方 珉， 張 佩， 金愛萍， 劉學(xué)源

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200072)

?

·基礎(chǔ)研究·

AD中REST的空間分布對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與自噬的影響

方 珉， 張 佩， 金愛萍， 劉學(xué)源

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200072)

目的 探討Alzheimer病中抑制性因素1沉默作用轉(zhuǎn)錄因子(repressor element-1 silencing transcription, REST)的空間分布對(duì)神經(jīng)元的凋亡與自噬的影響。方法 C57小鼠側(cè)腦室注射Aβ25-35建造AD模型，以無菌生理鹽水為對(duì)照，用熒光共聚焦顯微鏡觀測(cè)REST蛋白在造模前后細(xì)胞內(nèi)的定位的變化，并采用Real-Time PCR和Western印跡法檢測(cè)小鼠神經(jīng)元中凋亡與自噬相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果 熒光共聚焦顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)AD狀態(tài)下REST基因入核受阻，Real-Time PCR和Western印跡法顯示促進(jìn)凋亡的BAX、CASP9表達(dá)增強(qiáng)，而抑制凋亡的BCL2基因表達(dá)下降。自噬標(biāo)志基因LC-3的表達(dá)水平也增強(qiáng)。結(jié)論 AD狀態(tài)下REST基因入核受阻，并引起凋亡與自噬相關(guān)基因的表達(dá)。

阿爾茨海默?。?抑制性因素1沉默作用轉(zhuǎn)錄因子； 細(xì)胞內(nèi)定位； 細(xì)胞凋亡； 自噬

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[1-2]，β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)在腦中的沉積是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[3-4]，然而，一些有著顯著AD解剖和分子特征的老人，在其一生中幾乎不表現(xiàn)出認(rèn)知衰退癥狀，而另一些有著同樣分子特征的老人卻在數(shù)十年甚至幾十年后形成AD。是否在腦內(nèi)存在某種細(xì)胞或成分能夠明顯減弱Aβ的毒性？最新研究顯示抑制性因素1沉默作用轉(zhuǎn)錄因子(repressor element -1 silencing transcription， REST)，可以有效的保護(hù)神經(jīng)元免于Aβ毒性損傷。REST是負(fù)調(diào)控的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞，它在細(xì)胞分化、神經(jīng)再生、神經(jīng)保護(hù)和認(rèn)知功能等多方面調(diào)節(jié)神經(jīng)功能[5-7]。有研究證實(shí)，在老年鼠中REST蛋白大量進(jìn)入細(xì)胞核，通過阻遏下游凋亡相關(guān)基因和自噬相關(guān)基因的啟動(dòng)，從而保護(hù)神經(jīng)元免于Aβ?lián)p傷，而在AD狀態(tài)下REST入核受阻[3,5-6]；正常老年人，輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment, MCI)患者和AD患者神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)REST含量依次遞減[6]。由此推斷，神經(jīng)元細(xì)胞中REST在細(xì)胞中的定位可能會(huì)影響其活性，REST的核定位與認(rèn)知功能的保持密切相關(guān)。本研究擬探討REST在AD中入核受阻后是否影響神經(jīng)元的凋亡與自噬。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及造模

取雄性C57小鼠，體質(zhì)量18～22g。將小鼠隨機(jī)分為AD組和正常對(duì)照組，每組10只。所有小鼠用3.5%的水合氯醛(10ml/kg)麻醉后，AD組小鼠經(jīng)側(cè)腦室一次性注入5μl凝聚態(tài)Aβ25-35(含Aβ25-355μg/ml，以無菌生理鹽水溶解，37℃ 120h使其成凝聚態(tài))，留針1min，建造AD模型[9]，對(duì)照組小鼠同側(cè)腦室給予等體積無菌生理鹽水。14d后采用Morris水迷宮試驗(yàn)[10]，記錄大鼠找到平臺(tái)所需逃避潛伏期，檢驗(yàn)造模是否成功。

1.2 TUNEL凋亡染色及半定量分析

選取海馬、額葉、頂葉同時(shí)存在矢狀斷面切片，按TUNEL凋亡染色試劑盒(武漢博士德公司)進(jìn)行TUNEL細(xì)胞凋亡染色。每只鼠腦染色2張切片，每一切片高倍視野(400×)下每部位取4個(gè)視野共計(jì)數(shù)100個(gè)神經(jīng)元，計(jì)算凋亡神經(jīng)元陽性百分率即神經(jīng)元凋亡指數(shù)(NAI)=凋亡細(xì)胞數(shù)(N)/總統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)(T)×100%。

