胡曉潔　高陽(yáng)　林曉曦　湯淳　李偉　陳輝　金云波　馬剛　于文心　常雷　楊?！〕鹧怒Z

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新技術(shù)應(yīng)用：對(duì)具有血管畸形且疑似NF1的患者應(yīng)用基因檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行明確診斷

胡曉潔高陽(yáng)林曉曦湯淳李偉陳輝金云波馬剛于文心常雷楊希仇雅璟

【摘要】目的對(duì)于臨床具有血管畸形且疑似NF1的患者，應(yīng)用基因檢測(cè)方法進(jìn)行診斷與鑒別診斷。方法患兒10歲，右小腿皮膚散在紅斑、增粗1年，無(wú)明顯邊界。CT提示網(wǎng)狀毛細(xì)血管以及淺靜脈血管分支增多增粗，疑似靜脈畸形。軀干四肢散在多發(fā)的牛奶咖啡斑，直徑大于1.5 cm，數(shù)量超過(guò)6個(gè)，僅該項(xiàng)符合NIH關(guān)于NF1的診斷臨床表現(xiàn)，其余癥狀皆不典型，無(wú)法確診NF1。遂嘗試進(jìn)行NF1基因檢測(cè)。結(jié)果NF1的DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)無(wú)義突變，c.C4006C＞T，p.Gln 1336*（雜合），支持NF1的診斷。結(jié)論臨床表現(xiàn)不典型的患者，無(wú)法依據(jù)NIH標(biāo)準(zhǔn)確診時(shí)，可進(jìn)行NF1基因檢測(cè)，幫助臨床診斷。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)纖維瘤病基因檢測(cè)血管畸形

作者單位：200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（胡曉潔，高陽(yáng)，林曉曦，李偉，陳輝，金云波，馬剛，于文心，常雷，楊希，仇雅璟）；200000上海市上海市眼病防治中心（湯淳）。

Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤?。∟F1）的新生兒發(fā)病率約為1/3 000～1/2 500。累及神經(jīng)外胚層組織，臨床特征性表現(xiàn)除了典型的牛奶咖啡斑和神經(jīng)纖維瘤之外，可有各種其他臨床癥狀，嚴(yán)重者導(dǎo)致智力異常、容貌毀損和器官功能障礙等。部分患者易罹患第二腫瘤，并有部分腫瘤可發(fā)生惡變，這是該病死亡的主要原因。該病人群平均壽命較總?cè)巳旱?0～15年［1］。該病具有家族遺傳性，對(duì)個(gè)人和家庭都會(huì)造成巨大不良影響。

大多數(shù)NF1患者可依據(jù)臨床特征性表現(xiàn)作出明確診斷。但對(duì)于缺乏相應(yīng)典型臨床特征的患者，明確診斷相當(dāng)困難。常見(jiàn)兩類(lèi)患者，一類(lèi)為青春期前患者，隨著生長(zhǎng)發(fā)育，NF1癥狀才逐漸明顯，因此新生兒至青春期前階段，有些患者臨床表現(xiàn)不典型，不易早期獲得明確診斷；另一類(lèi)患者臨床癥狀表現(xiàn)始終相對(duì)比較輕微與隱蔽，非相關(guān)專(zhuān)業(yè)檢查，很難檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，也常會(huì)漏診。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已明確NF1基因位于17q11.2，編碼350 Kb的堿基，含有60個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄全長(zhǎng)約11～12 Kb的mRNA，經(jīng)過(guò)剪切翻譯合成2 818個(gè)氨基酸的nf1蛋白［1-2］。截止2015年2月，HGMD基因數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道已發(fā)現(xiàn)的NF1突變位點(diǎn)將近2 161個(gè)，包括各種錯(cuò)義/無(wú)義突變660個(gè)，剪切突變390個(gè)，小片段缺失531個(gè)，小片段插入264個(gè)，大片段缺失227個(gè)，大片段插入35個(gè)等。當(dāng)NF1基因發(fā)生突變時(shí)，nf蛋白合成量及功能不足或喪失，負(fù)向調(diào)節(jié)RAS基因功能減弱，使得RAS功能相對(duì)活躍，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增生和增殖，出現(xiàn)各種臨床表現(xiàn)。

NF1的基因研究已日趨成熟。對(duì)于無(wú)法應(yīng)用臨床標(biāo)準(zhǔn)明確診斷NF1的疑似患者，是否能夠通過(guò)基因檢測(cè)，找到NF1基因突變的位點(diǎn)，從而獲得支持診斷的依據(jù)呢？我們對(duì)具有血管畸形且疑似NF的患兒，嘗試通過(guò)基因分析的方法，以明確診斷。

