朱立華 肖新燕 許玉剛 孫秀芬

山東省聊城市第二人民醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科（臨清　252600）

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密度梯度離心方式對人工授精結(jié)局的影響

朱立華 肖新燕 許玉剛 孫秀芬

山東省聊城市第二人民醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科（臨清252600）

摘要目的 探討精液經(jīng)密度梯度離心時經(jīng)水平轉(zhuǎn)子和角轉(zhuǎn)子處理后對精液質(zhì)量及其對人工授精結(jié)局的影響。方法 回顧性分析352個人工授精周期，根據(jù)梯度離心時轉(zhuǎn)子的不同，分成水平轉(zhuǎn)子組和角轉(zhuǎn)子組兩組，精液經(jīng)密度梯度離心法處理，形態(tài)學(xué)分析嚴(yán)格按照WHO（World Health Organization）人類精液檢驗與處理實驗手冊第五版標(biāo)準(zhǔn)，比較處理后精液質(zhì)量及兩組對妊娠結(jié)局的影響。結(jié)果 （1）精液質(zhì)量比較：水平轉(zhuǎn)子組前向運(yùn)動精子為（89.2±8.5）%、精子濃度為（47.8±14.3）×106/mL、前向運(yùn)動精子總數(shù)為（13.6±6.3）×106；角轉(zhuǎn)子組前向運(yùn)動精子為（90.1±8.8）%、精子濃度為（43.4±15.1）×106/mL、前向運(yùn)動精子總數(shù)為（12.9±6.1）×106，無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0. 05）。水平轉(zhuǎn)子組和角轉(zhuǎn)子組正常精子比率分別為（18.5±8.2）%和 （14.2±5.7） %，兩者存在顯著性差異（P＜0.05）；（2）妊娠結(jié)局比較：水平轉(zhuǎn)子組的臨床妊娠率為16.5%（30/182）、流產(chǎn)率為 3.3%（1/30）、活產(chǎn)率為 96.7%（29/30）；角轉(zhuǎn)子組生化妊娠率為臨床妊娠率為12.4%（21/170）、流產(chǎn)率為 9.5%（2/21）、活產(chǎn)率為 90.5%（19/21），無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0. 05），生化妊娠率：兩組分別為 0%（0/30），19.2%（5/26），有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 密度梯度離心應(yīng)用水平轉(zhuǎn)子可以降低對處理后精液的精子形態(tài)的影響，減少生化妊娠率。

關(guān)鍵詞授精， 人工； 離心法， 梯密度； 妊娠結(jié)局

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.004

夫精宮腔內(nèi)人工授精（intrauterine insemination，IUI）是一種簡單便捷的輔助生殖技術(shù)，對男性不育因素，女性宮頸因素、免疫因素及不明原因的不孕癥治療有較好療效，但是由于受到夫婦雙方各種因素的影響其妊娠率一直偏低，文獻(xiàn)報道成功率僅為5%～15%［1， 2］；精液優(yōu)選方法在對精子優(yōu)化過程中，同時影響精子的畸形率，DNA的完整性［3］等，進(jìn)而影響人工授精結(jié)局。本文旨在分析梯度離心時運(yùn)用角轉(zhuǎn)子和水平轉(zhuǎn)子處理精液對人工授精結(jié)局的影響。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析2011年7月至2014年7月聊城市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科的352個IUI 周期的臨床資料。所有入選病例至少有一側(cè)輸卵管通暢， 各周期不孕婦女HCG注射日子宮內(nèi)膜均為A型（“三線征”）。梯度離心時采用角轉(zhuǎn)子共 182 個周期；梯度離心時采用水平轉(zhuǎn)子共170 個周期。

