劉 鵬，逄好勝，張萌萌，張秀麗，孫廣玉

（東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040）

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煙草BY-2細胞生長和呼吸對不同類型酸雨的響應

劉 鵬，逄好勝，張萌萌，張秀麗，孫廣玉

（東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040）

摘要：為了直觀探究不同類型酸雨對植物生理生長的影響，以煙草Bright Yellow-2（BY-2）細胞為試驗材料，模擬不同pH值（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5）下硫酸型酸雨（SAR）、硝酸型酸雨（NAR）及混合型酸雨（MAR），以期了解其對煙草BY-2細胞干重和呼吸的影響。研究表明，在不同酸度下，煙草細胞干重均低于對照，細胞呼吸出現紊亂變化，說明不同pH下的酸雨對細胞均有傷害，BY-2細胞的干重和呼吸有不良反饋，且不同酸度的傷害程度不一，強酸（pH值為1.5）下對細胞迫害性最強。因此，不同類型酸雨對植物有迫害性，迫害性大小為SAR>NAR>MAR。

關鍵詞：酸雨；煙草BY-2細胞；pH；細胞干重；細胞呼吸

酸雨通常是指pH<5.6的雨雪或其他形式的降水［1］，在形成和降落時吸收大氣中的二氧化硫（SO2）和氮氧化合物（NOx）等物質。酸雨被喻為“空中死神”，能夠損害古跡、傷害作物、酸化水體和土壤、破壞森林等。研究表明，酸雨會影響植物的生長發(fā)育和作物的營養(yǎng)價值［2-4］，而且危害植物的功能代謝。酸雨作用于植物，會傷害植物的葉片以及葉片的生理功能，表現在對葉片細胞超微結構破壞和膜脂過氧化［5］。有研究發(fā)現，酸雨提高了植物細胞膜透性，增加了丙二醛(MDA)含量，卻降低了防御氧化性的系統抗性能力［6］。強酸雨還會影響作物種子的萌發(fā)率以及對其葉片造成的損害程度［7］。

煙草BY-2細胞即為Bright Yellow-2細胞，該細胞不含葉綠體，呈亮黃色的懸浮體，煙草BY-2懸浮細胞采用改良的MS培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為恒溫振蕩器轉速127 rpm、溫度25℃±2℃。煙草BY-2細胞被Nagata等人所述來培養(yǎng)［8］。煙草BY-2懸浮細胞擁有獨特的性質是較高的生長率（僅僅13 h就能夠完成整個細胞的循環(huán)），通過根癌土壤桿菌同質性高和容易轉換，最重要的是這些細胞能夠同步化到相當高的程度。所有的這些特點使得煙草BY-2細胞成為研究植物細胞類的理想模型系統［9］。目前，有關酸雨的研究多數集中在整體植物上，或植物的某個器官或某個組織，如：葉片等。但是，以細胞為基礎單元的研究鮮見報道。為此，本文以煙草BY-2細胞為研究材料，在模擬不同酸雨類型的環(huán)境條件下，通過煙草BY-2細胞生長和呼吸變化來探究酸雨對細胞的作用機理，為植物抵御酸雨危害提供技術支撐。

1　材料與方法

1.1試驗材料

本試驗在東北林業(yè)大學植物生理實驗室進行，研究材料為煙草BY-2細胞，培養(yǎng)3d的煙草BY-2細胞為最佳材料。

1.2模擬酸雨的配置和處理

用0.15 mol·L-1CaCl2、0.12 mol·L-1MgCl2、0.21 mol· L-1KCl、0.15 mol·L-1NaCl、0.10 mol·L-1NaF和 0.55 mol·L-1NH4Cl配制各離子濃度的溶液［10］。硫酸型酸雨：將96%的硫酸加入上述配置好的各離子濃度的溶液，配成pH=1的母液，母液調制成pH值分別為1.5、2.5、3.5、4.5和5.5的硫酸型酸雨溶液。硝酸型酸雨：將65%的硝酸加入上面配好的各離子濃度的溶液，其他配制同硫酸型酸雨溶液?；旌闲退嵊辏喊凑樟蛩幔?6%）與硝酸（65%）質量比1:1，配成pH=1混合型母液，然后用此母液配成pH值分別為1.5、2.5、3.5、4.5和5.5的混合型酸雨。

