張安華蔡　翔陳　濤王　萍祝菊紅趙志遠

（1武漢市農(nóng)業(yè)科學技術研究院作物科學研究所，湖北武漢 430345；2武漢維爾福生物科技股份有限公司，湖北武漢 430345；3湖北維民種苗有限公司，湖北武漢 430207）

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8種常見芽菜致病微生物的分離鑒定

張安華1蔡翔2陳濤3王萍1祝菊紅1趙志遠1

（1武漢市農(nóng)業(yè)科學技術研究院作物科學研究所，湖北武漢 430345；2武漢維爾福生物科技股份有限公司，湖北武漢 430345；3湖北維民種苗有限公司，湖北武漢 430207）

摘 要：對目前產(chǎn)業(yè)化程度較高的黃豆、黑豆、豇豆、蘿卜、蕹菜、花生、黃秋葵、向日葵等8種芽菜患病植株上的致病微生物進行分離、純化，共得到24株細菌菌株和8株真菌菌株；利用真菌ITS和細菌16S rDNA通用引物，分別對分離得到的細菌和真菌基因組進行分子生物學鑒定。結果表明：24株細菌分屬8個屬，分別為克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）、短穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）、戴爾福特菌屬（Delftia）、從毛單孢菌屬（Comamonas）；24株細菌均為革蘭氏陰性菌，除果膠桿菌屬外，其余都不是典型的植物病原菌；其中不動桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和假單胞菌屬的細菌出現(xiàn)在2種或2種以上芽菜上；另外4個屬的細菌則只出現(xiàn)在1種芽菜上，呈現(xiàn)出寄主的?；?。8株真菌分屬3個屬，分別為鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）和根霉屬（Rhizopus）；其中根霉屬和鏈格孢屬的真菌分別只出現(xiàn)在蘿卜芽菜和蕹菜芽菜上，其他6種芽菜上分離得到的真菌菌株均屬于鐮刀菌屬。分離菌株回接試驗結果表明，所有菌株均能對芽菜造成不同程度的腐爛癥狀，生產(chǎn)過程中環(huán)境微生物污染同樣能致芽菜腐爛病發(fā)生。

關鍵詞：芽菜；致病微生物；真菌；細菌；分離鑒定

張安華，男，高級農(nóng)藝師，專業(yè)方向：作物栽培，E-mail：1259157360@qq.com

芽菜是利用農(nóng)業(yè)學上的種子在特定環(huán)境條件下培育出的可供食用的芽苗類蔬菜的總稱，具有適用品種多、生長周期短、單位產(chǎn)值高、易于工廠化生產(chǎn)等產(chǎn)品特性，以其安全、營養(yǎng)、保健等特點走入百姓餐桌（康玉凡 等，2008）。據(jù)統(tǒng)計，目前國內(nèi)市場上常見的芽苗菜種類達30種之多（袁星星等，2014）。工廠化生產(chǎn)過程中，芽菜腐爛問題一直困擾著生產(chǎn)企業(yè)，每年因芽菜腐爛造成的損失可達10%（李振華 等，2011；袁星星 等，2014）。張麗等（2010，2011）對國內(nèi)多家工廠化生產(chǎn)的芽菜進行取樣、鑒定，發(fā)現(xiàn)豆類芽菜生產(chǎn)中的主要真菌病害是瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）以及立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的腐爛病。生產(chǎn)實踐中，不同種類和品種的芽菜感病癥狀和程度不盡一致，且表現(xiàn)出極強的季節(jié)差異。目前，國內(nèi)針對芽菜爛種、爛芽的研究多集中于種子帶菌的防控，而忽視了生產(chǎn)過程中的環(huán)境微生物污染。

本試驗以目前產(chǎn)業(yè)化程度較高的黃豆、黑豆、豇豆、蘿卜、蕹菜（空心菜）、花生、黃秋葵和向日葵等8種芽菜為試驗材料，對患病植株上的微生物進行采集、分離和菌株純化，采用分子生物學與形態(tài)學相結合的方法對微生物進行鑒定，確定病原微生物類型與致病性，旨在為科學高效防治芽菜腐爛病提供理論參考。

1　材料與方法

1.1樣品采集、分離及菌株純化

2014年3～6月，分別從湖北玉如意芽業(yè)集團和湖北維民種苗公司生產(chǎn)車間選取黃豆、蘿卜、蕹菜、花生、豇豆、黑豆、黃秋葵和向日葵等8種芽菜中有腐爛癥狀的患病植株，每種芽菜取15～25株，共取樣180株。