二、方法

（一）精液分析及處理

男方禁欲3～7d，手淫法采集于廣口無菌無毒容器中，置室溫充分液化30min，記錄精液量、液化時間，使用偉力精子檢測系統(tǒng)檢測精子濃度、活動率、a+b級精子比例。采用密度梯度離心法分離精子，將液化后的精液充分混勻加于平衡好的90%、45%的梯度液上層，放入離心機(jī)300×g，離心20 min后棄上清，加入1 mL精液清洗液（SAGE-1005）后混勻，300×g，離心20 min，棄上清，沉渣加入0.4～0.5 mL HTF液，置5% CO2培養(yǎng)箱備用于人工授精。

（二）精子形態(tài)學(xué)分析

精子原液及人工授精備用液于清潔的載玻片上，分別均勻涂片兩片后待其自然干燥，改良巴氏染色，干燥后立即顯微鏡觀察，精子形態(tài)分析按照WHO人類精液檢驗與處理實驗手冊第五版標(biāo)準(zhǔn)；患者的兩張涂片各觀察評估至少200個精子，計算兩次評估正常精子比例均值和誤差，確定誤差在可接受的范圍之內(nèi)（95%可信區(qū)間），計算兩次結(jié)果平均值。使用偉力精子檢測系統(tǒng)檢測精子濃度、前向運(yùn)動精子率并根據(jù)精液體積計算前向運(yùn)動精子總數(shù)。

（三）治療方案及卵泡監(jiān)測

1. 自然周期（natural cycle， NC）：周期第10天起B(yǎng)超監(jiān)測卵泡發(fā)育，至優(yōu)勢卵泡直徑達(dá)14 mm 時開始監(jiān)測尿黃體生成素（luteinizing hormone， LH）峰，出現(xiàn)LH 峰后24h～40 h 左右行IUI。

2. 人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadotrophin， HMG）促排卵周期：從月經(jīng)第5 天開始用藥，75 u/d，連用5 d 后根據(jù)卵泡發(fā)育情況增減劑量，卵泡直徑達(dá)18 mm 時肌肉注射5000u～10000u，注射HCG 24h～36 h 后行IUI。

3. FSH+HMG：從月經(jīng)第5天開始用藥， 麗申寶75 u/d，連用5 d 后，卵泡直徑達(dá)12mm～13 mm時加用HMG75 u/d，并調(diào)節(jié)用量至成熟，注射HCG 24h～36 h后行IUI。

4. LE +HMG：月經(jīng)周期第五天服用來曲唑片（2.5mg/片，北京諾華公司）5mg/ qd×5d，B超監(jiān)測卵泡大小，接著加用HMG（75u/支）1支/d，根據(jù)卵泡大小調(diào)整用量直至成熟，注射HCG 24h～36h 后行IUI。

（四）手術(shù)方法

受者取膀胱截石位，暴露宮頸后，用1 mL的注射器與特制的無損傷導(dǎo)管連接，吸取經(jīng)處理后的精子懸液0.3～0.5 mL，將導(dǎo)管輕輕插入宮頸內(nèi)口，于2～3 min內(nèi)將精子懸液注入后， 緩慢取出導(dǎo)管， 臀高位仰臥30 min。

（五）黃體支持

對受術(shù)者均行黃體支持，使增生期子宮內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，于確定排卵日每日肌注黃體酮40 mg，共 15 d。

（六）臨床妊娠及生化妊娠的判定

通過對尿妊娠免疫試驗或血β- HCG 檢測確定妊娠者進(jìn)行隨訪。3周后復(fù)查B 超， 檢測到孕囊、卵黃囊及心臟搏動者確定為臨床妊娠。3周后復(fù)查B 超，監(jiān)測不到孕囊、卵黃囊及心臟搏動者確定為生化妊娠。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，均數(shù)的比較采用方差分析，率的差異性分析采用x2檢驗，P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　 果

