高宇　汪景　余慶雄　單圣周　李青峰

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機械牽張刺激下大鼠皮膚再生的關(guān)鍵基因篩選

高宇汪景余慶雄單圣周李青峰

【摘要】目的明確機械牽張刺激下大鼠皮膚再生相關(guān)基因表達譜的變化，并篩選出其中的關(guān)鍵基因。方法建立大鼠皮膚擴張模型，以未擴張皮膚為對照，以注水量不同分組取材。分別是：對照組（con）、擴張器最終注水60 mL組（exp60）、擴張器最終注水120 mL組（exp120）、擴張器最終注水180 mL組（exp180）。取材后一部分樣本切片行免疫熒光染色，熒光標(biāo)記增殖標(biāo)記物Ki67，繪制皮膚細胞增殖曲線。另一部分樣本行基因芯片檢測，檢測mRNA表達譜的變化，并利用t檢驗和差異表達的倍數(shù)變化（FC值）篩選出關(guān)鍵基因。篩選出皮膚再生的關(guān)鍵基因后，用PCR方法驗證以確認(rèn)該基因的表達量，及其與皮膚增殖之間的關(guān)系。結(jié)果免疫熒光染色顯示，增殖標(biāo)記物Ki67在各組的表達量由高到低依次是：con、exp180、exp60和exp120。本研究篩選出不同機械牽張刺激下大鼠皮膚再生的11個差異基因，分別為：Myh1、Myh2、Myh3、Myh4、Car6、Pi15、Apt12a、Mt1a、Cthrc1、Rsad2和IGF-BP5。其中IGF-BP5和對照組的皮膚內(nèi)表達相比為下調(diào)基因；PCR驗證得出，IGF-BP5在各組的表達量由高到低依次是：exp120、exp60、exp180和con。結(jié)論機械牽張刺激下，隨著擴張時間及擴張量的增加，大鼠皮膚再生呈現(xiàn)早期皮膚細胞增殖加速，中期增殖活躍，后期增殖減緩的趨勢；且IGF-BP5可能為影響機械牽張刺激下大鼠皮膚再生的關(guān)鍵基因。

【關(guān)鍵詞】皮膚擴張機械牽張皮膚再生基因芯片

作者單位：200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

皮膚軟組織擴張就是將醫(yī)用硅膠制作的軟組織擴張器埋植于皮下，并定期向擴張囊內(nèi)注入生理鹽水，對表面皮膚組織增加壓力，通過生長和彈性擴張，使皮膚發(fā)生層進行分裂增殖，以增加額外的皮膚用于對缺損進行修復(fù)［1］。該手術(shù)可為患者提供質(zhì)地、色澤、厚薄以及毛發(fā)分布等同周圍組織相似的組織，并進一步避免產(chǎn)生新的瘢痕或畸形［2-5］。它與傳統(tǒng)燒傷整形外科修復(fù)手段，如植皮、遠位皮瓣等相比，保留了供區(qū)皮膚組織的特征，克服了供區(qū)發(fā)生再缺損的弊端［6-8］。

但是，常規(guī)擴張能提供的皮膚有限，常常不能滿足大面積缺損修復(fù)的需要；反復(fù)擴張又使得皮膚質(zhì)地改變、擴張效率下降，并增加了患者經(jīng)濟和精神負(fù)擔(dān)；超量擴張雖能獲得較多的擴張量，但擴張周期長，破潰、感染等并發(fā)癥的發(fā)生率也隨之增高［9-12］。因此，促進皮膚的再生能力、提高擴張效率、縮短擴張時間一直是研究的熱點之一。

有研究認(rèn)為，罌粟堿、雌三醇、A型肉毒毒素、二甲亞砜、堿性成纖維細胞生長因子、鈣通道阻滯劑和骨髓間充質(zhì)干細胞等能夠提高擴張效率［13-20］。盡管這些方法在實驗研究中取得了進展，但由于毒副作用、維持時間、給藥途徑和實際效果等因素限制，臨床效果并不令人滿意。臨床上尚缺乏一種能有效促進皮膚再生并提高擴張效率的方法。盡管我們已經(jīng)從組織和細胞水平上詳細了解了擴張過程中機體的各種變化，但基因水平上尚缺乏系統(tǒng)全面的認(rèn)識，因而不能明確擴張過程中的關(guān)鍵分子并針對這些關(guān)鍵分子實行有效的干預(yù)。