采用常規(guī)組織分離法進行病原物分離。培養(yǎng)過程中，若長出真菌則直接將其轉接至PDA平板上，培養(yǎng)5 d后挑取菌落邊緣菌絲塊接種至新的PDA平板上進行培養(yǎng)，重復進行3次，得到純化的真菌；若長出細菌則采用接種環(huán)在NA平板上劃線，培養(yǎng)24 h后挑取單菌落在NA平板上進行培養(yǎng)，重復進行3次，得到純化的細菌（方中達，1996）。

1.2病原微生物形態(tài)學鑒定

將純化的細菌菌株置于NA平板上，真菌菌株置于PDA平板上，在25 ℃條件下進行培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)24 h；真菌培養(yǎng)5～10 d。觀察、記載菌落培養(yǎng)性狀，根據(jù)菌落形態(tài)及顯微鏡下菌絲、孢子形態(tài)等特征進行鑒定。

1.3病原微生物分子生物學鑒定

1.3.1病原細菌分子生物學鑒定 用牙簽挑取1個單菌落放入2 mL NA液體培養(yǎng)基中，置于25 ℃下?lián)u培24 h。然后采用細菌通用引物27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R （5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）直接對分離細菌菌體進行16S rDNA基因片段的擴增。PCR擴增反應體系：10×PCR Buffer（10 mmol·L-1）5.0 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）1.0 μL，TaKaRa Taq酶（5 U·μL-1）0.5 μL，引物1（20 μmol·L-1）1.0 μL，引物2（20 μmol·L-1）1.0 μL，菌液（濃度約為1×109cfu·mL-1）1.0 μL，ddH2O 40.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min（Innis et al.，1990）。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司測序。

1.3.2病原真菌分子生物學鑒定 將分離出的真菌接種在鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，從培養(yǎng)基上刮取0.2 g新鮮菌絲置于研缽中，采用CTAB法（Innis et al.，1990）進行DNA提取，然后將DNA濃度稀釋為50 ng· μL-1，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。采用ITS通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。PCR擴增體系與1.3.1細菌鑒定所采用的相同。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，59℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min（Innis et al.，1990）。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司測序。

1.4序列分析

測序結果利用DNAman軟件進行格式化，選擇2條引物（包含引物）之間的序列，通過BLAST （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）程序與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.5分離菌株回接試驗

選取生產(chǎn)實踐中發(fā)病較嚴重且表面分離到的微生物種類較多的蘿卜和蕹菜進行細菌回接試驗，采用黑豆進行真菌回接試驗。供試蘿卜品種為短葉十三，蕹菜品種為超白梗，黑豆品種為黑豆2號，種子千粒重分別為14.42、43.92、340.00 g，均由湖北玉如意芽業(yè)集團提供。

根據(jù)分子生物學鑒定結果，選取分屬于3個屬的真菌HQK-1、KXC-1、LB-1進行培養(yǎng)，用血球計數(shù)板配制成含孢子1×106個·mL-1的孢子懸浮液。選取分屬于4個屬的細菌KXC-A、KXC-B、LB-A、LB-B進行培養(yǎng)，用平板菌落計數(shù)法配制成濃度為1×108cfu·mL-1的懸浮液。

選擇外觀整齊、籽粒飽滿的蘿卜種子、蕹菜種子和黑豆種子各100粒，用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，然后用自來水沖洗3次，自然風干，分別用真菌孢子懸浮液或者細菌菌液浸泡4 h，以無菌水浸泡的種子作為對照，按照一般生產(chǎn)流程生產(chǎn)芽菜，觀察病害發(fā)生情況。每處理2次重復。

2　結果與分析

2.1微生物的分離

從8種芽菜患病植株上共分離得到24株優(yōu)勢細菌菌株、8株優(yōu)勢真菌菌株。分別為蕹菜：4 株細菌、1 株真菌；黃豆：2 株細菌、1 株真菌；黃秋葵：3 株細菌、1 株真菌；豇豆：2 株細菌、1 株真菌；花生：3 株細菌、1 株真菌；向日葵：4 株細菌、1 株真菌；蘿卜：3 株細菌、1 株真菌；黑豆：3 株細菌、1 株真菌。

