丁梅　吳坤鑫　譚德冠　張家明

摘 要 植物體內(nèi)羥基腈水解酶（HNL）催化羥基腈類化合物水解，釋放氫氰酸，抵御害蟲和病原菌的侵害。橡膠樹是產(chǎn)氰植物，生物信息學(xué)研究表明，橡膠樹有6個(gè)HNL基因，在分子進(jìn)化分析中與大戟科其他植物的HNL基因聚為一類，與十字花科等植物的HNL親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明大戟科HNL基因的重復(fù)發(fā)生在與十字花科等植物分化之后，大戟科植物通過HNL基因的重復(fù)強(qiáng)化對(duì)病蟲害的防御作用。通過RT-PCR從橡膠樹熱研7-33-97品系中克隆了其中最重要的1個(gè)HNL蛋白編碼基因HbHNL-1。該基因cDNA序列全長1 003 bp，閱讀框771 bp，編碼257個(gè)氨基酸，其編碼蛋白分子量為29.2 ku，理論等電點(diǎn)為5.7。定量PCR分析表明，HbHNL-1在初生膠乳中的表達(dá)量是次生膠乳中的100多倍，在幼嫩葉片中的表達(dá)量為成熟葉片的8倍。說明橡膠樹的幼嫩組織器官是HbHNL-1的重點(diǎn)防御部位。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；HbHNL-1；基因克??；基因表達(dá)分析；基因家族

中圖分類號(hào) S794.1；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

橡膠樹（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）屬大戟科橡膠屬，是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物。其合成的天然橡膠占全世界天然橡膠總產(chǎn)量的99%以上[1-2]。我國目前植膠面積已達(dá)113.3萬hm2，年產(chǎn)干膠85萬t，位于五大產(chǎn)膠國之列，同時(shí)我國又是天然橡膠的最大進(jìn)口國，天然橡膠對(duì)外依存度已超過80%[3-4]。因此提高天然橡膠產(chǎn)量成為當(dāng)前我國天然橡膠研究的重要課題。病蟲害是影響橡膠樹產(chǎn)量的主要因素之一。生氰反應(yīng)是橡膠樹和木薯等大戟科作物防御病蟲害的重要機(jī)制[5]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球有3 000多種植物利用生氰作用抵御病蟲侵害[6]。生氰反應(yīng)主要由兩類酶完成，一種是生氰葡萄糖苷酶（Linamarase）[7]，通過降解生氰葡萄苷釋放氫氰酸；另一種是羥基腈水解酶[（S）-hydroxynitrile lyase，簡稱HNL]，又名產(chǎn)氰醇羥基腈水解酶[（S）-cyanohydrin producing hydroxynitrile lyase]、氧腈酶[（S）-oxynitrilase]等。在植物體內(nèi)，HNL所催化的產(chǎn)氰反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，HNL催化羥基腈類化合物水解，釋放氫氰酸，以抵御害蟲和病原菌的侵害[8-10]。

橡膠樹的HNL能以各種脂肪鏈、芳香環(huán)和雜環(huán)化合物為底物合成不同的羥基腈化合物[11-12]。Hasslacher等[13]從橡膠樹葉片中克隆1個(gè)HNL基因，并將其在大腸桿菌和酵母中表達(dá)，獲得了有活性的重組蛋白。在原核表達(dá)的重組蛋白多積累在包含體中，而在畢氏酵母中重組蛋白表達(dá)量最高可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白的50%，每升培養(yǎng)基可產(chǎn)22 g重組蛋白[14]。同時(shí)通過對(duì)橡膠樹HNL基因的改造，將一個(gè)酯化酶（Esterase）的活性氨基酸殘基移植到HNL，可以提高HNL的反應(yīng)效率[15]。綜上，目前對(duì)橡膠樹HNL的研究主要集中在其工業(yè)用途。但是對(duì)HNL基因在橡膠樹體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控以及其在橡膠樹抗病蟲害中的作用機(jī)理等研究則很少報(bào)道。在本研究中，筆者通過生物信息分析，找到6個(gè)橡膠樹HNL基因，分別從橡膠樹葉片和膠乳中克隆了1個(gè)HNL基因的全長cDNA序列，并分析該基因的序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化、組織表達(dá)特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究HNL在橡膠樹中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹品種熱研7-33-97幼嫩葉片、成熟葉片，以及未開割樹的初生膠乳、次生膠乳采集于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場三隊(duì)。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹羥基腈水解酶基因家族生物信息分析