2　試驗方法

2.1試驗處理

將培養(yǎng)3d的煙草BY-2細胞在分析天平上稱取1g放于錐形瓶中，每瓶各加入改良的MS培養(yǎng)基10mL，pH值為1.5、2.5、3.5、4.5和5.5的硫酸型、硝酸型以及混合型酸雨溶液各取500μL，分別加入錐形瓶中。以不加入酸雨而加入去離子水作為對照（CK）。每個處理進行3次重復。

2.2測定方法

2.2.1細胞干重測定

煙草BY-2細胞經酸雨溶液處理1d、2d、3d和4d后，用200目細胞篩過濾去除液體得到細胞后放入60℃烘箱中烘干，烘干至恒重后稱取細胞干重（mg）。

2.2.2煙草BY-2細胞呼吸速率的測定

經3種酸雨溶液分別處理3h、6h和9h后的煙草BY-2細胞，利用 Chlorolab-2液相氧電極（英國Hansatech公司） 測定煙草 BY-2細胞呼吸速率（μmolO2/mL/min）。

2.2.3DNA凝膠成像

經3種酸雨溶液處理24h后用天根植物DNA試劑盒提取煙草BY-2細胞的DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行電泳，然后進行成像分析。

2.3統計分析

利用Excel 2003對數據結果進行處理，平均值間的比較通過DPS軟件的單因素方差分析法(One-way ANOVA)。

3　結果與分析

3.1模擬酸雨對煙草BY-2細胞干重的影響

圖1　煙草BY-2細胞在模擬酸雨處理下的干重Fig.1　The dry weight of tobacco BY-2 cells under simulated acid rain treatments

圖1顯示，隨著培養(yǎng)天數的增加，未經酸雨處理的煙草BY-2細胞（CK）的干重逐漸增加，而經過3種酸雨處理的煙草BY-2細胞干重逐漸降低，且處理后的煙草BY-2細胞干重與CK差異顯著。硫酸型酸雨處理煙草BY-2細胞（圖1-A）顯示，pH=1.5的酸雨，處理后1d細胞干重就降低了77.32%，而pH為2.5～5.5的酸雨處理的細胞干重降低幅度均小于pH=1.5處理的降低幅度，pH為2.5、3.5、4.5和5.5處理的細胞干重分別較CK降低了17.55%、10.56%、2.14%和15.12%。隨著處理時間的增加，硫酸性酸雨處理煙草BY-2細胞的干重降低程度加大，pH為2.5、3.5、4.5和5.5的酸雨處理第4d的細胞干重比CK分別降低了92.22%、88.02%、92.49%、83.03%和80.82%。硝酸型酸雨處理煙草BY-2細胞（圖1-B）的結果與硫酸型酸雨表現的趨勢基本一致，不同之處是pH=1.5的硝酸型酸雨處理的煙草BY-2細胞干重所降低的程度要小于相同pH值下硫酸型酸雨處理的細胞干重降低程度，混合型酸雨處理煙草BY-2細胞（圖1-C），其干重變化與硫酸型酸雨相似。

3.2模擬酸雨對煙草BY-2細胞呼吸速率的影響

圖2　煙草BY-2細胞在模擬酸雨處理下的細胞呼吸Fig.2 The cellular respiration of tobacco BY-2 cells under simulated acid rain treatments

由圖2所示，3種不同類型的酸雨處理煙草BY-2細胞，其細胞的呼吸速率表現出不同的變化。硫酸型酸雨處理煙草BY-2細胞，pH=1.5酸雨明顯降低了細胞的呼吸速率，與CK差異顯著（圖2-A）；pH為2.5、3.5、4.5和5.5處理的煙草BY-2細胞的呼吸速率明顯增加，與CK比較差異顯著，并且隨著處理時間的增加，呼吸速率變化不大。硝酸型酸雨處理的煙草BY-2細胞呼吸速率變化同硫酸型酸雨相似（圖2-B）?；旌闲退嵊昝黠@降低了煙草BY-2細胞呼吸速率（圖2-C），pH=1.5的處理明顯降低了細胞的呼吸速率，而且處理時間越長，呼吸速率降低越明顯，酸雨處理6h和9h呼吸速率非常低，分別較CK降低了94.07%和94.20%。3.3模擬酸雨對煙草BY-2細胞DNA的影響

由圖3所示，不同酸度處理的BY-2細胞的DNA均是2 000bp。pH=1.5的DNA片段最少，其次DNA片段少的是pH=2.5、pH=5.5、pH=3.5，pH=4.5的DNA片段較多（圖3-A）。pH=5.5的DNA片段較其他處理的DNA片段要少很多（圖3-B）。pH=1.5處理的DNA片段較少，其他處理的DNA片段較多（圖3-C）。

