孫惠君 李 博 陳書強(qiáng) 張亨德 康 彬 蘆 潔 周 晶 董 杰 王曉紅

第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心（西安 710038）

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不同種類精液異常對(duì)輔助生殖臨床結(jié)局的影響*

孫惠君 李 博 陳書強(qiáng) 張亨德 康 彬 蘆 潔 周 晶 董 杰 王曉紅**

第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心（西安 710038）

摘要目的 探討少弱畸精子癥患者結(jié)合單精子卵細(xì)胞漿內(nèi)顯微注射技術(shù)（ICSI）后的臨床結(jié)局及安全性。方法 回顧性分析2014年1月到2015年5月來(lái)我中心行輔助生殖治療的508對(duì)夫婦經(jīng)ICSI助孕后的臨床結(jié)局。排除染色體核型異常、Y染色體微缺失、睪丸發(fā)育異常和FSH水平異常的干擾，根據(jù)精子來(lái)源和精液不同質(zhì)量參數(shù)分為3組：A組，單純梗阻性無(wú)精子癥組，即PESA組；B組，少弱畸精子癥組；C組，嚴(yán)重少弱畸精子癥組。比較3組獲卵數(shù)，正常受精率、卵裂率、可用胚胎率、種植率、妊娠率、生化妊娠率、流產(chǎn)率以及周期活產(chǎn)率等情況。結(jié)果 3組之間受精率、卵裂率、可用胚胎率、臨床妊娠率、生化妊娠率、流產(chǎn)率以及周期活產(chǎn)率沒有明顯差異（P＞0.05）；但與A組相比，B組和C組其種植率顯著降低（40.5 % vs 50.0%，41.6% vs 50.0%，P＜0.01）；B組和C組之間則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（40.5% vs 41.6%，P＞0.05）。結(jié)論 少弱畸精子癥及嚴(yán)重少弱畸精子癥顯著影響胚胎的種植率。

關(guān)鍵詞精子注射， 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；不育， 男性；妊娠率

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.005

少弱畸精子癥是導(dǎo)致男性不育的最常見因素，1992年比利時(shí)Palermo等使用胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）進(jìn)行輔助受精，獲得成功并分娩健康活嬰兒，使得男性因素引起的不孕不育癥治療出現(xiàn)革命性的突破，少弱畸精子癥患者有自己后代的夙愿也得以實(shí)現(xiàn)。ICSI技術(shù)使精卵細(xì)胞結(jié)合無(wú)需經(jīng)歷復(fù)雜的受精過(guò)程，直接將精子注入卵細(xì)胞內(nèi)，形成受精胚胎，由于該技術(shù)對(duì)精子數(shù)量、活力、受精能力的要求極低，只要存在活的精子，ICSI技術(shù)就可以克服與受精失敗相關(guān)的精子形態(tài)、活力及其他方面的缺陷，使自然情況下不能穿過(guò)透明帶、活動(dòng)力差的精子獲得受精、卵裂及妊娠，它是治療重度畸形精子癥以及單純性梗阻性無(wú)精子癥在內(nèi)的男性因素所致不孕的有效手段。但是ICSI使得原本自然選擇情況下無(wú)法出生的胎兒在人為干預(yù)下出生，其對(duì)子代的長(zhǎng)時(shí)程健康隱患值得我們研究探討！本研究納入男性患者均排除染色體核型異常、Y染色體微缺失、睪丸發(fā)育不良等情況，納入女性患者均為生殖檢查無(wú)異?；蛘邌渭冚斅压芤蛩夭辉?，并利用具備正常生精能力的單純性梗阻性無(wú)精子癥患者形態(tài)及活力正常的精子作為對(duì)照，以排除單精子胞漿內(nèi)注射（ICSI）技術(shù)本身的影響，分析少弱畸精子癥患者行輔助生殖的安全性及可靠性。

