楊富茗　何珺　馬海霞　吳兆喜

摘要[目的]研究魚膽草中獐牙菜苦苷超聲提取工藝參數(shù)。[方法]以魚膽草中的獐牙菜苦苷提取率為考察指標(biāo)，先對乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比和提取溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后用L16（43）正交設(shè)計(jì)對提取溫度、料液比、乙醇濃度進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。[結(jié)果]魚膽草中獐牙菜苦苷最佳提取工藝為料液比1∶10、提取溫度60 ℃、乙醇濃度10%、提取時(shí)間10 min，獐牙菜苦苷提取率達(dá)88%。[結(jié)論]此工藝簡單可行、重復(fù)性好，為魚膽草的綜合開發(fā)、利用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 魚膽草；獐牙菜苦苷；超聲提??；工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2016）05-139-03

Abstract[Objective]To optimize the technological parameters of ultrasonic extraction of swertiamarine from Swertia davidii.[Method]With extraction rate of swertiamarine as the index， single factor test was carried out， including ethanol concentration， extraction time， solidliquid ratio and extraction temperature. Then， L16 （43） orthogonal design was conducted to select the extraction temperature， solidliquid ratio and extraction temperature.[Result]The optimal extraction technology of swertiamarine from S. davidii was as follows： 1∶10 solidliquid ratio， 60 ℃ extraction temperature， 10% ethanol concentration， and 10 min extraction time. Under these conditions， the extraction rate of swertiamarine was 88%.[Conclusion]This technology is simple， feasible and repeatable， and provides theoretical foundation for the comprehensive development and utilization of S. davidii.

Key words Swertia davidii ； Swertiamarine ； Ultrasonic extraction； Technological optimization

魚膽草（Swertia davidii）學(xué)名稱川東獐牙菜，為土家族民間常用的一種民族藥，民間常稱之為青魚膽草、水黃連、水靈芝等，是龍膽科獐牙菜屬植物川東獐牙菜的全草，具有清熱解毒作用，民間常用于清肺熱、活黃疽、惡瘡疥癬、急性腸炎、菌痢等癥[1]。獐牙菜苦苷（swertiamarine）是魚膽草中主要的有效成分之一，白色片狀結(jié)晶，味苦，在空氣中略有吸濕性，熔點(diǎn)113～114 ℃，易溶于甲醇、乙醇，不溶于氯仿、石油醚，具有預(yù)防缺氧引起的大鼠肝損傷[2]、改善糖尿病性腎病變狀況、抗高血脂、抑制微生物及腫瘤細(xì)胞等作用[3-5]。目前魚膽草的文獻(xiàn)報(bào)道逐漸增多，主要集中在其酚類物質(zhì)、苷類物質(zhì)和酸類物質(zhì)的研究[6-8]，但針對獐牙菜苦苷的提取研究較少[9]。該研究對超聲提取魚膽草中獐牙菜苦苷方法進(jìn)行考察，采用單因素試驗(yàn)分析乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間對獐牙菜苦苷提取效率的影響，并采用正交試驗(yàn)方法優(yōu)化參數(shù)，確定其最佳提取工藝，以期為獐牙菜苦苷的提取技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHBⅢ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DV215CD分析電子天平（美國奧豪斯）；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GZX9140 MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅事業(yè)有限公司）；HH·Sy21Ni6電熱恒溫水浴鍋（北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）。

1.2 試材

魚膽草于2014年由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院任明見教授鑒定并提供。提取原料為魚膽草全草40 ℃烘24 h，進(jìn)行粉碎過80目篩制成；獐牙菜苦苷對照品購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司（批號(hào)E0334，純度≥98.7%）；甲醇為色譜純；乙醇為分析純。

1.3 方法

1.3.1

色譜分析條件。色譜柱為Hypersil C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為溶于甲醇∶雙蒸水（30∶70）；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm[10]；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 獐牙菜苦苷對照品溶液的制備、樣品的處理方法。

1.3.2.1 對照品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取獐牙菜苦苷4.3 mg于100 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解并定容，微濾備用。

1.3.2.2 樣品處理。取液體樣液用超純水稀釋100倍，微濾后按“1.3.1”色譜條件進(jìn)行HPLC檢測。

1.3.3 方法學(xué)考察。

1.3.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。分別精密吸取對照品和甲醇提取液各20 μL，在“1.3.1”色譜條件下，注入液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.3.3.2 線性關(guān)系考察。精密吸取對照品備用液，分別加流動(dòng)相稀釋成0.491 20、0.245 60、0.122 80、0.030 70、0.015 35 mg/mL得到獐牙菜苦苷對照品的系列濃度溶液。按“1.3.1”色譜條件，進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.3.3.3

精密度試驗(yàn)。精密吸取同一供試品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積積分值，計(jì)算RSD值，要求小于3%。

1.3.3.4

穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別精密吸取同一供試品溶液20 μL，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定其峰面積積分值并計(jì)算其RSD值。

1.3.3.5

加樣回收試驗(yàn)。精密稱取已知含量的同批樣品（含量為715.24 mg/g）約0.01 g，共6 份，置容量瓶中，分別精密加入獐牙菜苦苷對照品（0.43 mg/mL）80 mL，然后按“1.3.3.2”含量測定方法制備供試品溶液，并測定含量，計(jì)算回收率和RSD值。

1.3.4

樣品的含量測定。平行3份稱取魚膽草1.0 g于100 mL容量瓶中，加入甲醇80 mL在50 ℃超聲30 min，取出冷卻，定容至100 mL[11]，測定獐牙菜苦苷的含量。