一、水平轉(zhuǎn)子組與角轉(zhuǎn)子組患者配偶一般資料比較

梯度離心水平轉(zhuǎn)子組與角轉(zhuǎn)子組患者資料對比無顯著性差異 （P＞0.05），見表1。

二、水平轉(zhuǎn)子組與角轉(zhuǎn)子組患者促排卵方式和不孕原因比較

梯度離心水平轉(zhuǎn)子組與角轉(zhuǎn)子組患者促排卵方式和不孕原因?qū)Ρ葻o顯著性差異 （P＞0.05），見表2。

三、水平轉(zhuǎn)子組與角轉(zhuǎn)子組梯度離心前后精液參數(shù)比較

處理后水平轉(zhuǎn)子組和角轉(zhuǎn)子組正常精子比率分別為（18.5±8.2）%和（14.2±5.7 ）%，兩者存在顯著性差異（P＜0.05），見表3。

四、水平轉(zhuǎn)子組與角轉(zhuǎn)子組妊娠結(jié)局比較

IUI后，對患者妊娠結(jié)局進(jìn)行隨訪，水平轉(zhuǎn)子組和角轉(zhuǎn)子組生化妊娠率分別為0%（0/30）和 19.2% （5/26），兩者存在顯著性差異（P＜0.05），見表4。

表1　水平轉(zhuǎn)子組與角轉(zhuǎn)子組患者配偶一般資料比較

表2　水平轉(zhuǎn)子組與角轉(zhuǎn)子組患者促排卵方式和不孕原因比較

表3　水平轉(zhuǎn)子組與角轉(zhuǎn)子組梯度離心前后精液質(zhì)量比較

表4　水平轉(zhuǎn)子組與角轉(zhuǎn)子組妊娠結(jié)局比較

討　 論

近年來，誘發(fā)排卵藥物的改進(jìn)、精子優(yōu)化技術(shù)的提高、處理液的更新等，使人工授精的臨床應(yīng)用有了很大的進(jìn)步。IUI技術(shù)是將精液經(jīng)實驗室處理后，在排卵期注入患者宮腔內(nèi)以獲得較高的臨床妊娠率。作為人類輔助生殖的關(guān)鍵技術(shù)之一，精子優(yōu)選技術(shù)直接關(guān)系到整個輔助生殖治療的成敗。人工授精影響因素的研究集中在男性精液質(zhì)量參數(shù)，如前向運(yùn)動精子比率、前向運(yùn)動精子總數(shù)［4］、精子濃度［5］及正常形態(tài)精子比率［6-9］；女性因素則認(rèn)為女性患者年齡［10］、不孕年限、卵泡數(shù)目、子宮內(nèi)膜厚度 、HCG日激素水平、BMI［11-14］等因素和人工授精臨床妊娠率密切相關(guān)。

目前，精液優(yōu)化處理方法主要有上游法、密度梯度心法［15］和直接離心法 ，精液優(yōu)化的目的是回收大量的前向運(yùn)動精子或者具有正常形態(tài)精子。密度梯度離心法因其具有高回收率的特點，在輔助生殖實驗室的精液優(yōu)化中大量應(yīng)用。精子DNA結(jié)構(gòu)的完整性，不但是提高的妊娠率的因素［16］，而且與優(yōu)生優(yōu)育也具有十分密切的關(guān)系。有人將離心法處理后的精子進(jìn)行精液質(zhì)量及DNA完整性檢測，結(jié)果表明精子形態(tài)、活力、活率、各種運(yùn)動參數(shù)較優(yōu)選前均有所提高或加強(qiáng)，但離心法處理后的精子，其DNA損傷率較優(yōu)選前還要高，這表明離心法可對精子DNA結(jié)構(gòu)造成損傷［17］。