材料與方法

一、材料

2014年1月到2015年5月在唐都醫(yī)院生殖中心行ICSI-ET助孕的508例患者。根據(jù)精子來(lái)源和精液不同質(zhì)量參數(shù)分為3組：（1）A組經(jīng)皮附睪穿刺吸取少量精子的無(wú)精子癥患者，182個(gè)周期，即PESA組；（2）B組輕度少弱畸精子癥患者，80個(gè)周期；（3）C組同期嚴(yán)重少弱畸精子癥患者，246個(gè)周期。PESA組的診斷納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）至少2次射出精液經(jīng)離心后未見精子；（2）雙側(cè)睪丸總體積＞30mL；（3）睪丸活檢結(jié)果提示生精小管內(nèi)可見各級(jí)生精細(xì)胞及成熟精子，且精子形態(tài)正常；（4）血清FSH值在正常范圍；（5）染色體核型分析及Y染色體微缺失篩查結(jié)果均正常。輕度及重度少弱畸精子癥組的診斷納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）雙側(cè)睪丸總體積＞30mL；（2）診斷符合第五版WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)；（3）血清FSH值在正常范圍；（4）染色體核型分析及Y染色體微缺失篩查結(jié)果均正常。三組的女方均輔助生殖檢查無(wú)異常或者單純輸卵管因素不孕。

（一）G顯帶技術(shù)

用Giemsa染料處理染色體標(biāo)本后，使每條染色體出現(xiàn)深淺交替的橫紋。

（二）Y染色體微缺失分析

以多重PCR為檢測(cè)方法，檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)是否有缺失。

（三）經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)（percutaneouse epididymal sperm aspiration， PESA）

取臥位，常規(guī)消毒外生殖器，鋪巾，20g/L鹽酸利多卡因封閉精索及局部麻醉陰囊皮膚，固定睪丸，用1mL注射器接16G套管針經(jīng)皮刺進(jìn)附睪頭部，持續(xù)低負(fù)壓抽吸附睪液，直至取得略渾濁的附睪液為止。顯微鏡下尋找活動(dòng)的成熟精子，如未獲得精子或無(wú)活動(dòng)精子，行重復(fù)穿刺或?qū)?cè)附睪穿刺。B組和C組手淫取精，采用上游法或Isolate梯度法處理精液。PESA 術(shù)后口服抗生素治療 1 周，禁止性生活 2 周，2 周后復(fù)查了解睪丸或附睪恢復(fù)情況。

（四）精液的處理

丈夫禁欲3d，在取卵后1～3h B組和C組手淫獲得精液，完全液化后按世界衛(wèi)生組織第五版WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)評(píng)價(jià)精液參數(shù)。采用上游法或Isolate梯度法處理精液。

一是拍完一個(gè)視頻后馬上在手機(jī)上觀看，覺得不滿意就立即重新拍攝，因?yàn)闇?zhǔn)備實(shí)驗(yàn)儀器、器材和試劑等要花很長(zhǎng)時(shí)間，所以拍攝后要立即檢查、重拍；二是拍攝儀器上的屏幕時(shí)最好不采用高清模式，因?yàn)樵诟叻直媛氏嘛@示屏上的數(shù)字會(huì)快速閃爍，看不清楚；三是如果儀器帶有拍攝系統(tǒng)的話就盡量使用儀器的自拍系統(tǒng)拍成照片，然后將照片導(dǎo)入視頻中。

（五）超促排卵方案

短效長(zhǎng)方案，促性腺激素（Gn）治療周期的前1個(gè)月經(jīng)周期的黃體中期皮下注射短效促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa）（0.05 mg/d或者1.00mg/d），月經(jīng)周期3～5 d，開始肌注Gn，當(dāng)卵泡發(fā)育成熟后，肌注人絨毛膜促性腺激素（hCG）10 000 IU誘發(fā)排卵，36 h后B超介導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。

（六）臨床資料以及檢測(cè)指標(biāo)的評(píng)價(jià)

