張帆 司文騰 白玉 鄒士平

【摘 要】目的：研究柚皮苷對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)作用，以及對(duì)干細(xì)胞成骨分化的影響。方法：體外分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增HUCMSC，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HUCMSC表面特異標(biāo)志物。取第3代細(xì)胞，設(shè)立2組，對(duì)照組加入地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸，柚皮苷組加入地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸、柚皮苷。觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行堿性磷酸酶活性測(cè)定、鈣沉積半定量分析。結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中增殖培育的細(xì)胞表面白表達(dá)CD29、CD44，不表達(dá)CD34、CD45，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)中培育增殖的細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。柚皮苷組比對(duì)照組細(xì)胞液中堿性磷酸酶活性高。柚皮苷組細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；茜素紅染色半定量分析見(jiàn)柚皮苷組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：HUCMSC可以在體外采用組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)成功，柚皮苷對(duì)HUCMSC成骨分化有促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；柚皮苷；成骨分化；促進(jìn)作用

【ABSTRACT】 Objective：To study the biological effect of naringin on human umbilical cord mesenchymal stem cell（HUCMSC）and its differentiation into osteoblasts.Methods：HUCMSC was isolated，cultured and amplified in vitro，and the surface specific markers of it were detected by flow cytometry technique.Cells of the third generation were taken to establish two groups：a naringin group and a control group，adding dexamethasone，ascorbic acid，β-glycerophosphate to the control group，adding dexamethasone，ascorbic acid，β-glycerol phosphate and naringin to the naringin group，observing the cell morphology，determining the alkaline phosphatase activity and quantitatively analyzing of calcium deposition.Results：The expression of CD29，CD44 and non-expression of CD34 and CD45 showed that the proliferation of HUCMSC was confirmed in the experiment.The activity of alkaline phosphatase was higher in the naringin group than that of the control group.The difference of the content of alkaline phosphatase between the two groups was statistically significant（P < 0.05）.Alizarin red staining and semi quantitative analysis showed that there was a statistical significance between the two groups （P < 0.05）.Conclusion：HUCMSC can be successfully cultured in vitro by tissue adherent culture and naringin can promote the differentiation of HUCMSC into osteoblasts.

【Keywords】 human umbilical cord mesenchymal stem cells；naringin；osteogenic differentiation；

promoting effect

關(guān)節(jié)置換手術(shù)中，處理骨缺損一直是個(gè)難題，阻擋了關(guān)節(jié)外科的發(fā)展。對(duì)于髖膝關(guān)節(jié)置換中出現(xiàn)的骨缺損的處理，由同種異體骨、自體骨移植發(fā)展到3D打印骨缺損來(lái)修補(bǔ)[1]。但是由于只有支撐骨架缺少成骨干細(xì)胞這個(gè)種子，所以植骨效果差，易發(fā)生骨移植失敗。本研究出發(fā)點(diǎn)是從各種中藥提取物中尋找一種能夠刺激細(xì)胞成骨分化的成分，從而找到能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分化的物質(zhì)，解決骨缺損問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)從2014年6月至2015年12月分別用柚皮苷和傳統(tǒng)骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUCMSC），對(duì)比研究柚皮苷是否具有促進(jìn)HUCMSC成骨分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料 38～41周健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)后切除2 h內(nèi)的臍帶，低糖復(fù)合氨基酸葡萄糖培養(yǎng)基（DMEM，Gibco公司），胎牛血清（FBS，Gibco公司），胰蛋白酶（Sigma公司），抗壞血酸（Sigma公司），β-甘油磷酸（Sigma公司），地塞米松（Sigma公司），柚皮苷（天津天一生物制藥公司），BCM-100型超凈工作臺(tái)、茜素紅（ARS，上海源葉生物公司），ALP檢測(cè)試劑盒（BD公司），CD29、CD44、CD34、CD45單克隆抗體（BD公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Gibco公司），培養(yǎng)板（Gibco公司），硫化銨（天津化工），倒置相差顯微鏡等（理光），流式細(xì)胞儀（BD公司）。