2.2病原微生物形態(tài)學鑒定結果

本試驗分離所得細菌均為白色或淺黃色，菌落邊緣平滑，培養(yǎng)24 h后菌落具流動性（圖1）?；ㄉ⒑诙?、黃豆、豇豆、黃秋葵、向日葵上的真菌均為白色菌絲，培養(yǎng)5 d后產(chǎn)生紫紅色色素；蕹菜上的真菌KXC-1培養(yǎng)5 d后在菌落表面產(chǎn)生灰綠色的孢子；蘿卜上的真菌LB-1則生長迅速，培養(yǎng)48 h即可長滿培養(yǎng)皿（直徑9 cm），并產(chǎn)生黑色的孢子（圖2、3）。

圖1 部分芽菜細菌分離物在25 ℃、NA平板上培養(yǎng)24 h后的形態(tài)

圖2 8種芽菜病原真菌在25 ℃、PDA平板上培養(yǎng)7 d后的形態(tài)

圖3 部分芽菜真菌孢子形態(tài)

2.3病原微生物分子生物學鑒定結果

采用引物27F和1492R擴增得到的不同細菌菌株的DNA片段長度約為1 400 bp；采用引物ITS1和ITS4擴增得到的不同真菌菌株的rDNA-ITS片段長度約為700 bp（圖4）。

經(jīng)BLAST比對分析，本試驗分離得到的24株細菌分屬8個屬，分別為克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）、短穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）、戴爾福特菌屬（Delftia）和從毛單孢菌屬（Comamonas）。所有24株細菌均為革蘭氏陰性菌，其中，不動桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和假單胞菌屬的細菌分布于2種或2種以上的芽菜上；果膠桿菌屬和戴爾福特菌屬的細菌只出現(xiàn)在黃秋葵芽菜上；短穩(wěn)桿菌屬和從毛單孢菌屬的細菌則只出現(xiàn)在向日葵芽菜上（表1）。

圖4 ITS序列擴增產(chǎn)物電泳檢測結果

本試驗分離得到的8株真菌分屬3個屬，分別為鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）和根霉屬（Rhizopus），其中鐮刀菌屬的真菌分布于6種芽菜上；鏈格孢屬和根霉屬的真菌僅分別出現(xiàn)在蕹菜和蘿卜芽菜上（表2）。

表1 基于16S rDNA測序對8種芽菜上分離得到的24株細菌的鑒定結果

表2 基于ITS測序對8種芽菜上分離得到的8株真菌的鑒定結果

2.4回接試驗結果

接種細菌菌液培養(yǎng)5 d后，蘿卜芽菜和蕹菜芽菜平均發(fā)病率分別為10%和20%；接種不同的病原菌腐爛程度不同，但發(fā)病癥狀相似。發(fā)病芽體呈水浸狀、褐色腐爛，有臭味，同時在下胚軸的中上部產(chǎn)生褐色菌膜（圖5）。培養(yǎng)7 d后2種芽菜的發(fā)病率均達到100%。

接種真菌孢子懸浮液4 d后，黑豆芽菜開始發(fā)病，接種鐮刀菌的芽菜下胚軸的中上部產(chǎn)生水漬狀病斑，芽體表面出現(xiàn)白色菌絲（圖6），接種8 d后白色菌絲發(fā)展為團狀菌落，周圍的芽菜均產(chǎn)生腐爛癥狀；接種根霉與鏈格孢的芽菜表面也有白色菌絲產(chǎn)生，并產(chǎn)生黑色和褐色的孢子，同時芽體產(chǎn)生水漬狀病斑，由于菌絲生長迅速，接種5 d后所有芽菜表面均布滿根霉或者鏈格孢的菌落，大量芽菜腐爛，失去食用價值。

回接試驗第8天，對照芽菜發(fā)病率僅為5.6%。

圖5 接種細菌5 d后蘿卜和蕹菜芽菜的發(fā)病癥狀

圖6 接種真菌后黑豆芽菜的發(fā)病癥狀

3　結論與討論

張麗等（2010，2011）對豆芽爛芽的病原菌分離鑒定及致病性研究表明，豆芽生產(chǎn)中的主要真菌病害是瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）以及立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的腐爛病。本試驗結果表明，鐮刀菌同樣可致花生、黑豆、黃豆、豇豆、黃秋葵和向日葵芽菜腐爛；根霉和鏈格孢更是引發(fā)蘿卜芽菜和蕹菜芽菜腐爛的主要病原真菌。