采集患者的年齡，不孕年限，獲卵數(shù)，HCG日子宮內(nèi)膜厚度，HCG日E2水平，Gn使用天數(shù)，Gn使用總量，正常受精率，卵裂率，可用胚胎率，種植率，妊娠率，生化妊娠率，流產(chǎn)率，以及周期活產(chǎn)率。采取本中心常規(guī)體外受精-胚胎移植超排卵方案及卵胞漿單精子顯微注射技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室操作。成熟卵子：即MII卵子。正常受精：培養(yǎng)16～18h后觀察患者所有的授精卵子受精情況，將觀察到兩原核的受精卵定義為正常受精卵（2PN），將單原核（IPN）和多原核（全3PN）的受精卵定義為異常受精卵。種植：以移植后15d血HCG陽(yáng)性為診斷標(biāo)準(zhǔn)。臨床妊娠：取卵72h選擇胚胎移植，移植1～3個(gè)較好胚胎，然后肌肉注射黃體酮或陰道用雪諾酮進(jìn)行黃體支持。移植15d后查血尿HCG陽(yáng)性，移植5周后B超檢查發(fā)現(xiàn)胚囊、胎芽及胎心搏動(dòng)，則診斷為臨床妊娠。若宮內(nèi)胚胎存活＞3個(gè)，則實(shí)施減胎術(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包（SPSS）進(jìn)行x2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、遺傳學(xué)檢測(cè)

患者均進(jìn)行G顯帶核型分析和Y染色體微缺失分析。本研究納入患者均為染色體核型正常者，排除Y染色體微缺失，以避免對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

二、各組一般情況

A組共182例，182個(gè)周期，取精方式為經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù)（percutaneouse epididymal sperm aspiration， PESA），精液來(lái)源為新鮮精液。B組共80例，80個(gè)周期，取精方式為手淫，精液來(lái)源為新鮮精液。C組共246例，246個(gè)周期，取精方式為手淫，精液來(lái)源為新鮮精液。3組在雙方年齡上和不孕年限方面無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1　3組患者一般臨床情況比較（±s）

表1　3組患者一般臨床情況比較（±s）

年齡（歲）組別　　周期數(shù)　　女方　　男方年齡（歲）不孕年限（年）A　182　27.95±3.51　30.12±4.54　3.76±2.57 B　80　28.40±2.39　31.08±3.65　4.25±2.15 C　246　28.39±3.34　30.75±4.47　4.07±2.57

三、各組的促排卵及移植前臨床情況比較

3組在Gn使用天數(shù)、Gn使用劑量、HCG日子宮內(nèi)膜的厚度、HCG日雌激素水平、獲卵數(shù)及移植胚胎數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

表2　3組患者促排卵基本臨床信息比較（±s）

表2　3組患者促排卵基本臨床信息比較（±s）

組別　Gn使用天數(shù)　Gn使用劑量　　移植日內(nèi)膜厚度　　移植日E2　　獲卵數(shù)（n）　　移植胚胎數(shù) （n）A 10.57±1.65　25.67±12.35　1.05±0.15　3487±1135.28　13.05±4.41　1.98±028 B 11.08±2.34　27.65±14.47　1.03±0.15　3230±1319.93　11.56±4.09　1.98±0.27 C 10.60±1.83　25.47±12.80　1.06±0.16　3380±1200.19　13.04±4.52　1.97±0.33

四、各組治療結(jié)果對(duì)比

3組共獲得5 589枚卵子，對(duì)其進(jìn)行ICSI顯微操作，A組有1655枚受精卵受精，種植胚胎180個(gè)，周期妊娠數(shù)126個(gè)；B組有652枚受精卵受精，種植胚胎64個(gè)，周期妊娠數(shù)44個(gè)；C組有2306枚受精卵受精，種植胚胎202個(gè)，周期妊娠數(shù)170個(gè)。3組的受精率，卵裂率，可用胚胎率，臨床妊娠率，生化妊娠率，流產(chǎn)率，周期活產(chǎn)率沒有明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。B組和C組分別與A組相比，其種植率均顯著低于A組（P＜0.01）。B組和C組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表3。

表3　3組患者臨床妊娠結(jié)局比較

討 論

1992年世界首例ICSI誕生后［1］，經(jīng)過(guò)20年的發(fā)展，ICSI技術(shù)操作已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化。如前所述，ICSI技術(shù)為少弱畸精子癥患者帶來(lái)福音的同時(shí)也為其子代帶來(lái)安全隱患。

