王廣宇, 吳國亭

(1. 上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200060； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200072)

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·基礎(chǔ)研究·

Drak2在高糖誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡中的作用

王廣宇1, 吳國亭2

(1. 上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200060； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200072)

目的 探討Drak2在高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡中的作用。方法 不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)刺激，模擬體外胰島細(xì)胞糖毒性損傷后的細(xì)胞凋亡模型，通過CCK8檢測葡萄糖作用后細(xì)胞的存活率；Western印跡法檢測不同糖濃度時Drak2的表達(dá)情況，完成糖濃度的篩選。構(gòu)建Drak2-pcDNA3.0質(zhì)粒，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建Drak2過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞系，Western印跡法分析糖誘導(dǎo)前后胰島β細(xì)胞Drak2的表達(dá)。Real-Time PCR測定Drak2、Bax、Bcl-2的mRNA水平,流式細(xì)胞法測定誘導(dǎo)前后的凋亡情況。結(jié)果 CCK8結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)液中糖濃度上升，Rinm 5mf凋亡逐漸增加，隨著時間的增加(24、48、72h)凋亡也逐漸增加，呈一定的量效關(guān)系。Western印跡法顯示在糖濃度22.2mmol/L培養(yǎng)72h時，Drak2的表達(dá)量最多。構(gòu)建Drak2過表達(dá),在轉(zhuǎn)染6h后開始葡萄糖誘導(dǎo)，在高糖誘導(dǎo)72h時過表達(dá)組Drak2蛋白是正常組的6倍。Real-Time PCR顯示，過表達(dá)組Drak 2 mRNA在葡萄糖誘導(dǎo)前開始增加，在高糖誘導(dǎo)72h時增高明顯(P<0.05)，凋亡相關(guān)基因BAX、Bcl-2表達(dá)均有增加(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測顯示高糖誘導(dǎo)后，過表達(dá)組凋亡率明顯高于正常組(P<0.05)。結(jié)論 Drak 2過表達(dá)促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。

Drak2； 葡萄糖； β細(xì)胞； 凋亡

無論1型糖尿病還是2型糖尿病，診斷時β細(xì)胞已喪失50%～80%，β細(xì)胞數(shù)量減少與細(xì)胞凋亡有關(guān)，糖尿病時胰島β細(xì)胞凋亡加速[1-2]，在糖尿病的早期由于胰島素抵抗導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能增強(qiáng)，胰島細(xì)胞的負(fù)荷加重；隨著病情的進(jìn)展，胰島β細(xì)胞的功能逐漸衰竭，主要表現(xiàn)為細(xì)胞功能降低和細(xì)胞數(shù)目減少，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)高糖、高脂和某些細(xì)胞炎性介質(zhì)如TNF-α等是誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能衰竭的重要因素。DAP凋亡誘導(dǎo)激酶2(Drak2)是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族，有研究發(fā)現(xiàn)Drak2在T細(xì)胞凋亡中起著相當(dāng)重要的作用[3-4]，而T細(xì)胞與其他細(xì)胞的凋亡，如胰島β細(xì)胞凋亡等有很大的共性。本研究旨在探討Drak2在高糖誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Rin m5f細(xì)胞株購自美國ATCC公司,DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI公司，限制性內(nèi)切酶(EcoRI、BamHI)、CIAP、T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司，TOP10感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自中國天根生化公司，SYBR GREEN購自美國ABI公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

選用Rin m5f細(xì)胞株，采用DMEM高糖培養(yǎng)基，添加15%胎牛血清，1%Hepes緩沖液及1%青鏈雙抗，于37℃含5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