1.3.5 單因素試驗(yàn)。

1.3.5.1 乙醇濃度的選擇。魚膽草中的獐牙菜苦苷有效成分極性較大，故用不同比例的水和乙醇的混合液配置不同的極性提取。取魚膽草5 g，平行4份，30 ℃條件下分別加10%、30%、60%、90%乙醇各40 mL，超聲30 min，分別測定獐牙菜苦苷的含量。

1.3.5.2 提取時(shí)間的選擇。取魚膽草5 g，平行4份，30 ℃條件下分別加入30%乙醇各40 mL，提取10、20、30、60 min，分別測定獐牙菜苦苷的含量。

1.3.5.3 料液比的選擇。取魚膽草5 g，平行4份，30 ℃條件下分別加溶劑量為藥材的4、6、8、10倍量30%乙醇40 mL，提取時(shí)間為10 min，分別測定獐牙菜苦苷的含量。

1.3.5.4 提取溫度的選擇。取魚膽草5 g，平行4份，提取溫度分別為20、30、50、60 ℃，溶劑為30%乙醇40 mL，提取時(shí)間為10 min，分別測定獐牙菜苦苷的含量。

1.3.6 正交試驗(yàn)。采用正交試驗(yàn)法對魚膽草藥材的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)選。選擇乙醇濃度、料液比、提取溫度作為考察因素，以魚膽草中獐牙菜苦苷的提取率為評價(jià)指標(biāo)，采用L16（43）正交表安排試驗(yàn)（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。圖1表明，在“1.3.3.1”條件下雜峰干擾小、分離效果佳且檢測時(shí)間短，便于檢測。

2.1.2

線性關(guān)系考察。按“1.3.3.2”方法操作，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)得線性回歸方程為y=1.630×104x+89.681（r=0.999 7），表明獐牙菜苦苷在0.013 5～0.491 2 mg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.3

精密度試驗(yàn)。按“1.3.3.3”方法操作，計(jì)算得出峰面積積分值的RSD為0.43%（n=6）。表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.1.4

穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.3.3.4”方法操作，計(jì)算得出峰面積積分值的RSD為1.30%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)峰面積分值基本穩(wěn)定。

2.1.5

加樣回收試驗(yàn)。按“1.3.3.5”方法操作，計(jì)算得出平均回收率為98.5%，RSD 為0.95%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于魚膽草中獐牙菜苦苷的含量測定。

2.2 含量的測定

由表2可知，魚膽草中獐牙菜苦苷的含量平均為3.02%。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇濃度的選擇。由圖2可見，隨著濃度的增大，魚膽草中獐牙菜苦苷的提取率先增加后降低，在乙醇濃度為30%時(shí)獐牙菜苦苷的提取率最高，故選取最佳乙醇濃度為30%。

2.3.2

提取時(shí)間的選擇。由圖3可見，在提取時(shí)間為10～60 min時(shí)，魚膽草中獐牙菜苦苷的提取率變化不大，說明提取時(shí)間對提取率的影響不大，綜合考慮能耗因素，故確定提取時(shí)間為10 min。

2.3.3

料液比的選擇。從圖4可以看出，隨著料液比增大，魚膽草中獐牙菜苦苷的提取率不斷增大，到1∶8時(shí)提取率不再顯著增加。考慮提取獐牙菜苦苷的同時(shí)節(jié)省提取液，故選擇料液比為1∶8。

2.3.4

提取溫度的選擇。由圖5可知，在提取溫度為50 ℃時(shí)，魚膽草中獐牙菜苦苷的提取率最高，故選取50 ℃為提取溫度。

2.4 正交試驗(yàn)

從表3可以看出，料液比的極差較大，說明料液比的變化對魚膽草中獐牙菜苦苷提取率的影響較大，其次是提取溫度和乙醇濃度，各因素對提取率影響的大小順序?yàn)榱弦罕龋˙）>提取溫度（C）>乙醇濃度（A）。由方差分析得出，A、C因素均無顯著影響，故可任取一個(gè)水平，考慮正交試驗(yàn)結(jié)果中均值數(shù)據(jù)兼顧能耗，取A1、C4為佳；B因素對提取率有顯著影響，取B4為佳。綜上所述，可確定魚膽草中獐牙菜苦苷超聲波提取工藝的最優(yōu)條件為A1B4C4，即提取時(shí)加入乙醇濃度為10%、料液比1∶10、提取溫度60 ℃。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

取魚膽草5 g，共3份，按選定的最佳提取方案A1B4C4安排驗(yàn)證試驗(yàn)，分別測定魚膽草中獐牙菜苦苷的提取率。結(jié)果顯示（表4），獐牙菜苦苷提取率達(dá)88%，且具有較好的重現(xiàn)性，表明此工藝條件穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

該研究采用單因素試驗(yàn)分析乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間對魚膽草中獐牙菜苦苷提取率的影響，并采用正交試驗(yàn)方法優(yōu)化參數(shù)，確定其最佳提取工藝。結(jié)果表明，在提取溫度為60 ℃、料液比為1∶10的情況下，用10%乙醇

超聲提取10 min，魚膽草中獐牙菜苦苷提取率達(dá)88%；其中料液比對提取率具有顯著影響。超聲波法提取魚膽草中獐牙菜苦苷有效成分具有省時(shí)、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，為魚膽草的綜合開發(fā)、利用奠定了理論依據(jù)。

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