康　薇，劉遠(yuǎn)河

(礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復(fù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435003)

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海州香薷離體再生技術(shù)研究

康薇，劉遠(yuǎn)河

(礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復(fù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435003)

摘要：為探討適合海州香薷的組培育苗技術(shù)，解決生產(chǎn)實(shí)踐中海州香薷種苗供應(yīng)不足的問題，選擇大冶銅綠山礦區(qū)生長(zhǎng)的野生海州香薷為試材，通過外植體選擇、激素配比優(yōu)化、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和生根培養(yǎng)等步驟，建立了海州香薷的離體再生體系。結(jié)果表明，以海州香薷帶芽節(jié)段為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4，愈傷組織分化不定芽的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4，在此條件下，愈傷組織誘導(dǎo)率最高可達(dá)98.3%，不定芽分化率最高可達(dá)100%，單個(gè)愈傷組織不定芽分化數(shù)平均達(dá)7.5個(gè)。將不定芽置于MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4上很容易生根，生根組培苗在裝有銅污染土壤的培養(yǎng)盆中成活率可達(dá)100%。

關(guān)鍵詞：海州香薷；組培育苗；植物修復(fù)；銅污染土壤

海州香薷(Elsholtzia haichouensisSun)，俗稱銅草花、銅草，為唇形科、香薷屬一年生草本植物。海州香薷既是一種藥用價(jià)值較高的中藥材，又是一種理想的銅污染土壤修復(fù)植物。海州香薷富含具有廣譜抗菌活性的香薷酮，可用于防治流行性感冒[1-2]；海州香薷還是一種銅指示植物，具有極高的銅富集特性，且主要分布在銅含量較高的銅礦區(qū)或銅礦廢棄地。因此，近年來，作為一種銅污染土壤的植物修復(fù)材料，海州香薷?jìng)涫荜P(guān)注[3-4]。

自然條件下，海州香薷以種子繁殖，由于花期較短且集中在秋季，加之采種難度較大，因而不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)用種需求。目前，通過組織培養(yǎng)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了石香薷(Mosla chinensisMaxim)[5]和香薷(Elshoitzia ciliatHyland)[6]的離體再生，但鮮見海州香薷組培育苗的報(bào)道。鑒于此，作者以湖北大冶銅綠山古銅礦遺址上生長(zhǎng)的海州香薷為試材，通過外植體選擇、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和生根培養(yǎng)等步驟，篩選合適的培養(yǎng)條件，建立海州香薷的離體再生體系，擬為大規(guī)模繁殖海州香薷組培苗奠定基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料

海州香薷植株，采自大冶銅綠山古銅礦遺址內(nèi)遺存的古冶煉渣上。

1.2方法

1.2.1基本培養(yǎng)基的選擇

海州香薷作為一種銅指示植物，具有嗜銅特性，需要銅濃度較高的生長(zhǎng)環(huán)境。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大冶銅綠山古銅礦遺址上古冶煉渣的銅含量為420.32～14 644.63mg·kg-1，平均值高達(dá)3 166.73mg·kg-1[7]。因此，直接用MS培養(yǎng)基作為海州香薷組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基不能滿足外植體增殖和生長(zhǎng)的需要。綜合野外調(diào)查和預(yù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇CuSO4含量為3.2mg·L-1的MS培養(yǎng)基為海州香薷組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。

1.2.2外植體的制備

為了降低啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)的染菌率，本實(shí)驗(yàn)采用野外采集植株室內(nèi)盆栽的途徑培養(yǎng)海州香薷獲取外植體。具體做法是：5月中下旬，連同生長(zhǎng)地土壤挖取海州香薷植株進(jìn)行室內(nèi)裝盆，用剪刀沿盆土處去除植株上部，將盆置于組培室內(nèi)培養(yǎng)至長(zhǎng)出新芽后，從植株中間切取長(zhǎng)約10～15cm的帶芽節(jié)段，用自來水沖洗30～40min后，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)切取葉片，先用70%酒精將葉片消毒15～20s，再用0.1%升汞處理5～7min，最后用無菌水沖洗4～5次后晾干。

1.2.3離體再生技術(shù)研究

分別以帶芽節(jié)段、不帶芽節(jié)段和葉片作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，在培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃、光照強(qiáng)度為3 000lx、光照時(shí)間為16h·d-1的條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究海州香薷的離體再生技術(shù)。實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

1)愈傷組織誘導(dǎo)

將3種外植體分別接種在MS+0.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA+25g·L-1蔗糖+6.5g·L-1瓊脂+3.2mg·L-1CuSO4上，培養(yǎng)15d后觀察外植體的愈傷組織誘導(dǎo)效果。按式(1)計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率，確定最佳外植體。

(1)

將最佳外植體接種在不同激素配比(6-BA和NAA的配比，下同)的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15 d后觀察愈傷組織的誘導(dǎo)效果。按式(1)計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率，確定愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。

2)不定芽分化

將最佳外植體接種在不同激素配比的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15 d后觀察愈傷組織分化不定芽的情況。按式(2)計(jì)算不定芽分化率，確定愈傷組織分化不定芽的最適培養(yǎng)基。

(2)

3)生根培養(yǎng)

選擇長(zhǎng)約2～3 cm健壯不定芽切下后，置于MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4上生根培養(yǎng)10～15 d，待不定芽長(zhǎng)出3～5條雞爪根后，于25 ℃左右開瓶煉苗1周，將生根苗轉(zhuǎn)入裝有銅污染土壤的培養(yǎng)盆中栽植，觀察成活情況。

2結(jié)果與討論

2.1不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)效果(表1)