1　臨床資料

患兒，男性，10歲。主訴右側(cè)下肢小腿增粗1年。檢查發(fā)現(xiàn)，右小腿最大周徑34 cm，較左側(cè)（32.7 cm）粗大；皮膚呈現(xiàn)散在紅斑，皮溫正常，未捫及搏動(dòng)，皮下組織柔軟，可捫及細(xì)長(zhǎng)條索，無(wú)明顯包塊，無(wú)邊界，體位試驗(yàn)陰性；軀干四肢散在多發(fā)的牛奶咖啡斑，直徑＞2 cm，數(shù)量＞6個(gè)（圖1）；軀干未見(jiàn)有其他包塊；雙眼檢查未發(fā)現(xiàn)虹膜錯(cuò)構(gòu)瘤（圖2）；未見(jiàn)有其他畸形表現(xiàn)。CT提示，右側(cè)小腿肌肉軟組織整體增厚，背、外側(cè)皮膚增厚，脂肪內(nèi)多發(fā)網(wǎng)狀毛細(xì)血管以及淺靜脈血管分支增多增粗，疑似靜脈畸形（圖3）。MRI提示，右小腿皮下脂肪層及肌肉片狀、線(xiàn)狀異常信號(hào)（圖4）。家族史，父母均否認(rèn)NF1。臨床擬診為“NF1？血管畸形？”。為進(jìn)一步明確診斷，進(jìn)行NF1基因檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血DNA基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)無(wú)義突變，c. C4006C＞T，p.Gln 1336*（雜合），支持NF1的診斷。

圖1　右下肢小腿表面散在紅斑，伴局部組織隆起。左側(cè)下肢可見(jiàn)牛奶咖啡斑Fig. 1 Right calf enlarged with scattered erythema. Several Café au lait on the left leg

圖2　雙眼虹膜未檢測(cè)到虹膜色素錯(cuò)構(gòu)瘤Fig.2 No lisch node was detected on iris

圖3　CT提示：右側(cè)小腿肌肉軟組織整體增厚，軟組織內(nèi)多發(fā)網(wǎng)狀毛細(xì)血管以及淺靜脈血管分支增多增粗，疑似靜脈畸形Fig.3 CT: capillaries and superficial vein of right calf increased and enlarged，with an impression of tendency to venous malformations

圖4　MRI提示：右小腿皮下脂肪層及肌肉片狀、線(xiàn)狀異常信號(hào)Fig.4 MRI: flake，linear anomaly signal was detected in subcutaneous，fat layer and muscle of the right leg

2　討論

對(duì)于NF1，作出明確診斷對(duì)患者個(gè)體或家庭至關(guān)重要。NF1屬于常染色體顯性遺傳性疾病，具有50%的遺傳可能性，漏診將不利于優(yōu)生優(yōu)育。由于遺傳獲得的臨床表現(xiàn)型并不一致，也就是說(shuō)子代與父代臨床表現(xiàn)可能不同，因此一旦漏診將可能出現(xiàn)非常嚴(yán)重的臨床癥狀。另外，早期明確診斷有利于及時(shí)預(yù)防和處理NF1可能出現(xiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥。

1987年，NIH制定的NF1臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)沿用至今，臨床出現(xiàn)符合下列2項(xiàng)表現(xiàn)，即可以明確診斷為NF1。①6個(gè)或6個(gè)以上牛奶咖啡斑，青春期前最大直徑大于5 mm，青春期后最大直徑不小于15 mm；②2個(gè)或2個(gè)以上任何類(lèi)型的神經(jīng)纖維瘤或一個(gè)叢狀神經(jīng)纖維瘤；③腋窩或腹股溝等皮膚皺褶處雀斑樣痣；④視神經(jīng)膠質(zhì)瘤；⑤2個(gè)或2個(gè)以上虹膜錯(cuò)構(gòu)瘤；⑥明確的骨骼病灶，如蝶骨大翼缺損，長(zhǎng)骨皮質(zhì)變薄，伴有或不伴有脛骨假關(guān)節(jié)；⑦1個(gè)一級(jí)直系親屬診斷為NF1。95%的患者，可據(jù)此作出明確判斷［3］。

