1TheFirstClinicalMedicalAcademy,2DepartmentofMicrobiologyandImmunology,3DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliatedHospital,4MedicalExperimentalTeachingCenter,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:lkz_2013@163.com; 60447697@qq.com)

[KEY WORDS]Gastric cancer; Chemokine CXCL17; Survival analysis

[ABSTRACT]AIM: To investigate the expression and distribution of chemokine CXCL17 in gastric cancer and its clinical significance.METHODS: The CXCL17 expression was detected by real-time PCR and immunohistochemistry. The correlation between the CXCL17 expression and clinicopathological features was statistically analyzed and Kaplan-Meier survival analysis was used to evaluate the prognosis.RESULTS: A lower expression levels of CXCL17 were observed in the tumor tissues compared with the paired normal tissues (P<0.05). Down-regulation of CXCL17 was associated with the degree of tumor differentiation and the size of tumor at primary site (P<0.05). Kaplan-Meier survival analysis showed that increased CXCL17 in the tumor tissues was associated with longer survival time.CONCLUSION: The result might illustrate that CXCL17 acts as a key factor in the prognosis of gastric cancer and is closely associated with the progression of gastric cancer.

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 1022- 05

[收稿日期]2015- 12- 18[修回日期] 2016- 03- 23

*[基金項(xiàng)目]浙江省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No. LQ16H190003)；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. Y20140216；No. Y20140308)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃(新苗人才計(jì)劃)資助項(xiàng)目(No. 2015R413004)

通訊作者△鄒阮敏 Tel: 0577-88069240; E-mail: 60447697@qq.com； 林刻智 Tel: 0577-86689816; E-mail: lkz_2013@163.com

[中圖分類號(hào)]R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.010