1.3 REST免疫熒光染色

取上述腦組織進(jìn)行冰凍切片，8μm厚度切片，貼片在防脫玻片上，室溫放置30min，用1×PBS沖洗3次，每次3min。用2%的小牛血清(BSA)室溫封閉1h。加入REST抗體(1∶100稀釋)，4℃孵育過夜。用1×PBS沖洗3次，每次3min。用FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(IgG H&L，1∶500稀釋)，室溫避光孵育1h。用DAPI染色液染色3min。用1×PBS沖洗3次，每次3min，用甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。每只鼠腦染2張切片，每一染色片高倍視野(400×)下取3個(gè)視野，定位REST蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置。

1.4 Western印跡法

使用RIPA液提取小鼠左側(cè)海馬組織中蛋白，Western印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。采用以下方法配置勻漿液： Tris 0.158g，NaCl 0.18g，ddH2O 10ml，濃HCl調(diào)pH至7.4，加40μl 0.5mol/L高壓滅菌過的EDTA定容至20ml，4℃保存。使用前每100ml加1mg/ml的Leupeptin 100μl；protinin 100μl；200mmol/L PMSF 500μl；200mmol/L的NaF 500μl；200mmol/L的Na3VO4500μl。加入1ml RIPA液后，冰上勻漿腦組織。4℃離心，82000r/min，離心半徑10cm，離心20min留上清液，棄沉淀。轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中4℃離心，18000r/min，離心半徑10cm，離心45min，保存上清液。用BCA的方法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定(碧云天BCA檢測(cè)試劑盒)。各取50mg總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜(Pall公司，美國)。將膜在含5%脫脂奶粉的TBST(10mmol/L Tris-HCl，0.05%Tween-20 pH 7.5，150mmol/L NaCl)中室溫下封閉1h，隨后加入用一抗，Bax(1∶1 000)、Bcl2(1∶1 000)，Casp9(1∶1 000)及LC3(1∶1 000)室溫下?lián)u床上孵育3h，加入山羊抗兔IgG-HRP二抗，室溫孵育30min，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)(Santa Cruz)。用天能5200 ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行拍照和分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)照組、AD組逃避潛伏期分別為(24.5±19.6)、(50.8±26.1)s，Aβ注射后潛伏期明顯延長(P<0.01)，小鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損，提示造模成功，見圖1。

圖1 Morris水迷宮試驗(yàn)逃避潛伏期Fig.1 The escape latency of Morris water maze test

2.2 Aβ對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡的影響

TUNEL凋亡染色可見細(xì)胞核呈棕黃色的陽性凋亡細(xì)胞，對(duì)照組各腦區(qū)見個(gè)別散在凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率僅為(1.53±0.85)%，而AD組海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡顯著增加，細(xì)胞凋亡率上升到(15.74±4.75)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 Tunel檢測(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡Fig.2 Tunel detects the apoptosis of neuron in hippocampus regionA： 對(duì)照組；B： AD組

2.3 AD發(fā)生對(duì)腦內(nèi)REST表達(dá)水平及位置的影響

REST免疫熒光染色于海馬、額葉、頂葉、基底前腦均可見胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)有綠色的熒光信號(hào)，AD組可見細(xì)胞核中的REST信號(hào)顯著降低，而細(xì)胞漿中的表達(dá)變化并不明顯，見圖3。提示在AD中REST的入核受阻。

圖3 REST蛋白的表達(dá)與空間定位Fig.3 Expression and location of REST proteinA： 對(duì)照組；B：AD組；箭頭示REST信號(hào)

2.4 REST入核受阻后凋亡與自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western印跡法檢測(cè)兩組中凋亡相關(guān)蛋白BAX、BCL2、Casp9及自噬相關(guān)蛋白LC-3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，REST入核受阻后AD組促進(jìn)凋亡的BAX、Casp9表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，而抑制凋亡的BCL2蛋白表達(dá)下降(P<0.01)。自噬標(biāo)志LC-3蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)(P<0.01)，見圖4。

圖4 凋亡及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Expression of apoptosis and autophagy-related proteins