本研究根據(jù)擴張皮膚中mRNA的變化，通過基因芯片分析技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)，嘗試明確擴張皮膚再生相關(guān)基因表達水平上的變化，找出其中的關(guān)鍵靶基因，為進一步的干預(yù)實驗篩選靶點。

1　材料與方法

1.1實驗動物及材料

雄性SD大鼠，7～8周齡（我院SPF級動物實驗中心提供）；10 mL皮膚軟組織擴張器（廣州萬和整形材料有限公司）；mRNA芯片采用Affymetrix GeneChip Rat Gene 2.0 ST Array基因芯片平臺（上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）。

1.2建立擴張模型

大鼠麻醉，背側(cè)皮膚備皮。在大鼠頸部后方作3 cm切口，切開皮膚、皮下組織至深筋膜淺層。然后向頭側(cè)及尾側(cè)剝離形成腔隙。其中尾側(cè)剝離范圍為3 cm×6 cm。向頭側(cè)腔隙中放置擴張器注射壺，并將擴張器植入尾側(cè)剝離腔隙，術(shù)畢，縫合切口。術(shù)后1周待切口愈合后，向擴張器內(nèi)注入10 mL無菌生理鹽水，每周3次（周一、周三、周五各1次）。實驗分4組，目的注水量分別為0、60 mL、120 mL和180 mL，標(biāo)記為con、exp60、exp120、exp180四組，每組3個標(biāo)本，共12只大鼠。

1.3免疫熒光染色

使用abcam抗體進行免疫熒光染色，檢測各組增殖標(biāo)記Ki67，熒光顯微鏡下觀察并拍攝標(biāo)記情況，統(tǒng)計Ki67陽性率以反映皮膚再生情況。

1.4基因芯片

RNA樣本由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，進行mRNA芯片的雜交數(shù)據(jù)讀取和正態(tài)化工作。樣品總RNA利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）檢測RNA完整性。RNA質(zhì)檢合格后，樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程。首先，總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，再進一步合成cRNA，接著對cRNA進行第二輪反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，片段化并與生物素標(biāo)記后與芯片雜交，洗脫和染色后利用Affymetrix Scanner 3000（Affymetrix）掃描得到原始圖像。

1.5差異基因的篩選

原始圖像采用Expression Console軟件（version1.3.1，Affymetrix）處理提取原始數(shù)據(jù)和RMA標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用Genesrping軟件（version 12.5，Agilent Technologies）進行后續(xù)處理。差異基因利用t檢驗的P值和倍數(shù)變化值進行篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P≤0.05。接著，對差異基因利用GO和KEGG（Kyoto Encyclope dia of Genes and Genomes）富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者通路。分別分析出exp60 VS control，exp120 VS control，exp180 VS control三組數(shù)據(jù)分別的差異基因和共同差異基因，根據(jù)共同差異基因的不同功能，我們選定參與細胞組成的基因，進行PCR驗證，確認(rèn)其表達趨勢和Ki67的陽性率趨勢是否一致，從而確認(rèn)該基因?qū)τ跔繌埓碳は缕つw再生的作用。

1.6PCR實驗步驟

存于液氮中的組織或細胞用trizol進行mRNA提??；提出的mRNA用MMLV系統(tǒng)進行逆轉(zhuǎn)錄得到CDNA；cDNA可在real Time PCR中進行內(nèi)參的驗證，來驗證提取和轉(zhuǎn)錄的效率，確定能進行實驗的樣本；最后進行real time PCR的擴增步驟，判斷實驗數(shù)據(jù)，進行計算（圖1）。