事實(shí)上，NF1疾病臨床表現(xiàn)多樣，可在不同年齡段依次出現(xiàn)，部分患者出現(xiàn)典型癥狀非常遲緩，甚至有極少數(shù)患者的病灶隱匿，終身可無(wú)任何癥狀，臨床難以發(fā)現(xiàn)，因而在疾病早期易漏診。本報(bào)道中患者，10歲，屬于青春期前的患兒，明確有超過(guò)6個(gè)以上的牛奶咖啡斑，且直徑大于5 mm，符合NF1的NIH 的1項(xiàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)。但未發(fā)現(xiàn)有其他腫瘤或結(jié)節(jié)，未發(fā)現(xiàn)虹膜錯(cuò)構(gòu)瘤，未發(fā)現(xiàn)眼眶異常等其他復(fù)合診斷標(biāo)準(zhǔn)的癥狀，以及未有罹患Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤的一級(jí)直系親屬。關(guān)鍵在于小腿部增粗包塊性質(zhì)的判斷，根據(jù)影像學(xué)資料，提示小腿具有血管畸形的癥狀。盡管叢狀神經(jīng)纖維瘤可以伴有血管畸形癥狀，但是由于缺乏神經(jīng)纖維瘤靶像征的影像學(xué)特點(diǎn)，因而不能判斷小腿包塊是否符合叢狀神經(jīng)纖維瘤的診斷。因此，患者目前癥狀僅符合NF1的1項(xiàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，其余均為不典型表現(xiàn)，尚不能確診為NF1。且患兒也不能歸類(lèi)于目前所認(rèn)識(shí)的任何一類(lèi)體表有大量牛奶咖啡斑的疾病或綜合征，如Leigius綜合征、NF2、McCune-Albright綜合征、LEOPARD綜合征等［4-5］。臨床僅可疑似診斷為“NF1”，等待明確診斷證據(jù)出現(xiàn)。

由于臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢測(cè)不典型，可能病理檢查表現(xiàn)也不典型，患者家長(zhǎng)要求先嘗試NF1基因檢測(cè)，然后再考慮有創(chuàng)病理組織活檢。經(jīng)NF1基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)c.C4006C＞T，p.Gln 1336*（雜合），無(wú)義突變。該突變?cè)斐蒀AG＞TAG，Gln＞TERM，也就是在第1 336個(gè)密碼子位置提前出現(xiàn)了終止密碼子，使得nf合成提前結(jié)束。翻譯所獲得的截?cái)嘈桶被?，將?huì)影響n(yōu)f的正常功能。該變異與Fahsold等［6］報(bào)道的NF1患者的基因突變一致。該基因突變，為診斷NF1提供了確鑿的依據(jù)。

基因檢測(cè)尚未列入NF1的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是配合不典型的NF1臨床表現(xiàn)，進(jìn)行合理必要的基因檢測(cè)，有助于在典型臨床癥狀尚未出現(xiàn)之前，做出準(zhǔn)確判斷。早期明確NF1診斷和進(jìn)行鑒別診斷，可以有效幫助鑒別診斷非典型性NF1，為兒童和青年患者及家庭提供正確的隨訪(fǎng)、治療、嚴(yán)重并發(fā)癥預(yù)防以及遺傳指導(dǎo)意見(jiàn)。

盡管通過(guò)與已知的突變致病基因進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)突變的基因產(chǎn)物進(jìn)行分析，能很好地幫助對(duì)患者作出NF1的診斷，但由于目前NF1患者突變基因的檢出率為95%，仍有相當(dāng)一部分患者未能找到突變的致病基因，因而基因檢測(cè)只能作為輔助診斷工具，而未能作為臨床檢查的最終標(biāo)準(zhǔn)。是否突變檢出率必須到達(dá)100%，NF1基因檢測(cè)才能成為首選的臨床檢測(cè)指標(biāo)，目前尚有爭(zhēng)議。

3　展望

本病例是分子遺傳學(xué)NF1基因基礎(chǔ)研究成果在臨床中協(xié)助明確診斷疑難雜癥的成功典范，展示了基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)疑難NF1診斷的巨大幫助，基因診斷已經(jīng)成為臨床確診NF1的一項(xiàng)重要輔助工具。目前正在進(jìn)行NF1基因型和臨床表現(xiàn)型之間一一對(duì)應(yīng)關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)NF1基因大片段缺失，與嚴(yán)重臨床表現(xiàn)相關(guān)［7-9］，而外顯子17中3個(gè)堿基對(duì)AAT缺失與輕度臨床表現(xiàn)型NF1相關(guān)，僅僅表現(xiàn)為牛奶咖啡斑、皮膚皺褶雀斑樣痣以及l(fā)isch結(jié)節(jié)［10］。這些研究成果將有望根據(jù)臨床表現(xiàn)去推斷患者的基因突變位點(diǎn)，或通過(guò)基因突變位點(diǎn)預(yù)測(cè)患者可能出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)，通過(guò)基因檢測(cè)將獲得更精確的臨床診斷。

參考文獻(xiàn)

［1］Upadhyaya M，Cooper DN. Neurofibromatosis type 1：molecular and cellular biology［M］. United Kingdom：Springer，2013.