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠急性腦室內(nèi)注射Aβ25-35，14d后，小鼠水迷宮試驗(yàn)表現(xiàn)逃避潛伏期顯著延長，說明學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，提示造模成功[11-12]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，皮質(zhì)和海馬區(qū)的神經(jīng)元減少是AD的主要病理特征，而神經(jīng)細(xì)胞凋亡是AD神經(jīng)元丟失的主要原因[13]。有研究指出，Aβ的異常沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，Aβ對(duì)神經(jīng)元的毒性作用主要表現(xiàn)在破壞細(xì)胞膜的完整性，擾亂細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，誘發(fā)中樞免疫炎性反應(yīng)等方面[14]。Aβ沉積可能是導(dǎo)致神經(jīng)元變性和突觸丟失的重要原因。Zhao等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，Aβ沉積可能影響線粒體通透性，進(jìn)而引起神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。此外還有一些研究發(fā)現(xiàn)凋亡基因p53與AD患者的腦內(nèi)細(xì)胞凋亡活動(dòng)密切相關(guān)。在轉(zhuǎn)基因過表達(dá)Aβ的AD模型腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在Aβ沉積的同時(shí)，會(huì)伴有P53蛋白的廣泛表達(dá)[16]。Da Pozzo等[17]則發(fā)現(xiàn)抑制TP53可以有效降低Aβ對(duì)人SH-SY5Y細(xì)胞的影響[17]。本實(shí)驗(yàn)通過Tunel檢測(cè)造模與正常組中腦組織海馬神經(jīng)元的凋亡，結(jié)果顯示，AD組中海馬神經(jīng)元凋亡水平顯著高于正常對(duì)照組，這與其他人的研究相一致[15-17]。

在神經(jīng)元的發(fā)育機(jī)制中，REST對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄起著非常重要的負(fù)調(diào)控作用，可以調(diào)控多種神經(jīng)元相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，可以影響神經(jīng)元干細(xì)胞的分化，Lu等[8]在其研究中指出，REST這種蛋白質(zhì)在老化大腦中表達(dá)量顯著升高，REST的表達(dá)水平在患有輕度認(rèn)知功能障礙和AD患者的神經(jīng)元細(xì)胞中顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)REST的表達(dá)水平與認(rèn)知功能正相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)REST蛋白在AD時(shí)出現(xiàn)入核受阻的情況，進(jìn)一步用Western印跡法檢測(cè)了凋亡及自噬相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，在AD中REST入核受阻后，凋亡基因BAX及Casp9的表達(dá)顯著上調(diào)，而凋亡抑制基因BCL2的表達(dá)則顯著下降。這提示，Aβ誘導(dǎo)后會(huì)導(dǎo)致小鼠腦組織對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)起保護(hù)作用的REST基因活性下降(入核受阻)，進(jìn)而導(dǎo)致凋亡相關(guān)基因BAX及Casp9等的異?；罨?，而凋亡抑制基因BCL2則失活，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。這在TUNEL檢測(cè)中也得到了證實(shí)。另外，本研究還分析了自噬相關(guān)的LC3基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在AD模型中自噬基因LC3的表達(dá)顯著升高。Nixon等[18]通過電子顯微鏡觀察了PS1/APP轉(zhuǎn)基因AD小鼠的腦組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量的自噬小體，這也與本研究一致。另外Yu等[19]還發(fā)現(xiàn)自噬溶酶體中含有Aβ40和Aβ42及其前體APP、βCTF等，隨著自噬的增加，會(huì)加劇Aβ的積累[19]。提示REST入核受阻后，也可能會(huì)促進(jìn)自噬的產(chǎn)生，進(jìn)而進(jìn)一步加劇Aβ積累和其毒性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)REST蛋白在Aβ誘導(dǎo)的小鼠AD模型腦組織神經(jīng)元細(xì)胞中其入核受阻，并且可能影響了凋亡與自噬相關(guān)基因的表達(dá)改變。

[1] Malkki H. Alzheimer disease: Possible prion-like transmission of AD-like pathology in humans[J]. Nat Rev Neurol, 2015,11(11): 612.

[2] Birks JS, Chong LY, Grimley Evans J. Rivastigmine for Alzheimer’s disease[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2015,9: CD001191.

[3] Bukhari SN, Jantan I. Syntheticcurcumin analogs as inhibitors of β -amyloid peptide aggregation: potential therapeutic and diagnostic agents for Alzheimer’s disease[J]. Mini Rev Med Chem, 2015,15(13): 1110-1121.

[4] Jhoo JH, Kim HC, Nabeshima T, et al. Beta-Amyloid(1-42)-induced learning and memory deficits in mice: involvement of oxidative burdens in the hippocampus and cerebral cortex[J]. Behal Brain Res, 2004,155(2): 185-196.

[5] Dols-Icardo O, Vilaplana E, Sampedro F, et al. Effect of REST on brain metabolism in the Alzheimer disease continuum[J]. Ann Neurol, 2015,78(4): 661-662.