分別利用文獻(xiàn)報(bào)道的橡膠樹羥基腈水解酶基因（U40402，命名為HbHNL-1）的DNA序列及其編碼蛋白的N端120個(gè)氨基酸序列搜索GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov），選擇GenBank數(shù)據(jù)庫中的whole-genome shotgun contigs（wgs）項(xiàng)目下的橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫Hevea brasiliensis（Willd. ex A.Juss.）Müll. Arg.（taxid：3981）進(jìn)行分析，獲得包含該基因片段的大片段序列。用MacVector12.6（MacVector， Inc.， USA）預(yù)測分析HbHNL-1基因編碼蛋白質(zhì)大小、等電點(diǎn)等信息；將HbHNL-1 5′端上游序列提交PlantCARE服務(wù)器（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和PLACE 服務(wù)器（http：//www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/）預(yù)測啟動(dòng)子保守區(qū)域中潛在的順式作用元件。同時(shí)，下載近緣物種的同源基因氨基酸序列，用ClustalX2.0進(jìn)行序列比對(duì)。將比對(duì)結(jié)果輸入MEGA version7.0中，用Neighbor-Joining（NJ）方法生成系統(tǒng)樹，用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1 000次重復(fù)。

1.2.2 基因克隆 分別從同一棵6齡未開割樹收集初生膠乳和次生膠乳，提取RNA，初生膠乳采自新抽嫩枝，次生膠乳采自離地1 m的樹干。同時(shí)分別采集幼嫩葉片和成熟葉片。所有樣品置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室。葉片經(jīng)液氮充分研磨后，用RNA提取試劑盒（Tiangen， Beijing）提取總RNA，膠乳直接用試劑盒提取總RNA。然后用Oligotex Direct mRNA純化試劑盒（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）提取mRNA，再用Fermentas公司的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒把mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA。最后，用橡膠樹HbHNL-1基因特異引物（F1： 5′-CATCAGAAAA

TGGCATTCGCTC-3′；R1： 5′-TACACAATGGGGGT

AGCTTTCC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL擴(kuò)增體系中含1 U Taq plus DNA polymerase，100 μmol/L dNTPs，0.2 μmol/L引物，0.5 μL cDNA模板。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收純化目的條帶，克隆到pMD19-T載體（大連寶生物）上，分別挑3個(gè)克隆測序。利用BLAST檢索GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行同源性分析。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析 采用CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad Laboratories Inc.， USA），實(shí)驗(yàn)操作按儀器使用說明書進(jìn)行。反應(yīng)試劑采用SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒（TaKaRa Biotechnology， Japan）。取不同實(shí)驗(yàn)材料RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈， 將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍后做為實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析模板。反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix和10 μmol/L的上、下游熒光定量特異引物各0.3 μL（終濃度為0.15 μmol/L）。PCR擴(kuò)增程序如下： 94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。每個(gè)樣品重復(fù)3次。橡膠樹HbHNL-1基因特異引物為F2（5′-GAGACTGTCCCA

CTTCAAATGA-3′）和R2（5′-CCAAGAGGTGGCTGAT

ACCT-3′）。內(nèi)參基因采用ubiquitin-protein ligase 4（HbUBC4）基因（基因登錄號(hào)：HQ323249），擴(kuò)增引物為F3（5′-TTGATGGCTCACCCTGAACC-3′）和R3（5′-TGGTGACGCTGCAAGTCTAG-3′）。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹基因組中羥基腈水解酶基因家族分析

利用文獻(xiàn)報(bào)道的橡膠樹羥基腈水解酶基因（U40402，命名為HbHNL-1）搜索GenBank中橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫Hevea brasiliensis（Willd. ex A.Juss.）Müll. Arg.（taxid：3981），結(jié)果發(fā)現(xiàn)HbHNL-1基因位于長度為6 588 bp的基因組片段上（GenBank登錄號(hào)： AJJZ010441696）。利用HbHNL-1基因編碼蛋白的N端120個(gè)氨基酸序列再次搜索橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫，找到另外5個(gè)同源性較高的基因片段（基因登錄號(hào)分別為：AJJZ010058119，AJJZ010171002，AJJZ010988750，AJJZ010991813，AJJZ010963267），其對(duì)應(yīng)編碼蛋白相似性達(dá)到80%～94%（圖1）。說明HbHNL在橡膠樹基因組中是一個(gè)基因家族。