圖1　引物信息Fig. 1 Information of primer

2　結(jié)果

2.1不同擴張時間對皮膚細胞增殖的影響

熒光顯微鏡檢測增殖標(biāo)記Ki67顯示，隨著擴張器注水量的增多，表皮厚度逐漸增厚（圖2，3）。表皮細胞的增殖情況可用Ki67的陽性率來表示。結(jié)果顯示，4組中Ki67的陽性率從高到低依次為exp120、exp60、exp180、con（圖4）。說明在注水量達120 mL時，大鼠皮膚細胞增殖最活躍，注水量達60 mL時，處于增殖上升期，注水量在120～180 mL期間，處于增殖減緩期。

圖2　各組免疫熒光觀察增殖標(biāo)記Ki67Fig. 2 Immunohistochemical observation of proliferation marker Ki67 in each group

圖3　各組表皮厚度Fig. 3 Thickness of epidermis in each group

圖4　各組Ki67陽性率Fig. 4 Positive rate of proliferation marker Ki67 in each group

2.2基因芯片分析結(jié)果

將3組實驗組與對照組進行比較，數(shù)據(jù)歸一化處理，初篩基因。滿足上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0 且P≤0.05條件的基因，分別有67個（其中17個上調(diào)基因，50個下調(diào)基因）、143個（其中59個上調(diào)基因，84個下調(diào)基因）、94個（其中5個上調(diào)基因，89個下調(diào)基因）（表1）。

表1　60 vs con、120 vs con、180 vs con的差異基因總數(shù)統(tǒng)計Table 1 Summary of discrepant genes of 60 vs con，120 vscon and 180 vs con

將3組數(shù)據(jù)的差異基因進行重合，從304個備選差異基因中，根據(jù)基因功能，分為四種類型：細胞組成、生物過程、分子功能和KEGG通路。我們選定參與細胞組成的基因，從中篩選出11個表達存在顯著性差異的共同基因（FC＞2，P＜0.05），其中，5個（45.45%）上調(diào)基因，6個（54.55%）下調(diào)基因（表2）。

表2　60 vs con、120 vs con、180 vs con的共同差異基因Table 2 Common examples of discrepant genes of 60 vscon，120 vs con and 180 vs con

2.3定量PCR驗證結(jié)果

在芯片篩選出的參與細胞組成的差異基因中，根據(jù)已有相關(guān)文獻報道結(jié)果，我們對其中一個基因IGF-BP5進行定量PCR驗證，發(fā)現(xiàn)與正常未擴張皮膚相比，IGF-BP5在擴張皮膚中表達下降。PCR驗證結(jié)果顯示，在con、exp60、exp120和exp180這四組中，IGF-BP5表達量由多到少，依次排序為con、exp180、exp60、exp120（圖5）。

圖5　各組IGF-BP5表達量Fig. 5 Expression of IGF-BP5 in each group

3　討論

由于皮膚擴張是一個長期的過程，在擴張的不同階段隨著炎癥血流動力學(xué)和生物力學(xué)等因素的變化，細胞的生理狀態(tài)也存在著不同的變化［21-26］，因此需要進行時間序列的基因芯片實驗，才能完整揭示擴張過程中基因水平的各種變化。本實驗免疫熒光染色顯示，各組中增殖標(biāo)記Ki67的表達量由高到低依次是exp120、exp60、exp180和con。本研究首次明確了SD大鼠皮膚隨著擴張器注水量增多的不同時間點的基因芯片數(shù)據(jù)，并篩選出參與細胞組成的11個差異基因，分別為：Myh1、Myh2、Myh3、Myh4、Car6、Pi15、Apt12a、Mt1a、Cthrc1、Rsad2和IGF-BP5。其中，IGF-BP5和對照組的皮膚內(nèi)表達相比為下調(diào)基因，PCR驗證得出，IGF-BP5在4組中的表達量由高到低依次是exp120、exp60、exp180和con，符合IGF-BP5作為下調(diào)基因的特點。因此我們認(rèn)為，在機械牽張刺激下，隨著擴張時間及擴張量的增加，大鼠皮膚再生呈現(xiàn)早期皮膚細胞增殖加速，中期增殖活躍，后期增殖減緩趨勢；且IGF-BP5可能為影響機械牽張刺激下大鼠皮膚再生的關(guān)鍵下調(diào)基因。