精子的表觀遺傳修飾在精子的發(fā)生及胚胎發(fā)育過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用［2-4］。研究表明，男性不孕癥患者的精子往往存在表觀遺傳修飾的異常，特別是印記基因印記的異常［5］。我們前期的研究結(jié)果也顯示，少精子癥患者精子印記基因H19印記控制區(qū)域DNA甲基化水平顯著降低，且降低水平與精子濃度顯著負(fù)相關(guān)［6］。而精子表觀遺傳修飾的異?？梢詡鞒薪o子代，對(duì)子代的健康產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程的影響［7， 8］。因此在臨床上，少弱畸精子癥患者雖然可以通過(guò)ICSI技術(shù)成功受孕，但其是否將異常的表觀遺傳修飾遺傳給子代，并對(duì)子代產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程健康的影響，一直是生殖醫(yī)學(xué)專家們關(guān)注的話題。

本研究重點(diǎn)討論了少弱畸精子癥對(duì)輔助生殖臨床結(jié)局的影響。為了排除染色體核型、Y染色體微缺失、FSH水平異常、睪丸發(fā)育異常等情況對(duì)精子發(fā)生及臨床結(jié)局的影響，本研究所納入男性患者均排除這些因素異常的干擾，同時(shí)女性患者納入標(biāo)準(zhǔn)為生殖檢查無(wú)異?；蛘邌渭冚斅压芤蛩夭辉?。鑒于ICSI是侵入性操作，為了避免不同受精方式對(duì)結(jié)果分析的影響，本研究利用單純性梗阻性無(wú)精癥患者做對(duì)照，且單純性梗阻性無(wú)精子癥患者取精部位為附睪頭，獲取的精子活力及形態(tài)均正常。本研究結(jié)果表明，少弱畸精子癥，重度少弱畸精子癥與單純性梗阻性無(wú)精癥相比，其受精率，卵裂率，可用胚胎率，妊娠率，生化妊娠率，流產(chǎn)率及周期活產(chǎn)率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。雖然三組之間流產(chǎn)率沒有顯著差異，但是與PESA組相比，少弱畸精子癥組和重癥少弱畸精子癥組流產(chǎn)率有增加的趨勢(shì)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)與PESA組相比，少弱畸精子癥組與重癥少弱畸精子癥組胚胎植入率顯著降低（P＜0.05），但少弱畸精子癥與重癥少弱畸精子癥組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

對(duì)于單純性梗阻性無(wú)精子癥患者，在其附睪頭部，可以穿刺取到形態(tài)及活力正常的精子，對(duì)其進(jìn)行顯微外科精道重建后，70%～100%的患者可以在精液中找到精子［9， 10］，20%～50%的夫婦能成功自然受孕［11］，說(shuō)明單純性梗阻性無(wú)精子癥患者存在正常的生精能力。報(bào)道表明，生精能力異常的男性不育患者精子DNA甲基化模式與正常生育男性精子存在顯著差異［12，13］。與我們前期研究類似，有文獻(xiàn)［14］報(bào)道少弱畸精子癥患者，尤其是重度少弱畸精子癥患者的精子存在父源性印記基因H19印記水平的異常［15］。 H19基因是父源印記母源表達(dá)的印記基因，在人和小鼠胚胎期廣泛表達(dá)，參與了胚胎的正常生長(zhǎng)、發(fā)育及小兒的行為發(fā)展［16］。在男性胎兒宮內(nèi)發(fā)育時(shí)期，原始生殖細(xì)胞印記基因H19的甲基化印跡在妊娠11周時(shí)被擦除，但在出生前，精原細(xì)胞的H19印記已經(jīng)重新建立，并在出生后個(gè)體精子發(fā)生的不同階段得以維持［17， 18］。由此推測(cè) DNA甲基化是男性生精過(guò)程中基因表達(dá)的重要調(diào)控方式之一，DNA甲基化異常可能導(dǎo)致生精的異常。印記基因異常的精子可能會(huì)影響胚胎的質(zhì)量，而高質(zhì)量的胚胎是成功植入最重要的因素之一［19］。根據(jù)報(bào)道， H19 印記的丟失和胚胎反復(fù)自發(fā)流產(chǎn)相關(guān)，而與其它印記基因位點(diǎn)的印記水平及總體DNA甲基化水平不相關(guān)［20，21］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，與PESA組相比，少弱畸精子癥組和重癥少弱畸精子癥組種植率顯著下降，而且流產(chǎn)率增加，這很可能是由于少弱畸精子癥患者精子異常的表觀遺傳修飾影響了胚胎的質(zhì)量所致。