過表達(dá)質(zhì)粒采取PC-DNA3.0載體，細(xì)胞提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后，針對DRAK2全長序列設(shè)計(jì)PCR引物并加入BamHI及EcoRI酶切位點(diǎn)，PCR取得DRAK2基因并測序正確后，對載體及PCR產(chǎn)物雙酶切4h，去磷酸化0.5h，純化后連接過夜取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂LB培養(yǎng)板(含AMP抗性培養(yǎng)基)培養(yǎng)過夜，挑單克隆菌落，170r/min搖菌12h，抽提質(zhì)粒，測序正確后備用。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選擇對數(shù)生長期細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1d，在不包含抗生素的培養(yǎng)基中接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的匯合度要達(dá)到30%～50%。對每孔細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒至250μl，溫和混勻，室溫靜置5min；用無血清培養(yǎng)基稀釋脂質(zhì)體至250μl，溫和混勻室溫靜置5min；將質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合(總體積 500μl)，室溫孵育 20min；將 500μl 脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物加入Rin-m5f細(xì)胞，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻；CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6h，棄去無血清培養(yǎng)基，換成2ml完全培養(yǎng)基。

1.5 糖毒性篩選試驗(yàn)

指數(shù)生長期的細(xì)胞收集計(jì)數(shù)后，(3～4)×105/ml接種96孔板，使其葡萄糖終濃度分別為： 0、5.5、11.1、22.2、33.3、44.4和 55.5mmol/L。分別培養(yǎng)1、2、3d，用于細(xì)胞增殖能力檢測。各孔均設(shè)3各復(fù)孔。Western印跡法檢測初篩的不同葡萄糖濃度作用不同時間時Drak2蛋白的表達(dá)情況，選擇一個最適的培養(yǎng)時間和濃度。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)

上述Rin-m5f細(xì)胞經(jīng)不同葡萄糖作用后及后續(xù)轉(zhuǎn)染后，每孔加入10μl的CCK8溶液，37℃孵育4h；使用酶標(biāo)儀450nm波長測定各孔的吸光度值(D450)，計(jì)算出3個平行孔的均值。計(jì)算細(xì)胞存活率： 以不加糖的空白對照，即濃度為0孔的D450為對照，細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組D450/對照組D450×100%。

1.7 Real-Time PCR檢測Drak2、Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)

6孔板細(xì)胞抽提RNA并反轉(zhuǎn)錄后，使用ABI Prism 7900HT型熒光定量PCR儀，通過SYBR GREEN法測Drak2、Bcl-2、Bax基因mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，10μl反應(yīng)體系，OPN引物序列上游5′-TCTGATGAGACCGTCACTGC-3′，下游5′-ACGGAGTCTGATAGAGTAGG-3′。反應(yīng)條件如下： 95℃ 5min預(yù)變性，95℃ 15s，65℃ 35s，共40個循環(huán)。

1.8 Western 印跡法檢測Drak2蛋白的表達(dá)

提取總蛋白后，蛋白定量采用BCA蛋白定量法，進(jìn)行蛋白變性(20μl，5×SDS-PAGE loading buffer，10μl mol/L DTT，70μl 樣品，100℃沸水5min)，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，封閉與抗體雜交，顯影、定影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。組間差異采用方差分析，各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高糖對Rin-m5f細(xì)胞存活的影響

不同濃度的葡萄糖(0、5.5、11.1、22.2、33.3、44.4、55.5mmol/L)作用于Rin-m5f細(xì)胞(24、48、72h)，隨著葡萄糖濃度的增加，Rin-m5f的存活率下降，提示葡萄糖可抑制Rin-m5f細(xì)胞的生長，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，且同一作用時間各濃度的細(xì)胞存活率與對照組(葡糖糖濃度為0mmol/L)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 Drak2蛋白在不同糖濃度、不同時間作用下的表達(dá)情況