[6] Li K, Jiang Q, Xu A, et al. REST rs3796529 variant does not confer susceptibility to Alzheimer’s disease[J]. Ann Neurol, 2015,78(5): 835-836.

[7] Yankner BA. REST and Alzheimer disease[J]. Ann Neurol, 2015,78(3): 499.

[8] Lu T, Aron L, Zullo J, et al. REST and stress resistance in ageing and Alzheimer’s disease[J]. Nature, 2014,507(7493): 448-454.

[9] Guo CN, Sun L, Liu GL, et al. Protective effect of nicotine on the cultured rat basal forebrain neurons damaged by β-Amyloid (Aβ)25-35 protein cytotoxicity[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2015,19(16): 2964-2972.

[10] 先宇飛，屈嬋,吳哲,等.國產(chǎn)和加拿大產(chǎn)西洋參莖葉總皂苷的促智作用的比較[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,23(1): 43-47.

[11] Fernandez F, Garner CC. Object recognition memory is conserved in Ts1Cje, a mouse model of Down syndrome[J]. Neurosci Lett, 2007,421(2): 137-141.

[12] Orta-Salazar E, Aguilar-Vzquez A, Martínez-Coria H, et al. REST/NRSF-induced changes of ChAT protein expression in the neocortex and hippocampus of the 3x Tg-AD mouse model for Alzheimer’s disease[J]. Life Sci, 2014,116(2): 83-89.

[13] Vecchio F, Babiloni C, Lizio R, et al. Resting state cortical EEG rhythms in Alzheimer’s disease: toward EEG markers for clinical applications: a review[J]. Suppl Clin Neurophysiol, 2013,62: 223-236.

[14] Rosenberg RN. Translational research on the way to effective therapy for Alzheimer disease[J].Arch Gen Psychiatry, 2005,62(11): 1186-1192.

[15] Zhao LI, Wang JL, Wang YR,et al. Apigenin attenuates copper-mediated β-amyloid neurotoxicity through antioxidation, mitochondrion protection and MAPK signal inactivation in an AD cell model[J]. Brain Res, 2013,1492: 33-45.

[16] Calissano P, Matrone C, Amadoro G. Apoptosis and in vitro Alzheimer disease neuronal models[J].Commun Integr Biol, 2009,2(2): 163-169.

[17] Da Pozzo E, La Pietra V, Cosimelli B, et al. p53 functional inhibitors behaving like pifithrin-β counteract the Alzheimer peptide non-β-amyloid component effects in human SH-SY5Y cells[J].ACS Chem Neurosci, 2014,5(5): 390-399.

[18] Nixon RA, Wegiel J, Kumar A, et al. Extensive involvement of autophagy in Alzheimer disease: an immuno-electron microscopy study[J].J Neuropathol Exp Neurol, 2005,64(2): 113-122.

[19] Yu WH, Kumar A, Peterhoff C, et al. Autophagic vacuoles are enriched in amyloid precursor protein-secretase activities: implications for beta-amyloid peptide over-production and localization in Alzheimer’s disease[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004,36(12): 2531-2540.

Effect of REST spatial distribution on apoptosis and autophagy of neurons in mouse Alzheimer’s disease model

FANGMin，ZHANGPei，JINAi-ping，LIUXue-yuan

(Dept. of Neurology, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate the effect of repressor element-1 silencing transcription (REST) spatial distribution on apoptosis and autophagy of neurons in mouse Alzheimer’s disease (AD) model. Methods C57 mice were randomly divided into AD group and normal control group. Mouse AD model was established by injection of Aβ25-35through lateral cerebral ventricle. The location of REST protein in cell was monitored by confocal microscope. The mRNA and protein expressions associated with neuronal apoptosis and autophagy were tested by Real-Time PCR and Western blotting, respectively. Results REST factor was blocked into nuclear in AD mice. Compared with normal group, the expression of pro-apoptotic genes BAX and CASP9 were increased significantly, while the expression of apoptosis-inhibiting gene BCL2 was decreased significantly. Meanwhile expression of autophagy gene LC-3 was enhanced. Conclusion REST protein is blocked for nuclear transfer in Aβ- induced mouse AD model, which may induce the changes of apoptosis and autophagy-related gene expression.

Alzheimer’s disease； repressor element silencing transcription factor； intracellular localization； apoptosis； autophagy

10.16118/j.1008-0392.2016.02.002

2015-12-02

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)面上項(xiàng)目(201540063)

方 珉(1973—)，女，副主任醫(yī)師，博士.E-mail：fangmin_dr@126.com

R 749.16

A

1008-0392(2016)02-0005-05