田林 羅榮宇 藍崇 魏紀湖 戴子一

【摘 要】 查閱近年來公開發(fā)表的關于利用骨髓間充質干細胞及其載體治療軟骨損傷的相關文獻資料，對常用載體的特征進行歸納?？偨Y近階段利用骨髓干細胞在治療軟骨損傷中各種載體的特點及其選擇。綜述骨髓間充質干細胞聯(lián)合載體治療軟骨損傷的研究現(xiàn)狀，重點對臨床常用載體進行說明及展望。骨髓間充質干細胞作為一種多能干細胞為軟骨損傷治療提供了新的思路，而單純干細胞移植難以達到應有的理想效果，臨床中多采取骨髓間充質干細胞聯(lián)合載體移植的方法?，F(xiàn)有載體材料眾多，各種材料特性不一、效果不同，如何整合利用各種材料的特點、避免其弊端，亟待解決和深入研究。

【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞；載體；軟骨損傷修復

隨著老齡化的加劇和疾病譜的變化，關節(jié)軟骨損傷成為臨床骨科常見疾病之一。軟骨組織因無神經(jīng)、無血管的解剖結構特征，缺乏自我修復和再生能力，損傷愈合困難；再加上缺損軟骨處長期磨損，臨床多演變?yōu)楣顷P節(jié)炎[1]。目前，臨床治療骨關節(jié)炎主要采用藥物對癥治療，現(xiàn)有治療手段中無論是關節(jié)鏡下關節(jié)腔沖洗、骨髓刺激或自體軟骨塊移植均具有臨床缺陷[2]。

近年來，隨著組織工程的迅速發(fā)展，軟骨損傷的修復與再生成為可能，并被認為是最具潛力的治療方法[3]。在利用組織工程進行軟骨修復時，種子細胞、支架材料、生長因子被認為是組織工程修復再生的三大主導因素。骨髓間充質干細胞（BMSCs）是一種具有多向分化潛能的均質性細胞，經(jīng)特定條件誘導，可分化為多種間充質組織細胞[4]。在體外培養(yǎng)中，BMSCs可以保持穩(wěn)定的多向分化潛能，且體內植入反應較弱，是一種理想的組織工程種子細胞[5]。單純運用BMSCs療軟骨損傷難以體現(xiàn)其良好的生物學特性，達不到預期療效。究其原因，單純的細胞難以形成組織，而依賴聯(lián)合支架材料或其復合物的骨髓干細胞聯(lián)合體，不僅為細胞增殖分化提供了場所，還在組織再生中起到重要的引導作用，以達到控制組織或器官性狀的目的[6-8]。

1 軟骨損傷

關節(jié)軟骨是一種無血管、少細胞的透明結締組織，具有提供結構支撐和緩沖承重的作用，分為表層、中層、深層和鈣化層。軟骨組織的表層細胞呈扁平狀，具有分泌表層蛋白多糖的作用；而呈垂直柱狀排列的中層軟骨細胞則具有表達二型膠原（Type n Collagen）、蛋白聚糖（Aggrecan）和其他蛋白的功能；在軟骨細胞中數(shù)目最多的深層及鈣化層細胞表達十型膠原（Type X collagen ）和堿性磷酸酶（ALP）[8]。

關節(jié)軟骨受損的原因：①外傷性軟骨受損，如在運動中膝關節(jié)軟骨損傷；②創(chuàng)傷后的慢性損傷，如受傷后持續(xù)活動造成的勞損；③退行性的關節(jié)病變，軟骨細胞是關節(jié)軟骨中唯一能夠產(chǎn)生豐富細胞外基質（ECM）的細胞，軟骨組織一旦受損，軟骨細胞就會表達炎癥介質、基質降解酶和其他非正常蛋白質，形成成團聚集現(xiàn)象等病理組織學標志[9]。因為軟骨組織的生理特征，所以關節(jié)軟骨損傷后幾乎無任何修復能力，組織破壞往往從關節(jié)表面持續(xù)延展到軟骨深層，臨床表現(xiàn)為關節(jié)性病變或骨關節(jié)炎。

2 BMSCs

BMSCs是一種具有多項分化潛能的細胞群，主要具有兩大特性：①自我更新潛能。經(jīng)多次傳代仍可保持其原有的生物學特性，研究顯示，BMSCs傳代38次仍可保持其原有的生物學特性，其染色體核型和端粒酶活性并不隨著多代培養(yǎng)而有所改變。②定向或多向分化潛能。BMSCs具有分化為骨細胞、軟骨細胞、肝細胞和神經(jīng)細胞等潛能[10]。