2.2 橡膠樹HbHNL的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了明確橡膠樹HbHNL基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，從公共數(shù)據(jù)庫下載典型的植物HNL蛋白及其近緣蛋白氨基酸序列，與本研究所獲得的HbHNL基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，橡膠樹所有的HbHNL蛋白與大戟科植物木薯（Manihot esculenta Crantz）和斑籽（Baliospermum montanum（Willd.）Müll. Arg.）的HNL聚為一類，與擬南芥（Arabidopsis thaliana，十字花科）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana，山柑科）、山崳菜（Eutrema salsugineum，十字花科）、亞麻芥（Camelina sativa，十字花科）等植物的HNL類蛋白質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2），說明大戟科植物的HNL基因家族成員的增多（基因重復(fù)）發(fā)生在與十字花科、山柑科等植物的分化之后。

2.3 橡膠樹HbHNL-1的克隆及序列分析

雖然通過生物信息分析在橡膠樹基因組中找到了6個(gè)HbHNL基因，但是，由于橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫還不完整，除HbHNL-1外，其他5個(gè)基因片段都不能編碼完整的羥基腈水解酶；此外，根據(jù)筆者對(duì)膠乳和葉片轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，其他5個(gè)基因的表達(dá)水平都很低，因此筆者認(rèn)為HbHNL-1基因可能是橡膠樹中起主要作用的羥基腈水解酶基因。于是重點(diǎn)研究了HbHNL-1的表達(dá)調(diào)控。

以橡膠樹品種7-33-97的嫩葉、成熟葉及膠乳為材料，都提取到總RNA（圖3-A）。用HbHNL-1基因特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，在嫩葉、成熟葉及膠乳中，都擴(kuò)增到1條長約1 000 bp的片段（圖3-B）。測序結(jié)果表明，3種來源的羥基腈水解酶基因的cDNA序列完全相同，長度為1 003 bp，包含完整的羥基腈水解酶編碼區(qū)，與已報(bào)道的橡膠樹羥基腈水解酶基因（U40402）有4個(gè)堿基差異，可能是由于基因來自不同的橡膠樹品種的緣故。HbHNL-1 cDNA序列的編碼區(qū)長771 bp與U40402有1個(gè)堿基差異，但是兩者編碼的蛋白序列完全相同。用MacVector12.6預(yù)測該基因編碼蛋白質(zhì)含257個(gè)氨基酸殘基，分子量為29.2 ku，等電點(diǎn)為 5.7。

2.4 HbHNL-1基因在幼嫩組織和初生膠乳中高效表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了HbHNL-1基因的組織表達(dá)特性。結(jié)果表明，HbHNL-1基因在初生膠乳中的表達(dá)量是次生膠乳的100多倍（圖4-A）。此外，幼嫩葉片和成熟葉片實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果也表明，HbHNL-1基因在幼嫩葉片中的表達(dá)量也大大高于成熟葉片，約為成熟葉片的8倍（圖4-B）。由于橡膠樹幼嫩組織一般更容易受到病害蟲的侵害，HbHNL-1基因在初生膠乳和幼嫩葉片中高效表達(dá)，可能與橡膠樹對(duì)病蟲害的精準(zhǔn)防御相關(guān)。 2.5 橡膠樹HbHNL-1基因啟動(dòng)子主要順式作用元件預(yù)測

將HbHNL-1基因與其長度為6 588 bp的基因組片段AJJZ010441696比對(duì)，發(fā)現(xiàn)HbHNL-1基因編碼區(qū)全長2 087 bp，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，所有內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)均符合真核生物“GT-AG”規(guī)則。3個(gè)外顯子序列與cDNA序列一致，從而也驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的HbHNL-1 cDNA序列的正確性。HbHNL-1基因翻譯起始密碼子ATG上游序列長度為3 607 bp。將上游長度為2 600 bp的序列提交PLACE服務(wù)器和Plant CARE服務(wù)器進(jìn)行分析。由于Plant CARE只能給出1 500 bp長度序列分析結(jié)果，因此，將2 600 bp啟動(dòng)子序列分為兩步分析，首先進(jìn)行+1～1 500 bp片段序列分析，然后，對(duì)1 500～2 600 bp片段進(jìn)行分析，最后，將兩者結(jié)果合并統(tǒng)計(jì)。分析結(jié)果表明，在-80～-86位置有一個(gè)TATA Box（TATAAAT），上游-262～-265位置發(fā)現(xiàn)CAAT Box，推測該區(qū)域可能構(gòu)成了HbHNL-1基因啟動(dòng)子的核心序列。除了含有高等植物啟動(dòng)子的保守元件TATA box和CAAT box外，HbHNL-1啟動(dòng)子序列還包含大量的光調(diào)控元件，如ACE、as-2-box、BoxⅠ、GATA-motif等。另外，HbHNL-1啟動(dòng)子序列中還有干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)，以及水楊酸響應(yīng)、生物節(jié)律控制、甲酯茉莉酸響應(yīng)、葉形態(tài)發(fā)育等順式調(diào)控元件（表1）。其中，除了茉莉酸和水楊酸響應(yīng)與病蟲抗性相關(guān)以外，其他順式調(diào)控元件似乎與生長發(fā)育等生物過程相關(guān)。因此，除了具有防御功能外，HbHNL-1基因可能還有其他生物功能。