1.2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備 剖腹產(chǎn)后從手術(shù)臺(tái)上取下臍帶并浸入制備的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）之中，用外科剪去除臍帶的外膜和臍帶中的動(dòng)靜脈，將剩余的華爾通膠[2]用PBS溶液沖洗2次后，使用組織剪分成1～2 mm3大小的組織塊[3]，

準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的量以超過(guò)組織塊厚度2 mm為準(zhǔn)，放入無(wú)菌培養(yǎng)箱中，恒溫37 ℃、CO2飽和度為5%。每3天更換培養(yǎng)液，更換培養(yǎng)液的同時(shí)在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞融合情況，當(dāng)達(dá)到70%以上后去除組織塊。繼續(xù)每3天換培養(yǎng)液，顯微鏡下觀(guān)察到細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，準(zhǔn)備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%的胰蛋白酶使細(xì)胞懸浮。在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞90%懸浮后，按照1∶2分瓶培養(yǎng)并傳代。擴(kuò)增細(xì)胞以備后期細(xì)胞分組培養(yǎng)。

1.3 形態(tài)學(xué)及特異抗原檢測(cè) 細(xì)胞光鏡下檢查：可見(jiàn)細(xì)胞呈旋渦狀，螺旋狀增殖排列。細(xì)胞表型采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)[4]，對(duì)第3代細(xì)胞表面特異抗原檢測(cè)，將2.5 g·L-1胰蛋白酶消化待檢細(xì)胞PBS洗滌3次，制成細(xì)胞懸濁液，待檢驗(yàn)細(xì)胞每管

0.1 mL加入第一抗體；4 ℃冰育30 min后，PBS清洗，加入熒光標(biāo)記第二抗體；4 ℃冰育30 min，流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)CD29、CD44、CD34、CD45。

1.4 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分組培養(yǎng) HUCMSC增殖并繁育3代以后，蓋玻片放入培養(yǎng)瓶中讓細(xì)胞爬片，待蓋玻片上爬滿(mǎn)細(xì)胞后，采用隨機(jī)余數(shù)分組法將其分為2組。對(duì)照組加入地塞米松（10-8 mol·L-1）、抗壞血酸（50 μg·mL-1）、β-甘油磷酸（10 mmol·L-1）；柚皮苷組加入地塞米松（10-8 mol·L-1）、抗壞血酸（50μg·mL-1）、β-甘油磷酸（10 mmol·L-1）、柚皮苷（20 ng·mL-1）誘導(dǎo)。

1.5 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后鑒定

1.5.1 光鏡下觀(guān)察 對(duì)照組：可見(jiàn)大量臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向心旋渦狀排列。柚皮苷組：干細(xì)胞由漩渦狀向多邊形、立方形細(xì)胞發(fā)展。

1.5.2 鈣沉積的鑒定 柚皮苷組誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d后，進(jìn)行ARS染色。染色方法為2組細(xì)胞PBS沖洗2遍后，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定10 min，蒸餾水沖洗2次，然后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的ARS（pH = 8.8）保持恒溫37 ℃染色5 min，胞漿內(nèi)鈣化顆?？梢员籄RS染色成為棕紅色或橘黃色[5]。