［2］Li Y，O'Connell P，Breidenbach HH，et al. Genomic organization of the neurofibromatosis 1 gene（NF1）［J］. Genomics，1995，25（1）：9-18.

［3］Stumpf DA，Alksne JF，Annegers JF，et al. Neurofibromatosis. Conference statement. National Institutes of Health Consensus Development Conference［J］. Arch Neurol，1988，45（5）：575-578.

［4］Brems H，Chmara M，Sahbatou M，et al. Germline loss-of-function mutations in SPRED1 cause a neurofibromatosis 1-like phenotype ［J］. Nat Genet，2007，39（9）：1120-1126.

［5］Digilio MC，Conti E，Sarkozy A，et al. Grouping of multiplelentigines/LEOPARD and Noonan syndromes on the PTPN11 gene［J］. Am J Hum Genet，2002，71（2）：389-394.

［6］Fahsold R，Hoffmeyer S，Mischung C，et al. Minor lesion mutational spectrum of the entire NF1 gene does not explain its high mutability but points to a functional domain upstream of the GAP-related domain［J］. Am J Hum Genet，2000，66（3）：790-818.

［7］De Raedt T，Brems H，Wolkenstein P，et al. Elevated risk for MPNST in NF1 microdeletion patients［J］. Am J Hum Genet，2003，72（5）：1288-1292.

［8］Messiaen L，Vogt J，Bengesser K，et al. Mosaic type -1 NF1 microdeletions as a cause of both generalized and segmental neurofibromatosis type-1（NF1）［J］. Hum Mutat，2011，32（2）：213-219.

［9］Pasmant E，Sabbagh A，Spurlock G，et al. NF1 microdeletions in neurofibromatosis type 1：from genotype to phenotype［J］. Hum Mutat，2010，31（6）：E1506-E1518.

［10］Upadhyaya M，Huson SM，Davies M，et al. An absence of cutaneous neurofibromas associated with a 3-bp inframe deletion in exon 17 of the NF1 gene（c.2970 -2972 delAAT）：evidence of a clinically significant NF1 genotype-phenotype correlation［J］. Am J Hum Genet，2007，80（1）：140-151.

·綜述·

New Technology: Differential Diagnosis of NF1 and Vascular Malformation Using Gene Detection

HU Xiaojie1，GAO Yang1，LIN Xiaoxi1，TANG Chun2，LI Wei1，CHEN Hui1，JIN Yunbo1，MA Gang1，YU Wenxin1，CHANG Lei1，YANG Xi1，QIU Yajin1. 1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China；2 Shanghai Eye Disease Prevention and Control Center，Shanghai 200040，China. Corresponding author: LIN Xiaoxi（E-mail: linxiaoxi@126.com）；HU Xiaojie（E-mail: hxjie2002@hotmail.com）.

【Abstract】ObjectiveTo explore the differential diagnosis of NF1 and vascular malformation using genetic testing. Methods A 10-year old boy’s right calf，with scattered erythema，has enlarged without definite boundaries for one year. More than 6 Café au lait，with diameter larger than 1.5 cm，scattered all over the trunk and limbs. CT：capillaries and superficial vein of right calf increased and enlarged，with an impression of tendency to venous malformations. In accordance with NF1 diagnosis criterion，it could not be diagnosed as NF1 without other typical symptom except café au lait. Then NF1 gene detection was performed. Results NF1 nonsense mutations was detected after DNA sequencing，c.C. 4006 C＞T，p.Gln 1336 *（hybrid），supporting for NF1 diagnosis. ConclusionGenetic testing can be performed to help the diagnosis for the patients with atypical clinical manifestations.

【Key words】Neurofibromatosis；Gene test；Vascular malformation

【中圖分類(lèi)號(hào)】R732.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）02－0128－03

通訊作者：林曉曦（E-mail：linxiaoxi@126.com）；胡曉潔（E-mail：hxjie2002@hotmail.com）。

doi：10.3969/j.issn.1673-0364.2016.02.011

收稿日期：（2016年2月20日；修回日期：2016年3月12日）