CCK8結(jié)果顯示，Drak2蛋白表達(dá)在11.1mmol/L、22.2mmol/L、33.3mmol/L差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Rin-m5f細(xì)胞分別在三者濃度作用下培養(yǎng)24、48、72h，結(jié)果顯示Rin-m5f細(xì)胞在糖濃度為22.2mmol/L、培養(yǎng)72h時，Drak2蛋白表達(dá)量最大,見圖1。后續(xù)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)都是以此為標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 不同糖濃度作用不同時間Drak2蛋白的表達(dá)Fig.1 Expressions of Drak2 protein in different glucose concentration and different timeA: 11.1mol/L葡萄糖培養(yǎng)24h;B: 11.1mol/L葡萄糖培養(yǎng)48h;C: 33.3mol/L葡萄糖培養(yǎng)24h;D: 22.2mol/L葡萄糖培養(yǎng)24h;E: 22.2mol/L葡萄糖培養(yǎng)48h;F: 33.3mol/L葡萄糖培養(yǎng)48h；G: 11.1mol/L葡萄糖培養(yǎng)72h;H: 22.2mol/L葡萄糖培養(yǎng)72h;I: 33.3mol/L葡萄糖培養(yǎng)72h

2.3 轉(zhuǎn)染中脂質(zhì)體濃度、質(zhì)粒濃度的篩選

轉(zhuǎn)染時分別將質(zhì)粒4、6、8、10μl稀釋至250μl，脂質(zhì)體分別由4、6、8、10μl稀釋至250μl，6h后更換完全培養(yǎng)基，24h后評價(jià)轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒和脂質(zhì)體都為6μl時轉(zhuǎn)染效率最高，而在兩者濃度為10μl 時細(xì)胞存活率非常低，可能是由于脂質(zhì)體濃度高，對細(xì)胞的毒性所致，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后攝片

2.4 Real-Time PCR檢測Drak2、Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)

Rin-m5f細(xì)胞正常組、陰性對照組、過表達(dá)組、陽性對照組葡萄糖誘導(dǎo)前后Real-Time PCR檢測Drak2、Bax、Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)，計(jì)算過表達(dá)組與對照組的擴(kuò)增倍數(shù)，Real-Time PCR結(jié)果顯示，Drak2 mRNA在葡萄糖誘導(dǎo)前過表達(dá)組就開始增加，在高糖誘導(dǎo)72h時，增高明顯(P<0.05)，凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2表達(dá)均有增加(P<0.05)，見表1。

表1 葡萄糖誘導(dǎo)前后不同組Dark2、Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)

與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.5 各組Drak2蛋白的表達(dá)情況

在轉(zhuǎn)染6h后開始葡萄糖誘導(dǎo)。Western印跡法顯示，各組(正常組、陰性對照組、過表達(dá)組、陽性對照組)在誘導(dǎo)前，Drak2蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3；在高糖誘導(dǎo)72h，過表達(dá)組Drak2蛋白是正常組的6倍，見圖4。

圖3 誘導(dǎo)前各組Drak2蛋白表達(dá)情況Fig.3 Drak2 protein expression in different groups before glucose induction

2.6 各組細(xì)胞早期凋亡率

流式細(xì)胞儀檢測顯示在22.2mmol/L葡萄糖作用下，各組細(xì)胞凋亡均增加，說明高糖可以誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡；但是各組在同樣濃度葡萄糖(22.2mmo/L)作用相同的時間下(72h)，各組凋亡增加情況不同，正常組高糖誘導(dǎo)后，凋亡增加43%[(3.5±0.1)%vs. (5.0±0.1)%]，過表達(dá)組凋亡增加440%[(2.9±0.3)%vs. (15.9±0.4)%]，與正常組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 誘導(dǎo)后各組Drak2蛋白表達(dá)情況Fig.4 Drak2 protein expression in different groups after glucose induction

3 討 論

目前,全球糖尿病患者數(shù)已超過3億,中國接近1億[5]。無論1型還是2型糖尿病，都存在β細(xì)胞凋亡，而Drak2基因位點(diǎn)2q32.3,靠近糖尿病基因致病位點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)Drak2在T細(xì)胞凋亡中起重要作用，近年來，它成為很多疾病包括自身免疫性疾病的新靶點(diǎn)[6]，那么Drak2是否對高糖環(huán)境誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡也有影響呢?是否能成為糖尿病的新靶點(diǎn)呢?