1.5.3 細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè) 2組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，開(kāi)始測(cè)定ALP值，每次間隔24 h，共4次，每次裂解培養(yǎng)板內(nèi)8個(gè)孔內(nèi)增殖的細(xì)胞。步驟：吸走培養(yǎng)基，用PBS洗3次，每孔加200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的細(xì)胞裂解液（覆蓋孔底即可），反復(fù)凍溶3次，12 h以上。中間可震動(dòng)培養(yǎng)板。2000 r·min-1離心10 min，進(jìn)行裂解使胞漿內(nèi)的ALP釋放出來(lái)，ALP試劑盒測(cè)定裂解液。顏色的深淺和ALP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品ALP濃度，通過(guò)OD值可以換算出ALP含量[6]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 9.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HUCMSC的形態(tài)特點(diǎn)及鑒定 通過(guò)華爾通膠放入培養(yǎng)瓶后，恒溫箱靜置培養(yǎng)3 d，就可見(jiàn)少量細(xì)胞游出。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，可見(jiàn)細(xì)胞由單一散在分布，逐步匯集成為放射狀生長(zhǎng)，形態(tài)統(tǒng)一，貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)15 d后傳代，免疫組化結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）特異性標(biāo)志CD29、CD44，不表達(dá)CD34、CD45。見(jiàn)圖1。

2.2 HUCMSC誘導(dǎo)后光鏡檢測(cè) HUCMSC在柚皮苷誘導(dǎo)劑的作用下，在倒置的顯微鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)晶反光點(diǎn)，對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象。柚皮苷組細(xì)胞融合率高于對(duì)照組。

2.3 HUCMSC誘導(dǎo)后ARS染色 細(xì)胞在A(yíng)RS染色后，光鏡下可見(jiàn)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕紅色的結(jié)節(jié)，周邊有星芒裝凸起。柚皮苷組胞漿內(nèi)出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)并且有聚集趨勢(shì)，成片狀，數(shù)量多；而對(duì)照組少量礦化結(jié)節(jié)形成。見(jiàn)圖2。

2.4 ARS染色及鈣化顆粒的半定量分析 成骨誘導(dǎo)14，28 d后，在倒置顯微鏡下能觀(guān)察到礦化顆粒的形成，并且柚皮苷組所形成的顆粒數(shù)量多，而對(duì)照組礦化顆粒少。礦化顆粒經(jīng)氯化十六烷基吡啶溶解后，2組OD值：柚皮苷組1.1506±0.0571，2.3569±0.0825（P < 0.05）；對(duì)照組0.6826±0.0125，1.3528±0.0584（P < 0.05）。2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05，n = 4）。

2.5 誘導(dǎo)后的ALP定量檢測(cè)分析 ALP染色后可見(jiàn)柚皮苷組細(xì)胞表達(dá)ALP強(qiáng)陽(yáng)性，對(duì)照組弱陽(yáng)性，2組對(duì)比可以推測(cè)出柚皮苷組在誘導(dǎo)劑對(duì)成骨分化有明顯促進(jìn)作用。見(jiàn)圖3。細(xì)胞內(nèi)ALP含量測(cè)定，按照ALP試劑盒操作流程，酶標(biāo)儀560 nm處測(cè)定OD值計(jì)算含量，細(xì)胞內(nèi)ALP含量測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1，柚皮苷組胞漿內(nèi)ALP含量較對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討 論

干細(xì)胞的研究能夠幫助處理臨床中出現(xiàn)的各種問(wèn)題，其中種子細(xì)胞的選擇至關(guān)重要[7]，目前研究較多的是骨髓中提取[8]，量太少，還要提前制備。Erices等[9]發(fā)現(xiàn)，臍帶血中可以提取干細(xì)胞，但臍血干細(xì)胞同樣提取困難并且量少。臍帶MSC比臍帶血干細(xì)胞有著先天優(yōu)勢(shì)：①來(lái)源問(wèn)題好解

決；②華爾通膠內(nèi)干細(xì)胞儲(chǔ)備量很大；③沒(méi)有倫理上的問(wèn)題。因此，臍帶MSC有廣闊的前景[10]。本實(shí)驗(yàn)的目的是采用誘導(dǎo)培養(yǎng)液與基礎(chǔ)培養(yǎng)液對(duì)照的方法，比較不同培養(yǎng)劑條件對(duì)臍帶MSC向成骨細(xì)胞分化的影響。