我們的研究結(jié)果表明，盡管嚴(yán)重少弱畸精子癥患者結(jié)合ICSI技術(shù)可以有效的幫助不孕夫婦獲得臨床妊娠，但會(huì)顯著降低胚胎的植入率。這提示我們少弱畸精子癥精子由于存在表觀遺產(chǎn)學(xué)的異常，從而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局，所以今后臨床上我們要加強(qiáng)男科實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)的質(zhì)量控制［22］、建立篩選優(yōu)良精子的新方法、新指標(biāo)以及聯(lián)合用藥積極治療少弱畸精子癥［23］，以改良少弱畸精子癥患者妊娠結(jié)局以及減少其后代長(zhǎng)時(shí)程健康風(fēng)險(xiǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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22劉競(jìng)， 劉睿智. 男科實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)的質(zhì)量控制. 中國(guó)男科學(xué)雜志 2009； 23（7）∶67-69，72

23張建國(guó)， 薛宗勇， 王蓓玲，等. 聯(lián)合用藥治療少弱精子癥∶附113例報(bào)告. 中國(guó)男科學(xué)雜志 2006； 20（11）∶ 43-45

（2015-10-18收稿）

中圖分類號(hào)R 698.2

*基金項(xiàng)目資助：國(guó)家自然科學(xué)基金（81370710，81300531）和唐都醫(yī)院科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2013CXTS015）

Effect of Different Types of Abnormal Sperm on The Outcome of Assisted Reproductive Clinical

Sun Huijun，Li Bo，Chen Shuqiang，Zhang Hengde，Kang Bin，Lu Jie，Zhou Jing，Dong Jie，Wang Xiaohong**
Department of Reproductive Medicine Center ，Tangdu Hospital of The Fourth Military Medical University ，Xi'an 710038 Corresponding author∶ Wang Xiaohong， E-mail∶ wangxh-99919@163.com

AbstractObjectiveTo investigate the effi cacy and security of oligoasthenoterazoospermia in assisted reproductive medicine. MethodssClinical outcomes of 428 couples who underwent ICSI from 1st January 2014 to 31st May 2014 were retrospectively analyzed. Excluding factors such as abnormal chromosome karyotype， Y chromosomal microdeletions，abnormal testicular development and abnormal FSH level， the patients were divided into 3 groups based on the source and the parameters of sperms， including Group A（obstructive azoospermia）， group B（oligoasthenoterazoospermia） and group C（severe oligoasthenoterazoospermia）. The fertilization rate， embryo cleavage rate， available embryo rate， embryo implantation rate， clinical pregnancy rate， biochemical pregnancy rate， abortion rate and live delivery rate were compared between the 3 groups. RessuullttssNo significant differences were observed in fertilization rate， embryo cleavage rate，available embryo rate， clinical pregnancy rate， biochemical pregnancy rate， abortion rate and live delivery rate （P＞0.05）among three groups. As compared with that of the group A， the embryo implantation rates of group B and group C were significantly decreased （50.0% vs. 40.5%， 50.0% vs. 41.6%， respectively， P＜0.01）. No significant difference was observed between group B and group C （40.5% vs. 41.6%，P＞0.05）. Conclusion Oligoasthenoterazoospermia and severe oligoasthenoterazoospermia signifi cantly affect the embryo implantation rate.

Key wordssperm injections， intracytoplasmic； infertility，male； pregnancy rate

**通訊作者， E-mail：wangxh-99919@163.com