BMSCs能從胚胎干細胞中獲得，也能夠從成體組織中獲得，如骨髓、脂肪組織、滑膜、胎盤和軟骨膜等。較軟骨細胞（hACs）、胚胎干細胞（ESCs）、誘導多能干細胞（iPSCs）等其他軟骨損傷修復的種子材料[6-10]而言，BMSCs被認為是軟骨修復中一種潛在的、運用最多的理想種子細胞。BMSCs修復關節(jié)軟骨損傷的途徑受到軟骨損傷程度、載體等多方面因素的綜合影響，其中載體類型是主要因素，并按這一因素將利用BMSCs修復軟骨損傷的途徑分為：①細胞—載體聯(lián)合植入。將篩選的BMSCs在體外培養(yǎng)后與載體復合后植入軟骨缺損平面。②關節(jié)軟骨周圍注射。將體外培養(yǎng)的BMSCs重懸于培養(yǎng)基或血清后直接注射入關節(jié)腔[11]。

BMSCs在軟骨修復應用中的研究仍處于初期階段。造成BMSCs在臨床推進速度緩慢的原因有：①年長患者的種子細胞質量差，為保證移植成功率、避免排異反應，多采用自體種子細胞移植；但骨關節(jié)炎患者多為老年人，隨著患者年齡增長，細胞增殖潛能受限，而如果選擇異體干細胞移植，則要承擔免疫反應的風險。②在種子細胞獲取過程中，為了獲得一定數(shù)量的細胞，需要延長細胞培養(yǎng)周期，而長時間的體外培養(yǎng)，可能改變BMSCs表型。

③新生軟骨的力學強度較正常軟骨弱[12]。

3 載體材料

軟骨損傷修復再生的載體材料應具有促進BMSCs誘導成軟骨和為細胞生長提供培養(yǎng)基的能力，具體篩選要求為：①為保證種子細胞獲取營養(yǎng)以進行代謝，載體需具備通暢的孔隙通道；而影響通暢度的主要因素為孔隙大小及孔隙率。②與缺損區(qū)周圍組織匹配和相容，并有良好的生物學強度以提供穩(wěn)定的機械支撐，同時有利于細胞與缺損組織的黏附。③載體降解產(chǎn)物對機體無害，并盡量不產(chǎn)生排異反應。④便于消毒和消毒后保存。⑤為保持組織穩(wěn)定度，載體降解率與缺損區(qū)組織再生率應保持動態(tài)平衡[13]。根據(jù)以上篩選條件，現(xiàn)有的可利用BMSCs載體包括自體骨、異體骨、有機材料、生物陶瓷、納米材料、生物材料等。

3.1 軟骨基質 來源于軟骨基質的非細胞軟骨片（ACSs）作為BMSCs的接種載體，構成BMSC-ACS復合體。Xue等[14]通過相關動物實驗證實，經(jīng)體外軟骨基質培養(yǎng)后的BMSCs，在動物體內4周后，誘導性的BMSC-ACS復合體內有軟骨形成，且比對照試驗下的聚乙醇酸/聚乳酸（PGA/PLA）-BMSC復合體形成的軟骨量更多。Yang等[15]證明軟骨來源的細胞與BMSC構成載體具有良好的生物相容性，而良好的相容性是軟骨再生的先決條件。軟骨基質不可再生，材料緊缺是其運用中的主要限制因素。

3.2 自體骨 因自體骨不存在免疫反應且手術費用低，所以在臨床中被廣泛運用。自體骨不僅可以發(fā)揮良好的局部支撐作用，還因較佳的相容性使軟骨再生時間極大縮短。在自體骨-BMSCs復合體移植手術中再加入相關的生長因子，干細胞可以黏附在松質骨內，以減少移植過程中干細胞的損失，具有愈合快、無排斥反應等優(yōu)點，取得了較好的療效。雖然髂骨、腓骨中上段都是自體骨的取材范圍；但軟骨缺損患者多為老年人，患者多并發(fā)骨質疏松，自體骨支撐力差[16]。

3.3 異體骨 異體骨包括同種異體骨及異種異體骨，常用的異體骨以脫鈣骨基質為代表，并結合三維多孔結構使BMSCs容易增殖和分化，同時有利于營養(yǎng)成分滲透，取得了較好的臨床效果。雖然臨床一般經(jīng)過脫鈣、脫細胞、脫蛋白等不同方法降低抗原性，以改善組織相容性；但抗原性仍是其臨床運用的主要弊端，亟待進一步解決。

3.4 天然纖維凝膠 天然生物材料作為支架材料在骨與軟骨組織工程中被廣泛運用，其種類繁多，應用廣泛，天然材料具有無毒、組織相容性好、降解產(chǎn)物易完全吸收等優(yōu)勢。利用纖維凝膠的可塑性，可模擬機體的狀態(tài)，為細胞提供穩(wěn)定的空間環(huán)境，供細胞在其中附著、分化、增殖、并進行物質交換和生長代謝，誘導軟骨組織形成，進行軟骨缺損的修復。Jung等[17]發(fā)現(xiàn)天然纖維凝膠可促進BMSCs成軟骨分化并能維持軟骨細胞的表型，為軟骨組織的穩(wěn)定和再生提供可能，為BMSCs在軟骨組織工程上的運用奠定基礎。