本研究中所有周期均采用密度梯度離心法對精液進(jìn)行優(yōu)化處理，根據(jù)使用轉(zhuǎn)子的不同隨機(jī)分為水平轉(zhuǎn)子組及角轉(zhuǎn)子組。并對兩組患者的基礎(chǔ)資料包括：年齡（歲）、不孕年限（年）、卵泡數(shù)目（n）、子宮內(nèi)膜厚度（mm）、 HCG日激素水平、BMI（kg/m2）以及促排方案和不孕原因等在過去研究中認(rèn)為和人工授精密切相關(guān)的女性患者的資料進(jìn)行比較，結(jié)果無顯著差異（P＞0.05）；對可以影響妊娠率的促排方案和不孕原因進(jìn)行比較，兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；對處理前后精液中公認(rèn)的影響人工授精的參數(shù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：處理前兩組患者配偶精液質(zhì)量：前向運(yùn)動精子比率（%）、精子密度（106/mL）、前向運(yùn)動精子總數(shù)（×106）、正常形態(tài)精子比率（%），無顯著差異（P＞0.05）處理后：前向運(yùn)動精子比率（%）、精子密度（106/mL）、前向運(yùn)動精子總數(shù)（×106）無顯著差異（P＞0.05），但是兩組正常形態(tài)精子比率差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這說明水平轉(zhuǎn)子的離心過程對精子形態(tài)的影響要比角轉(zhuǎn)子小，可以回收更多的正常形態(tài)的精子；對公認(rèn)的可以影響妊娠率的促排方案和不孕原因進(jìn)行比較，兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0. 05）。

人工授精后對妊娠結(jié)局隨訪的結(jié)果可以看出，兩組在流產(chǎn)率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率的比較無差異，然而生化妊娠率角轉(zhuǎn)子組卻顯著高于水平轉(zhuǎn)子組，通過本研究推測可能是在離心過程中角轉(zhuǎn)子較大程度地影響了精子的形態(tài)和精子DNA的完整性，致使較水平轉(zhuǎn)子富集正常形態(tài)和具有完整DNA的精子比率低，進(jìn)而造成生化妊娠率的提高，這有待于進(jìn)一步的實驗證實。由此我們可以得出結(jié)論：密度梯度離心法可以富集大量的前向運(yùn)動和正常形態(tài)的精子，從而達(dá)到精子優(yōu)化的目的；在離心過程中應(yīng)用水平轉(zhuǎn)子可以提高處理后精子的正常形態(tài)比例，降低生化妊娠率的發(fā)生。

參 考 文 獻(xiàn)

1Guven S， Gunalp GS， Tekin Y. Factors influencing pregnancy rates in intrauterine insemination cycles. J Reprod Med 2008； 53（4）∶ 257-265

2Ecochard R， Cottinet D， Mathieu C， et al. The mean of sperm parameters in semen donations from the same donor. An important prognostic factor in insemination. Int J Androl 1999； 22（3）∶ 163-172

3Marchesi DE， Biederman H， Ferrara S， et al. The effect of semen processing on sperm DNA integrity∶ comparison of two techniques using the novel Toluidine Blue Assay. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2010； 151（2）∶ 176-180

4Wainer R， Albert M， Dorion A， et a1. Influence of the number of motile spermatozoa inseminated and of their morphology on the success of intrauterine insemination. Hum Reprod 2004； 19（9）∶ 2060-2065

5Bonnet R， Kruger TF， Franken DR. Atlas of human sperm morphology evaluation. London∶ Taylor&Francis Group Press 2004∶ 27-34

6Grigoriou O， Pantos K， Makrakis E， et al. Impact of isolated teratozoospermia on the outcome of intrauterine insemination. Fertil Steril 2005； 83（3）∶ 773-775

7Hauser R， Yogev L， Botchan A， et al. Intrauterine insemination in male factor subfertility∶ significance of sperm motility and morphology assessed by strict criteria. Andrologia 2001； 33（1）∶ 13-17

8Van Waart J， Kruger TF， Lombard CJ， et al. Predictive value of normal sperm morphology in intrauterine insemination（IUI）∶ a structured literature review. Hum Reprod Update 2001； 7（5）∶ 495-500

9張軍榮， 盛慧強(qiáng)， 吳穎， 等. 精子形態(tài)與精子運(yùn)動參數(shù)的相關(guān)性研究. 中國男科學(xué)雜志 2015； 29（3）∶ 49-51

10Wiser A， Shalom-Paz E， Reinblatt SL， et a1. Ovarian stimulation and intrauterine insemination in women aged 40 years or more. Reprod Biomed Online 2012； 24（2）∶170-173