3 討論

本研究通過數(shù)據(jù)庫搜索在橡膠樹基因組中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)HbHNL家族基因。其中1個(gè)HbHNL基因（本文命名為HbHNL-1）編碼完整的羥基腈水解酶，Hasslacher等[13]將該基因在酵母中表達(dá)，獲得了有活性的重組蛋白。其他5個(gè)HbHNL基因在數(shù)據(jù)庫中沒有完整編碼區(qū)?；蛑貜?fù)是基因家族擴(kuò)增的主要來源之一，而基因重復(fù)后往往產(chǎn)生部分重復(fù)基因的失活或者功能異化。因此，很難斷定橡膠樹的其他5個(gè)HbHNL基因是否都有羥基腈水解酶基因的功能。對(duì)橡膠樹葉片和膠乳轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果表明，只有HbHNL-1具有比較高的表達(dá)量，其他5個(gè)HbHNL基因表達(dá)量都非常低，甚至不表達(dá)，因此認(rèn)為HbHNL-1基因可能是橡膠樹葉片和膠乳中起主要作用的羥基腈水解酶基因。當(dāng)然，也不排除其他HbHNL基因在目前還沒有檢測的橡膠樹器官，比如花、果實(shí)以及根中表達(dá)。

從橡膠樹膠乳和葉片中克隆了HbHNL-1基因的全長cDNA序列。定量RT-PCR結(jié)果表明該基因在初生乳管和幼嫩葉片中上調(diào)表達(dá)，可能與幼嫩組織的防御相關(guān)。另外，HbHNL-1基因的啟動(dòng)子區(qū)還有大量的與光調(diào)控、干旱誘導(dǎo)、水楊酸和茉莉酸響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件（表1），說明HbHNL-1基因除具有防御功能外，可能還具有其他生物功能。

雖然同源性較高的基因可能執(zhí)行相似的生物學(xué)功能，但由于HNL基因家族成員的多樣性，HbHNL家族成員是否與同源性高的木薯等植物的HNL具有類似的生物功能，尚需得到遺傳轉(zhuǎn)化等研究的進(jìn)一步分析驗(yàn)證。橡膠樹所有的HbHNL蛋白與大戟科植物木薯和斑籽（Baliospermum montanum（Willd.）Muell. Arg.）的HNL聚為一類，與擬南芥（Arabidopsis thaliana，十字花科）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana，山柑科）、山崳菜（Eutrema salsugineum，十字花科）、亞麻芥（Camelina sativa，十字花科）等植物的HNL類蛋白質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。說明大戟科植物的HNL基因家族成員的擴(kuò)增發(fā)生在與十字花科、山柑科等植物的分化之后，推測大戟科植物可能通過增加HbHNL基因的數(shù)量來提高對(duì)病蟲的抗性。 全球有3 000多種植物利用生氰作用抵御病蟲侵害[6，10]。其中HNL家族蛋白在機(jī)械傷害、害蟲和病原菌的侵害以及環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用[8-10]。病蟲害是目前影響橡膠樹產(chǎn)量的主要因素之一。橡膠樹可以通過羥基腈水解酶催化羥基腈類化合物水解，釋放氫氰酸，從而抵御害蟲和病原菌的侵害[6]。HbHNL-1在初生膠乳和幼嫩葉片中的表達(dá)量大大高于次生膠乳和成熟葉片中的表達(dá)量，說明橡膠樹HbHNL-1主要參與幼嫩組織對(duì)病蟲的防御。

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