本試驗分離得到的24株細菌分屬8個屬，除果膠桿菌屬外，均為環(huán)境腐生微生物，其中不動桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和假單胞菌屬是最為常見的食源性微生物，也是人類的機會致病菌。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因很可能是芽菜生產(chǎn)中對種子的精選和消毒處理降低了植物病原菌的種群數(shù)量，而環(huán)境微生物成為了主要微生物群體。因此，在芽菜腐爛病防控措施上，既要嚴格進行種子消毒，更應重視生產(chǎn)過程的環(huán)境滅菌，以減少環(huán)境微生物污染。

果膠桿菌屬細菌和戴爾福特菌屬細菌只出現(xiàn)在黃秋葵芽菜上，短穩(wěn)桿菌屬細菌和從毛單孢菌屬細菌則只出現(xiàn)在向日葵芽菜上；鏈格孢屬真菌和根霉屬真菌分別僅出現(xiàn)在蕹菜芽菜和蘿卜芽菜上，其分布呈現(xiàn)出一定的專一性，說明不同種類芽菜上的微生物分布規(guī)律不盡相同。

在國外，芽菜上的微生物如大腸桿菌、沙門氏菌等既是重要的環(huán)境微生物，又是重要的食源性微生物和機會致病菌，其中大腸桿菌E.coli O157：H7還導致了一些公共衛(wèi)生事件，是研究的熱點（Erickson，2012）。我國對于芽菜上的食源性微生物的研究極少，亟須開展。

參考文獻

方中達．1996．植病研究方法．3版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社．

康玉凡，陶禮明，毛振賓，羅珊．2008．工廠化豆芽成為現(xiàn)代加工食品新寵．長江蔬菜，（9）：73-76．

李振華，段玉，康玉凡．2011．豆類芽菜生產(chǎn)工藝的研究進展．中國農(nóng)學通報，27（10）：76-81．

袁星星，陳新，陳華濤，崔曉艷，顧和平，張紅梅．2014．豆類芽菜生產(chǎn)技術研究現(xiàn)狀及發(fā)展方向．江蘇農(nóng)業(yè)科學，42（5）：136-139．

張麗，吳小剛，張力群，康玉凡，梁海榮．2010．豆芽爛芽的病原菌分離鑒定及致病性研究．長江蔬菜，（2）：71-74．

張麗，張立群，段會梅，康玉凡，呂玉蘭．2011．豆芽立枯病診斷與防治試驗．中國蔬菜，（4）：61-65．

Erickson M C．2012．Internalization of fresh produce by foodborne pathogens．Annual Review of Food Science and Technology，3：283-310．

Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，White T J．1990．PCR protocols：a guide to methods and applications．San Diego：Academic Press．

Isolation and Identification of Eight Microorganism Causing Sprout Disease

ZHANG An-hua1，CAI Xiang2，CHEN Tao3，WANG Ping1，ZHU Ju-hong1，ZHAO Zhi-yuan1
（1Institute of Crop Sciences，Wuhan Academy of Agriculture Science and Technology，Wuhan 430345，Hubei，China；2Wuhan Weierfu Biological Technology Co.，Ltd，Wuhan 430345，Hubei，China；3Hubei Weimin Biological Technology Co.，Ltd，Wuhan 430207，Hubei，China）

Abstract：Twenty-four bacteria and 8 fungi were isolated from 8 different kind industrial producing sprouts．Molecular identification showed that these 24 bacteria belong to 8 genus（Klebsiella，Enterobacter，Pseudomonas，Acinetobacter，Pectobacterium，Empedobacter，Delftia and Comamonas），and were all G-，and 7 of them were not typical plant pathogen，except Pectobacterium．Four genus（Acinetobacter，Enterobacter，Klebsiella and Pseudomonas）were isolated from 2 or over 2 sprouts，and the other 4 genus were only isolated from one kind sprout．The result implied that there was host specialization in these bacteria．Eight fungi belong to 3 genus（Fusarium，Alternaria and Rhizopus）．Fungi isolated from the other 6 sprouts all belong to Fusarium，Alternaria and Rhizopus fungi were only isolated from water spinach and radish sprout，respectively．The water spinach and radish sprouts showed different rot symptoms after inoculated by 4 bacteria，and the black soya bean sprouts showed different rot symptoms after inoculated by 3 fungi．These results indicated that microorganism from environment during production process could also cause sprout diseases．

Key words：Sprout；Microorganism；Bacteria；Fungi；Identification

收稿日期：2015-10-21；接受日期：2016-01-24

基金項目：武漢市科技局關鍵技術攻關項目（2014020202010135）