Pilewski等［27］在系統(tǒng)性纖維化病人纖維化皮膚的原代成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)，IGF-BP5的mRNA和蛋白表達水平增高；Yasuoka等［28-29］報道，小鼠模型中IGF-BP5通過增厚真皮結(jié)締組織厚度、增加膠原和纖連蛋白的沉積來誘導(dǎo)皮膚的纖維化。2014年，他們又發(fā)現(xiàn)，IGF-BP5誘導(dǎo)皮膚纖維化的機制可能是通過DOK5調(diào)控細胞外基質(zhì)的合成［30］。然而，Carolyn等［31］發(fā)現(xiàn)，IGF-II∶VN（vitronectin）和IGF-I∶IGFBP-5∶VN的復(fù)合體，可能有增強表皮細胞的遷徙和增殖的功能，尤其在傷口愈合和皮膚再生過程中。其中，IGF-BP5的作用是使IGF-1和VN的連接更容易。Turchi等［32］證實，在燒傷和外傷的愈合過程中，IGF∶VN復(fù)合體能夠促進表皮細胞的增殖和遷徙。關(guān)于IGF-BP5誘導(dǎo)皮膚纖維化和我們研究顯示的IGFBP5抑制牽張刺激下皮膚再生的關(guān)系，仍需進一步研究。

本研究尚存在一定的局限，實驗方法上面，我們研究的是取樣時某個擴張量下的皮膚，所以只能大概確定皮膚再生的趨勢，不夠精確，以后的實驗中可以更加細化時間段。其次，雖然說明了IGF-BP5可能是抑制皮膚再生的關(guān)鍵基因，但是，機制有待進一步明確。未來的研究將會著力于完善相關(guān)數(shù)據(jù)，追蹤本研究發(fā)現(xiàn)的其他關(guān)鍵基因，進一步明確其調(diào)控皮膚擴張的機制。

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·綜述·

·論著·

Key Gene Screening of Skin Regeneration Under Mechanical Stretch Stimulation in Rats

GAO Yu，WANG Jing，YU Qingxiong，SHAN Shengzhou，LI Qingfeng. Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China. Corresponding author: LI Qingfeng（E-mail: dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）.

【Abstract】Objective To determine the expression changes of skin regeneration-related key genes under mechanical stretch stimulation in rats and to screen key genes. Methods Skin expansion model was established and skin samples were harvested：the unexpanded control group（con），water-injected 60 mL group（exp60），water-injected 120 mL group（exp120）and water-injected 180 mL group（exp180）. Immunohistochemical staining was implemented in the sliced the sample，staining proliferation marker Ki67. According to that，the trend curve of Ki67 positive rate of samples was drawn. Gene Chip was also undertaken to reveal the gene expression changes during expansion process. T test and fold change of differential expression were applied to screen key genes. Then PCR was used to confirm the relationship between the expression of the key gene and the proliferation of skin. Results Immunofluorescence staining showed that，the expression of the proliferation marker Ki67 descending order is con，exp180，exp60，exp120. This study screened 11 skin regeneration-related key genes of rats under different mechanical stretch stimulation：Myh1，Myh2，Myh3，Myh4，Car6，Pi15，Apt12a，Mt1a，Cthrc1，Rsad2，IGF-BP5. Compared to the expression of control group，IGF-BP5 was a down-regulated gene. PCR showed that the expression of IGF-BP5 descending order was：exp120，exp60，exp180，con. ConclusionUnder mechanical stretch stimulation，with the increasing time of expansion and amount of water injected，skin regeneration of rats shows accelerated proliferation at early stage，active proliferation in the mid-term and tendency to slow down the proliferation in the later period；IGF-BP5 may be a key regeneration-related gene of rats under mechanical stretch stimulation.

【Key words】Skin expansion；Mechanical stretch；Skin regeneration；Gene chip

【中圖分類號】R622+.l

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）02－0107－05

基金項目：國家自然科學(xué)基金（NO.81230042）。

通訊作者：李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）。

doi：10.3969/j.issn.1673-0364.2016.02.005

收稿日期：（2016年3月1日；修回日期：2016年3月22日）