3.5 人工合成材料

3.5.1 聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）支架 隨著組織工程的發(fā)展，以聚乳酸、聚乙醇酸等為代表的新型人工材料被大量研制出來。以聚乳酸為例，作為聚乳酸3種異構體之一的聚左旋乳酸具有良好的組織相容性和可吸收性，大量研究證實BMSCs復合聚乳酸、聚乙醇酸聚合物是較理想的移植替代物。目前，在軟骨修復中最常用的人工合成材料為聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）支架。PLGA具有良好的組織相容性、無毒性、易塑性強和降解速度可控性等優(yōu)點，合適的強度足以支撐再生的軟骨，良好的可塑性使其表面能做成大小合適的孔徑，這些孔徑是細胞增殖培養(yǎng)的良好三維空間[14]。

BMSCs聯(lián)合PLGA支架修復軟骨缺損中發(fā)現(xiàn)BMSCs會表達肥大軟骨的相關基因，且因PLGA降解而產(chǎn)生的酸性環(huán)境可能對BMSCs產(chǎn)生副作用，從而影響軟骨再生修復。

3.5.2 殼聚糖-β-甘油磷酸鈉凝膠（Chitosan-disodium β glycerol phosphate，C/GP）支架 近來也有把C/GP作為載體的研究報告，Li等[18]通過相關動物實驗證實：①在C/GP-BMSC聯(lián)合體外培養(yǎng)的BMSCs呈成纖維細胞樣形態(tài)，在成骨和成軟骨誘導條件下可分別向成骨樣細胞和軟骨細胞分化；②BMSCs在C/GP凝膠內成活率達到90%以上；③體外培養(yǎng)21 d后，成軟骨誘導的BMSCs在C/GP凝膠內產(chǎn)生大量軟骨基質，故認為C/GP凝膠與BMSCs顯示了良好的細胞相容性，有利于BMSCs在其內生長、增殖和成軟骨分化，有望作為軟骨組織工程的細胞載體得以推廣。

3.5.3 生物陶瓷類 生物陶瓷類人工材料以碳酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣及其各自的衍生物為代表，因生物陶瓷類材料具有較好的骨傳導能力及骨誘導活性，被廣泛運用為骨替代材料，其中磷酸鈣及其衍生物是BMSCs領域運用最多的載體。磷酸鈣的成分與骨基質的無機成分相似，與骨結合好。新型磷酸鈣骨水泥，因其可降解性、成骨性及細胞相容性更佳，且可注射并具有緩釋功能，近年被組織工程領域較多采用。章樂成等[13]研究證明，磷酸鈣骨水泥的三維多孔結構表現(xiàn)出良好的細胞黏附與增殖性能，具有促進BMSCs向成骨細胞分化的作用，是優(yōu)良的骨組織工程學的支架材料[19]。但Ng等[20]在實驗中發(fā)現(xiàn)，雖然新型磷酸鈣骨水泥作為一種可注射支架材料，其最大缺陷為生物力學強度的不足，這是今后組織工程學需要解決的新方向。

3.5.4 納米級材料 納米技術的應用為醫(yī)藥技術的發(fā)展提供了新的動力，用納米技術將相關醫(yī)學材料制備成納米級材料，其改變的理化性質也將帶來新的醫(yī)學效果。

由于骨組織本身是一種納米復合結構，其原理是在微米結構上模仿骨組織的結構及活性，在提高BMSCs及其載體相容性的基礎上，更好地誘導和促進細胞的成骨作用[21]。納米材料因其獨特的組織結構、大小及形狀，可以更好地與骨細胞及組織產(chǎn)生作用。Zandi等[22]研究表明，納米羥基磷灰石具有較好的生物相容性、較高的生物活性及足夠的機械支撐力量，適合BMSCs黏附、生長、增殖和分化。然而，納米材料作為BMSCs載體，依然需要更多臨床及實驗研究深入探索其細胞毒性、生物相容性及生物降解能力。

4 小結與展望

綜上所述，BMSCs作為一種具有巨大潛力的軟骨修復再生的理想種子細胞，在臨床應用中必須依托合適的載體，才能保證良好的軟骨修復效果。在利用BMSCs治療軟骨損傷中，目前，可利用的BMSCs載體種類繁多，但無論固體材料、可注射材料還是經(jīng)納米技術改造后的載體材料均有各自缺陷。固體材料擁有足夠的支撐力，卻不能有效解決干細胞丟失的問題；可注射材料的可塑性強、吸附力好，但支撐力不足、力學性能偏低。目前比較前沿的是利用磁力引導對納米級載體材料進行定向部署的靶向技術，該技術能很好地解決傳統(tǒng)材料的缺陷，一旦有突破性進展，不失為軟骨損傷修復的新途徑。

BMSCs及其載體在軟骨損傷修復中的研究與臨床應用，還應結合其載體選擇，在BMSCs的來源、分離、培養(yǎng)和移植方法等方面進一步研究。同時還應充分考慮患者臨床條件及軟骨損傷的類型、位置、面積大??；明確BMSCs及其載體在軟骨損傷修復中的臨床應用和療效評估標準，使BMSCs及其載體修復軟骨損傷更加系統(tǒng)化、科學化，最終獲得理想的治療效果和應用前景。

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收稿日期：2015-11-07；修回日期：2016-02-25