11Freundl G， Grimm HJ， Hofmann N， et a1. Selective fi ltration of abnormal spermatozoa by the cervical mucus. Hum Reprod 1988； 3（3）∶ 277-280

12Zarei A， Alborzi S， Dadras N， et al. The effects of endometrial injury on intrauterine insemination outcome∶A randomized clinical trial. Iran J Reprod Med 2014；12（9）∶ 649-652

13Yavuz A， Demirci O， S?zen H， et al. Predictive factors infl uencing pregnancy rates after intrauterine insemination. Iran J Reprod Med 2013； 11（3）∶ 227-234

14Aydin Y， Hassa H， Oge T， et al. Factors predictive of clinical pregnancy in the fi rst intrauterine insemination

cycle of 306 couples with favourable female patient characteristics. Hum Fertil （Camb） 2013； 16（4）∶ 286-290

15 Ricci G， Perticarari S， Boscolo R， et al. Semen preparation methods and sperm apoptosis∶ swim-up versus gradientdensity centrifugation technique. Fertil Steril 2009； 91（2）∶632-638

16 Khalili MA， Nazari S， Dehghani-Firouzabadi R， et al. Comparing the roles of sperm chromatin integrity and apoptosis in intrauterine insemination outcomes of couples with mild male and female factor infertility. J Reprod Infertil 2014； 15（1）∶ 35-40

17 Fukuda M， Fukuda K， Andersen CY， et a1. Ovulation jumping from the left to the right ovary in two successive cycles may increase the chances of pregnancy during intrauterine insemination and/or in vitro fertilization natural cycles. Fertil Steril 2006； 85（2）∶ 514-517

（2015-09-07收稿）

中圖分類號R 321-33

The infl uence of density gradient centrifugation with different mode on the outcome of intrarauterine insemination

Zhu Lihua， Xiao Xinyan， Xu Yugang， Sun Xiufen Productive Medical Department of the 2nd Hospital of Liaocheng ， Linqing 252600， Shandong， China

AbstractObjectiveTo assess the infl uence of density gradient centrifugation with swing-out rotors and fi xed-angle rotors on sperm quality， and the outcomes of intrarauterine insemination（IUI）. Metthhooddss352 IUI cycles were retrospectively analyzed in the study. Semen samples were processed with density gradient centrifugation， and were divided into swing-out rotors group and fi xed-angle rotors group based on different rotors. Sperm quality and morphology were analyzed strictly according to the fi fth edition of the World Health Organization laboratory manual for the examination and processing of human semen. Sperm quality and outcomes of IUI were comparatively analyzed between the two groups. Ressuullttss（1）Sperm quality∶ There were no signifi cant differences between two groups in the percent of progressive motility sperm， sperm density， the total number of progresive sperm （89.2±8.5）%， （47.8±14.3）×106/mL， （12.9±6.1）×106in swing-out rotors group and （90.1±8.8）%， （43.4±15.1）×106/mL， （12.9±6.1）×106in fi xed-angle rotors group， P＞0.05）， but there was a signifi cant difference in the percent of normal morphology sperm between the two groups（18.5±8.2）% and （14.2±5.7） %， P＜0.05. （2） Outcomes of IUI. There were no signifi cant differences between the two groups in clinical pregnancy rate， abort ratio and live birth rate （16.5%（30/182）， 3.3%（1/30）， 96.7%（29/30） in swing-out rotors group and 12.4%（21/170）， 9.5%（2/21），90.5%（19/21） in fixed-angle rotors group； P＞0.05） . But there was a significant difference in biochemical pregnancy rate 0%（ 0/30） in swing-out rotors group， 19.2%（5/26） in fi xed-angle rotors group； P＜0.05. ConcluussiioonnDensity gradientcentrifugation with swing-out rotors could reduce the infl uence to sperm normal morphology and decrease the biochemical pregnancy rate.

Key wordsinsemination， artifi cial； centrifugation， density gradient；pregnancy outcome