單幸福，李　江，鄭曉林，許　媛，劉發(fā)義

(1.青島澳海生物有限公司，山東 青島 266101；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061；3.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 日照 276826)

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尿素包合法富集魚油乙酯中的EPA和DHA

單幸福1，李江2，鄭曉林3，許媛1，劉發(fā)義1

(1.青島澳海生物有限公司，山東 青島 266101；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061；3.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 日照 276826)

摘要：采用尿素包合法富集魚油乙酯中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)富集工藝為：m(尿素)∶m(魚油乙酯)為1.5∶1、V(乙醇)∶m(魚油乙酯)為3∶1、包合時(shí)間1 h、包合溫度75 ℃、結(jié)晶溫度25 ℃，一次包合的EPA+DHA含量可達(dá)85%以上，收率60%。

關(guān)鍵詞：魚油乙酯；EPA；DHA；尿素包合法

二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)同屬ω-3型多烯脂肪酸(ω-3PUFAs)，是人類不能自身合成的必需脂肪酸[1]。醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)研究表明，EPA和DHA具有抑制血小板凝聚、抗血栓、舒張血管、調(diào)節(jié)血脂、升高HDL(高密度脂蛋白膽固醇)、降低LDL(低密度脂蛋白膽固醇)等功能，對(duì)心腦血管疾病、糖尿病、炎癥、腎病以及癌癥也有較好的療效[2-3]，因此，以EPA和DHA為主要成分的保健品銷量大增，但絕大多數(shù)產(chǎn)品中EPA含量在18%左右、DHA含量在12%左右，有些甚至更低，僅有少量產(chǎn)品中的EPA+DHA含量能達(dá)到50%。閔征橋等[4]采用尿素包合工藝將EPA+DHA含量提高到72%。2010年我國藥典[5]公布的藥品級(jí)多烯酸乙酯的EPA+DHA含量高達(dá)84%以上(達(dá)到歐洲相關(guān)標(biāo)準(zhǔn))。而目前國內(nèi)EPA+DHA含量高于84%的產(chǎn)品并不多，生產(chǎn)工藝也比較復(fù)雜。因此，高含量EPA+DHA產(chǎn)品的制備技術(shù)仍是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

EPA和DHA主要來自于海洋魚類，從一般食物中難以攝取。目前，從魚油中富集純化EPA和DHA的方法主要有有機(jī)溶劑法、低溫溶劑結(jié)晶法、硝酸銀配合法、超臨界CO2萃取法、色譜分離法、脂肪酶催化法、分子蒸餾法和尿素包合法[6-7]等。其中，尿素包合法因設(shè)備簡單、試劑便宜、操作簡便、無需高溫、能夠比較完全地保留PUFAs的營養(yǎng)和生理活性而成為近年來富集PUFAs的重要手段[8]。作者在前期研究的基礎(chǔ)上，以EPA+DHA含量較高的魚油脂肪酸乙酯(以下簡稱魚油乙酯)為原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)尿素包合法進(jìn)行優(yōu)化。

1實(shí)驗(yàn)

1.1原料、試劑與儀器

魚油乙酯，購自江蘇無錫迅達(dá)海洋生物制品有限公司。其中一種EPA+DHA含量為70.3%，EPA和DHA含量分別為15.4%和54.9%；另一種EPA+DHA含量為75%，EPA和DHA含量分別為54%和21%。

尿素，山東魯西化工有限公司；95%乙醇，萊陽康德化工有限公司；鹽酸、正己烷均為分析純。

DK-8D型數(shù)顯恒溫水浴鍋；EYELA(OSB-2100)型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHZ-(Ⅲ)D型水循環(huán)真空泵；Agilent7890B型氣相色譜儀。

1.2尿素包合法富集魚油乙酯中的EPA和DHA

向裝有乙醇的三頸燒瓶中加入一定量尿素，置于75 ℃恒溫水浴，攪拌，得到尿素和乙醇的飽和溶液。稱取一定量魚油乙酯，加入到尿素和乙醇的飽和溶液中，于75 ℃攪拌1 h后，自然冷卻至室溫(約25 ℃)，靜置過夜，過濾除去結(jié)晶的尿素，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收濾液中的乙醇，然后用鹽酸溶液溶解剩余物，即得DHA和EPA的富集產(chǎn)物。