表1海州香薷不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)效果

由表1可知，不同外植體生長(zhǎng)情況差異較大。帶芽節(jié)段外植體呈鮮綠色，節(jié)段下端切口處有愈傷組織長(zhǎng)出，呈膨大狀，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)96.7%；不帶芽節(jié)段外植體呈黃褐色，為壞死狀，沒有愈傷組織形成；葉片外植體呈綠色，葉蜷縮、且被綠色顆粒狀的愈傷組織附著，愈傷組織誘導(dǎo)率僅53.3%。表明，海州香薷誘導(dǎo)愈傷組織，選用帶芽節(jié)段為外植體效果較好。

2.2激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響(表2)

表2激素配比對(duì)海州香薷愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響

注：基本培養(yǎng)基為MS+25 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4。

由表2可知，愈傷組織誘導(dǎo)率最高的是5#處理組，高達(dá)98.3%；其次是6#處理組和4#處理組，分別為86.7%和78.3%；其它處理組的愈傷組織誘導(dǎo)率都在60%以下。因此，用海州香薷帶芽節(jié)段誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，選擇0.5 mg·L-16-BA 與0.5 mg·L-1NAA 配比較為適合，即用MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4為培養(yǎng)基較為合適。

2.3激素配比對(duì)愈傷組織分化不定芽的影響(表3)

表3激素配比對(duì)海州香薷愈傷組織分化不定芽的影響

Tab.3Effect of the ratio of plant hormone on adventitions

注：基本培養(yǎng)基為MS+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4；接種愈傷組織數(shù)為45個(gè)。

由表3可知， 9個(gè)處理組的愈傷組織均分化不定芽，但不定芽分化率和分化不定芽愈傷組織數(shù)差別較大，其中5#、4#和6#處理組的不定芽分化率都在90%以上，分別為100%、95.6%和91.1%，單個(gè)愈傷組織平均分化不定芽數(shù)依次為7.5個(gè)、5.5個(gè)和5.5個(gè)。從不定芽長(zhǎng)勢(shì)看，5#處理組分化的不定芽更健壯、飽滿(圖1b)。綜合考慮，用0.5 mg·L-16-BA與0.1 mg·L-1NAA配比較為合適，愈傷組織分化不定芽的效果更好，即選擇MS+0.5mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4更為合適。

2.4生根和移栽

將健壯不定芽置于MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4上生根培養(yǎng)10～15 d，然后移栽在裝有銅污染土壤的培養(yǎng)盆中，成活率達(dá)100%。海州香薷離體再生過程如圖1所示。

a.MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4誘導(dǎo)的愈傷組織b.愈傷組織在MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4上分化的不定芽c.健壯不定芽組培苗d.移栽

圖1海州香薷離體再生過程

Fig.1 Regeneration process ofElsholtziahaichouensisSuninvitro

3結(jié)論

通過外植體選擇、激素配比優(yōu)化、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和生根培養(yǎng)等步驟，建立了海州香薷的離體再生體系，以帶芽節(jié)段為外植體，以6-BA和NAA為外源激素，海州香薷愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4，愈傷組織分化不定芽的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4。在此條件下，愈傷組織誘導(dǎo)率最高可達(dá)98.3%，不定芽分化率最高可達(dá)100%，單個(gè)愈傷組織平均分化不定芽數(shù)可達(dá)7.5個(gè)。將不定芽置于MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂+3.2 mg·L-1CuSO4上很容易生根，煉苗后的生根苗在盛有銅污染土壤的培養(yǎng)盆中成活率可達(dá)100%。

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Regeneration Technology ofElsholtziaHaichouensisSuninvitro

KANG Wei,LIU Yuan-he

(HubeiKeyLaboratoryofMineEnvironmentalPollutionControl&Remediation,Huangshi435003,China)

Keywords：Elsholtzia haichouensisSun;tissecultureandseedinggrowth;phytoremediation;coppercontaminatedsoil

Abstract：InordertomakeupfortheshortageofproductionpracticeinElsholtzia haichouensisSunseeding,tissueculturaltechniquehasbeenstudied.Inthepaper,wechoosetheexperimentalmaterialofElsholtzia haichouensisSunwhichgrowsinDayeTongluMountain,Hubei,China,andestablishitsregenerationsystemin vitrobychoosingexplants,regulatingtheratioofplanthormone,inducingthecallus,differentiatingtheadventitiousbudandrootingculture.Theresultsshowthatusingbudsegmentsasexplants,thebestmediumofcallusinductionandthebuddifferentiationareasfollows:MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+sucrose25g·L-1+agar6.5g·L-1+CuSO43.2mg·L-1,MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+sucrose30g·L-1+agar7.0g·L-1+CuSO43.2mg·L-1,respectively.Underaboveconditions,callusinductionrateandadventitiousbuddifferentiationratereachupto98.3%and100%,respectively.Theaveragequantityofbudsproducingfromthesignalcallusis7.5.ThemediumcomponentofMS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+sucrose30g·L-1+agar7.0g·L-1+CuSO43.2mg·L-1isbeneficialtobuds′rooting.Thesurvivalrateofrootingbudscouldreach100%incultivatingbasinwiththecoppercontaminatedsoils.

基金項(xiàng)目：湖北省科技廳公益性科技研究項(xiàng)目(2012DCA23001)，湖北省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(T201317)

收稿日期：2016-02-02

作者簡(jiǎn)介：康薇(1983-)，女，湖北荊門人，博士，講師，研究方向：污染環(huán)境生物修復(fù)；通訊作者：劉遠(yuǎn)河，高級(jí)工程師，E-mail：1241854033@qq.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.06.012

中圖分類號(hào)：Q 813.1X 173

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)06-0056-03