圖3　煙草BY-2細胞在模擬不同類型酸雨處理下的DNA圖像Fig.3　The DNA images of tobacco BY-2 cells under simulated acid rain treatments

4　討論

本實驗的結果通過圖1顯示，由于細胞隨著時間是不斷生長的，因此CK組的細胞干重隨著處理天數是不斷增加的，而模擬三種酸雨處理組的細胞干重百分比隨著時間均下降，細胞的干重較CK比較處于沒有增長的趨勢且與CK間存在顯著性差異（p<0.05），由此表明三種酸雨對細胞的生理均有傷害性，會抑制細胞的正常生長，因此可以表明酸雨會影響植物的正常生長、阻礙生長發(fā)育、降低生長量和產量［11］。由圖2表示，模擬三種酸雨的pH 1.5處理的細胞呼吸與其他處理和CK存在顯著性差異（p<0.05），強酸對細胞的傷害作用更劇烈，且SAR各處理的細胞呼吸要明顯高于NAR與MAR，而三種酸雨pH 2.5~pH 5.5的處理細胞呼吸隨著時間出現了先升高再降低或先下降后升高的變化，細胞呼吸出現紊亂，代表著處理對細胞正常的生理有一定的干擾作用，呼吸的升高和呼吸的紊亂都將大幅度地消耗細胞的能量和物質，而MAR處理組的呼吸速率降低了，可能氮與硫元素的混合對植物有一定益處。結合圖3中DNA的圖像，隨著酸雨酸度的增加，對煙草BY-2細胞的傷害逐漸明顯，尤其是重度酸雨下，細胞的DNA片段明顯減少，說明細胞大量死亡，遺傳物質遭到破壞，進而細胞的干重與呼吸速率均大幅度下降，但是NAR與MAR不是嚴格按照酸度增加而傷害性增強，在pH2.5時的傷害性小于pH5.5，可能加入氮元素在pH2.5的酸度下對植物細胞有益處，減小了酸雨對細胞的傷害性。此實驗后續(xù)將要對模擬酸雨處理下的煙草BY-2細胞進行觀察以及對細胞中的酶等進行測試，通過生理指標綜合的進行比較分析，同時對煙草BY-2細胞的其他受迫害性條件進行合理的探索。

綜上所述，通過圖1、2和圖3以及細胞干重、細胞呼吸百分比的比較，模擬三種酸雨酸雨各個處理對細胞傷害比較且通過比較，三種不同酸雨迫害性大小為：SAR>NAR>MAR。通過對細胞的直觀實驗，可推出酸雨對植物的的生理生長均有迫害性，對植物的生理產生有一定的不良影響，長時間生長在酸雨地帶，植物的各種生理指標均會出現異常，影響植物生長發(fā)育甚至死亡，因此要保護環(huán)境減少污染。

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The response of tobacco BY-2 cells on weight and respiration under
simulated acid rain of different types of treatments

LIU Peng,PANG Hao-sheng,ZHANG Meng-meng,ZHANG Xiu-li,SUN Guang-yu
(School of Life sciences,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

Abstract:To understand the effects of different types of acid rain on plant growth and physiological,Tabacco bright yellow-2 (BY-2)cells were used as the experimental materials to study the effects simulated sulfuric acid rain(SAR),nitric acid rain (NAR)and the mixed acid rain(MAR)on physiological characteristics in different pH values(1.5、2.5、3.5、4.5、5.5),the results showed that the dry weight of cells decline to compare with control in different acidities,The cellular respiration appeared unstable situation,the content of DNA is different in DNA images,illustrated that simulated acid rain is harmful to cells,and had bad influence of BY-2 cells on weight and respiration,strong acid(pH 1.5)is the most harmful and persecution is different in different acidities.Conclusion:acid rain of different types are harmful to plants,the persecution: SAR>NAR>MAR.

Key words:Acid rain;Tabacco BY-2 cells;pH;Cells dry weight;Cellular respiration;DNA

中圖分類號：Q814

文獻標志碼：A

文章編號：1674-8646（2016）08-0010-04

收稿日期：2016-01-07

基金項目：黑龍江省自然科學基金重點項目（ZD2011-05）

作者簡介：劉鵬(1990-)，女，遼寧莊河人，碩士，主要從事植物生理與生態(tài)研究。

通訊作者：孫廣玉(1963-)，男，黑龍江巴彥人，博士，博士研究生導師，教授，主要從事植物生理學研究，email:sungy@vip.sina.com。