1.3富集工藝優(yōu)化

分別在m(尿素)∶m(魚油乙酯)(g∶g，下同)為1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1，V(乙醇)∶m(魚油乙酯)(mL∶g，下同)為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1的條件下，考察m(尿素)∶m(魚油乙酯)、V(乙醇)∶m(魚油乙酯)對(duì)富集效果的影響。在此基礎(chǔ)上，分別以EPA+DHA含量和收率為考核指標(biāo)，以m(尿素)∶m(魚油乙酯)、V(乙醇)∶m(魚油乙酯)、包合時(shí)間為考察因素，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以確定最佳的富集工藝。

1.4EPA和DHA的含量測定

參照GB/T 17377-2008，采用氣相色譜，用面積歸一化法測定產(chǎn)物中EPA和DHA的含量。色譜條件：色譜柱為Rtx-1(30 m×0.5 mm)；氫火焰離子檢測器；分流比20∶1；固定升溫程序；氣化溫度250 ℃；檢測器溫度260 ℃；柱溫200 ℃；載氣壓力200 kPa；氫氣流速30 mL·min-1；空氣流速300 mL·min-1；進(jìn)樣量0.2 μL。

2結(jié)果與討論

2.1氣相色譜分析

采用尿素包合法富集魚油乙酯中的EPA和DHA，魚油乙酯在富集前后的氣相色譜如圖1所示。

由圖1可以看出，EPA和DHA的出峰時(shí)間分別為28 min和54 min；富集后的魚油乙酯中的飽和脂肪酸成分較富集前明顯減少。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1m(尿素)∶m(魚油乙酯)對(duì)富集效果的影響(表1)

由表1可知，隨著尿素用量的增加，魚油乙酯中EPA+DHA含量總體呈上升趨勢。當(dāng)m(尿素)∶m(魚油乙酯)為1.0∶1時(shí)，EPA+DHA含量僅為80.7%；而當(dāng)m(尿素)∶m(魚油乙酯)在(1.5～3.0)∶1范圍內(nèi)時(shí)，EPA+DHA含量均可達(dá)到85%以上，彼此間并沒有顯著差異，但液相收率會(huì)隨著尿素用量的增加有所降低。這可能是因?yàn)?，?dāng)尿素用量較少時(shí)，尿素分子對(duì)飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的包合率較低；隨著尿素用量的增加，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸與尿素形成包合物的效率大幅升高，EPA+DHA的含量相應(yīng)升高；當(dāng)尿素用量增加到一定程度后，被包合的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸已經(jīng)達(dá)到平衡，如果繼續(xù)增加尿素用量，尿素反而會(huì)與不飽和脂肪酸發(fā)生包合，雖然EPA+DHA的含量可能會(huì)進(jìn)一步升高，但升幅甚微，而且會(huì)影響液相收率。因此，m(尿素)∶m(魚油乙酯)以1.5∶1較合適。

表1m(尿素)∶m(魚油乙酯)對(duì)富集效果的影響

富集條件：魚油乙酯10 g，95%乙醇60 mL，V(乙醇)∶m(魚油乙酯)=6∶1，包合溫度75 ℃。富集前魚油乙酯中的EPA含量為15.4%，DHA含量為54.9%，EPA+DHA含量為70.3%。

2.2.2V(乙醇)∶m(魚油乙酯)對(duì)富集效果的影響(表2)

表2V(乙醇)∶m(魚油乙酯)對(duì)富集效果的影響

富集條件：魚油乙酯10 g，尿素15 g，m(尿素)∶m(魚油乙酯)=1.5∶1，包合溫度75 ℃。

由表2可知，V(乙醇)∶m(魚油乙酯)對(duì)EPA+DHA含量影響不大；隨著乙醇用量的增加，液相收率顯著升高，但當(dāng)V(乙醇)∶m(魚油乙酯)超過3∶1時(shí)，液相收率升幅趨緩。這可能是因?yàn)?，隨著乙醇用量的增加，雖然溶解在乙醇中的多烯脂肪酸乙酯含量相應(yīng)升高，但過濾會(huì)影響對(duì)多烯脂肪酸的吸附及包合，因而液相收率并沒有出現(xiàn)明顯的變化。因此，V(乙醇)∶m(魚油乙酯)以3∶1較合適。