胰島β細(xì)胞功能障礙及胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的基本環(huán)節(jié)，當(dāng)β細(xì)胞不能適應(yīng)環(huán)境變化分泌適量的胰島素時，血糖就會升高，若不及時控制，高血糖最終會導(dǎo)致一系列的惡性循環(huán)，即“葡萄糖毒性”，引起胰島β細(xì)胞凋亡。本研究也證實(shí)了在高糖條件下，胰島β細(xì)胞凋亡率會增加。Rin-m5f細(xì)胞正常組在22.2mmol/L的葡萄糖作用72h時，細(xì)胞凋亡率由3.5%增加到5%，而且隨著糖濃度的升高，其細(xì)胞存活率在逐漸下降，如CCK8結(jié)果所示。但是高糖引起胰島β細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制至今尚未完全闡明，目前主要認(rèn)為高濃度的葡萄糖通過干擾β細(xì)胞線粒體內(nèi)糖代謝、使β細(xì)胞膜表面潛在的自身抗原表達(dá)增加、改變Bcl蛋白家族之間的平衡等來調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞凋亡水平。雖然機(jī)制并不明確，但是可以確定高糖的毒性，因此，應(yīng)及早對糖尿病患者進(jìn)行干預(yù)治療，積極控制高血糖，這對保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，延長β細(xì)胞功能衰竭是至關(guān)重要的。

本研究證實(shí)了Drak2過表達(dá)促進(jìn)了高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的凋亡，在過表達(dá)模型組中，誘導(dǎo)后是誘導(dǎo)前的540%。而正常組，誘導(dǎo)后是誘導(dǎo)前的144%倍，過表達(dá)組凋亡增加的倍數(shù)接近正常組的400%，可見過表達(dá)Drak2可增加高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的凋亡。這與動物研究結(jié)果相似。Drak2到底都通過何種途徑和信號通路引起胰島β凋亡，是接下來需要做的工作，探討其機(jī)制，為糖尿病的防治提供新的思路。

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Effects of Drak2 on apoptosis of pancreatic beta cells induced by high glucose

WANGGuang-yu1,WUGuo-ting2

(1. Dept. of Endocrinology, People’s Hospital of Putuo District, Shanghai 200060, China; 2. Dept. of Endocrinology, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate the effect of Drak2 on apoptosis of pancreatic betacells induced by high glucose. Methods Murine Rin-m5f pancreatic β-cells were culturedinvitroand the cell apoptosis model was established by high glucose. Cell viability was detected by CCK8 method. The expression of Drak2 was analyzed by Western blotting. Drak2-pcDNA3.0 was transfected in Rin-m5f cells to establish stable Drak2-overexpressing cells. The expression of Drak2 induced by glucose in the both cell lines was confirmed by immunofluorescence staining. Drak2 mRNA, Bax mRNA, Bcl-2 mRNA were quantitated by Real-Time PCR. The apoptosis was deterrmined by flow cytometry. Results The viability of Rin-m5f cells was significantly reduced in a dose-dependent manner after exposure to glucose at the range of 0-55.5 mmol/L for 24, 48 and 72 h; the expression of Drak2 was the highest when cells were cultured with glucose at 22.2 mmol/L for 72h. With glucose, the expression of Drak2 in over-expression cells was six times of the control cells as measured by Western blotting. Drak2 mRNA was increased before induction, which was highly significant after 72 h in over-expression group(P<0.05). From flow cytometric assay, the percent of apoptosis in over-expression group was highly significant, compared to the control group (P<0.05).Conclusion Drak2 overexpression results in increased β-cell apoptosis induced by glucose stimulation.

Drak2； glucose； β cell； apoptosis

10.16118/j.1008-0392.2016.02.005

2015-11-29

上海市科委科技攻關(guān)重大項(xiàng)目(04DZ19507)

王廣宇(1985—)，女，住院醫(yī)師，碩士研究生.E-mail: wo198501@163.com

吳國亭.E-mail: WGT1212@hotmail.com

R 589.1

A

1008-0392(2016)02-0019-05