中藥骨碎補(bǔ)，別名崖姜、巖連姜、爬巖姜、肉碎補(bǔ)，骨碎補(bǔ)科蕨類(lèi)植物，中醫(yī)古籍中記載：“入腎，兼入心，療骨中邪毒?！惫撬檠a(bǔ)中可以提純出柚皮苷，以往的研究表明骨碎補(bǔ)能夠促進(jìn)大鼠骨折愈合[11]，但是骨碎補(bǔ)中提純的物質(zhì)在體外是否能促進(jìn)MSC向成骨細(xì)胞分化還是一個(gè)未知數(shù)。本研究結(jié)果顯示，柚皮苷可以促進(jìn)臍帶MSC向成骨細(xì)胞分化，成骨誘導(dǎo)28 d后，通過(guò)對(duì)比細(xì)胞ALP染色以及ARS染色，表明柚皮苷對(duì)干細(xì)胞的成骨分化具有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相似。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了3個(gè)問(wèn)題：①人臍帶間中能夠分離增殖出MSC。②骨碎補(bǔ)的提取物柚皮苷能夠體外誘導(dǎo)MSC向成骨細(xì)胞發(fā)展。胞漿內(nèi)ALP的含量，比對(duì)照組高出很多，證明了誘導(dǎo)因子的有效性。③實(shí)驗(yàn)過(guò)程中只用了一種誘導(dǎo)劑，盡量減少了干擾因素，找到了體外促進(jìn)干細(xì)胞分化的方案。

本實(shí)驗(yàn)從骨碎補(bǔ)中提純出的柚皮苷屬于植物類(lèi)雌激素，而雌激素在體內(nèi)可以抑制骨吸收，促進(jìn)成骨作用，這與本文的結(jié)論是相同的。ALP是一種與鈣離子結(jié)合的蛋白，主要分布于細(xì)胞膜上，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子向胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞的礦化，同時(shí)也是促進(jìn)細(xì)胞的成熟，ALP活性越高，則細(xì)胞的成骨性越強(qiáng)，越成熟。因此，ALP的檢測(cè)作為本次實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)觀(guān)察方向，結(jié)果也與目前實(shí)驗(yàn)相互吻合，柚皮苷組ALP活性明顯高于對(duì)照組。柚皮苷是β-羥-β-β-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，最近的體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均顯示，該類(lèi)藥物能作用影響骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）因子，從而促進(jìn)骨生長(zhǎng)、增強(qiáng)骨骼強(qiáng)度。這可能與柚皮苷對(duì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)有促進(jìn)作用有關(guān)。柚皮苷促進(jìn)干細(xì)胞成熟并成骨分化，考慮是有多種因子作用在其中，推測(cè)其分子過(guò)程為：①轉(zhuǎn)錄因子的逆表達(dá)，柚皮苷作用于干細(xì)胞后，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Runx2和OSX的表達(dá)。miR-17-5p家族，尤其是miR-20a，能決定人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的命運(yùn)和調(diào)控成骨分化的過(guò)程。②改變胞內(nèi)信號(hào)通路，柚皮苷可通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路的活性，結(jié)合IL-6調(diào)控，ERK5信號(hào)通路參與了成骨細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)了干細(xì)胞成骨分化后，成骨干細(xì)胞的增殖。③胞質(zhì)蛋白調(diào)控，柚皮苷具有促進(jìn)IL-17F因子的分泌，IL-17F對(duì)成骨細(xì)胞的增殖能力、BMP-2的促進(jìn)作用，同時(shí)

IL-17F還對(duì)抗BMP-2抑制因子Noggin mRNA對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖；但是具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[12]。

從中藥提取的單一物質(zhì)作為刺激因子能夠使干細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的活性，在后期人造骨架中能否增殖是關(guān)鍵，還有移植到人體后，能否繼續(xù)發(fā)育成活，有待今后進(jìn)一步研究和證實(shí)。

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收稿日期：2016-01-26；修回日期：2016-03-21