2.3正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以EPA+DHA含量和收率為考核指標(biāo)，以m(尿素)∶m(魚油乙酯)(A)、V(乙醇)∶m(魚油乙酯)(B)、包合時(shí)間(C)為考察因素，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與分析見表3。

由表3可知，各因素對(duì)EPA+DHA含量的影響大小依次為B>A>C，最優(yōu)條件為A3B3C2，即m(尿素)∶m(魚油乙酯)為1.5∶1、V(乙醇)∶m(魚油乙酯)為3∶1、包合時(shí)間為1 h；各因素對(duì)收率的影響大小依次為A>B>C，最優(yōu)條件為A1B3C3，即m(尿素)∶m(魚油乙酯)為0.5∶1、V(乙醇)∶m(魚油乙酯)為3∶1、包合時(shí)間為2 h?？紤]到本實(shí)驗(yàn)的主要目的是使EPA+DHA含量達(dá)到84%以上，因此，確定最優(yōu)富集工藝為：m(尿素)∶m(魚油乙酯)1.5∶1、V(乙醇)∶m(魚油乙酯)3∶1、包合時(shí)間1 h，此時(shí)，EPA+DHA含量為85.2%，回收率為60%。

2.4討論

以三甘酯型魚油(EPA+DHA含量低)為原料采用尿素包合法富集EPA和DHA的常規(guī)方法是：先對(duì)魚油進(jìn)行乙酯化，再用尿素包合濃縮。通常需要使用3倍以上的尿素、6倍或更多的乙醇，一次包合的EPA+DHA含量只有70%，遠(yuǎn)達(dá)不到國家藥典要求(>84%)。本實(shí)驗(yàn)以魚油乙酯為原料(EPA+DHA含量75%)，只需使用1.5倍的尿素、3倍的乙醇，一次包合，室溫(25 ℃)冷卻結(jié)晶，即可將魚油乙酯中EPA+DHA含量提高到85%以上，達(dá)到國家藥典要求。與常規(guī)方法相比，具有成本低、節(jié)能、廢物和廢水少、操作簡便易行、便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

表3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3結(jié)論

采用尿素包合法富集魚油乙酯中的EPA和DHA，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)富集工藝為：m(尿素)∶m(魚油乙酯)為1.5∶1、V(乙醇)∶m(魚油乙酯)為3∶1、包合時(shí)間1 h、包合溫度75 ℃、結(jié)晶溫度25 ℃，一次包合的EPA+DHA含量可達(dá)85%以上，收率60%。該方法具有成本低、節(jié)能、廢物和廢水少、操作簡便易行、便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

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Enrichment of EPA and DHA from Fish Oil Ethyl Esterby Urea Inclusion Method

SHAN Xing-fu1，LI Jiang2，ZHENG Xiao-lin3，XU Yuan1，LIU Fa-yi1

(1.QingdaoAuhaiBiotechCo.,Ltd.，Qingdao266101,China；2.TheFirstInstituteofOceanography,SOA,Qingdao266061,China；3.RizhaoVocationalandTechnicalCollege,Rizhao276826,China)

Keywords：fishoilethylester；eicosapentaenoicacid(EPA)；decosahexaenoicacid(DHA)；ureainclusionmethod

Abstract：Eicosapentaenoicacid(EPA)anddecosahexaenoicacid(DHA)fromfishoilethylesterwereenrichedbyanureainclusionmethod.Theoptimumenrichmentprocessobtainedbyasinglefactorexperimentandanorthogonalexperimentwereasfollows:m(urea)∶m(fishoilethylester)of1.5∶1，V(ethanol)∶m(fishoilethylester)of3∶1,inclusiontimeof1h,inclusiontemperatureof75 ℃,crystallizationtemperatureof25 ℃.Underaboveconditions,thetotalcontentofEPAandDHAfromfishoilethylesterreached85%,andtheyieldwas60%.

基金項(xiàng)目：中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2014T09)

收稿日期：2016-01-27

作者簡介：單幸福(1983-)，女，山東菏澤人，助理工程師，研究方向：功能性油脂的合成，E-mail：shanxf@126.com；通訊作者：李江，副研究員，E-mail：lijiang@fio.org.cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.06.013

中圖分類號(hào)：TQ 645.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)06-0059-04