趙輝

（菏澤醫(yī)學專科學校，山東 菏澤 274000）

牛蒡子對高糖刺激大鼠系膜細胞增殖作用的機制研究

趙輝

（菏澤醫(yī)學專科學校，山東 菏澤 274000）

目的 探討牛蒡子對高糖刺激的大鼠系膜細胞（GMC）增殖的影響。方法 大鼠GMC與牛蒡子(100μ mol/L、10μ mol/L)培養(yǎng)48 h后，采用MTT法檢測系膜細胞的增殖情況；ELISA法檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的分泌水平；實時定量PCR方法檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板衍生性生長因子（PDGF）mRNA的表達。結(jié)果 牛蒡子顯著抑制高糖誘導的GMC增殖，降低TGF-β1的分泌，降低VEGF和PDGF mRNA的表達。結(jié)論 牛蒡子可以顯著抑制高糖誘導的GMC增殖，該作用可能與降低TGF-β1、VEGF和PDGF的表達有關(guān)。

牛蒡子；轉(zhuǎn)化生長因子β1；血管內(nèi)皮生長因子；血小板衍生性生長因子

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 大鼠GMC，購自武漢大學細胞培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640、MTT、DMSO：美國Gibco公司；引物：上海博尚生物有限公司；TGF-β1試劑盒：武漢博士德生物有限公司；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒：TaKaRa Bio公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 GMC在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，2 d傳代一次，取對數(shù)期細胞用于實驗。將細胞分為四組，即陰性對照組(含葡萄糖5.4 mmol/L)、高糖組(含葡萄糖30.0 mmol/L)、牛蒡子高濃度組(含牛蒡子100μ mol/L，葡萄糖30.0 mmol/L)、牛蒡子低濃度組(含牛蒡子10μ mol/L，葡萄糖30.0 mmol/L)。

1.2.2 MMT法檢測GMC增殖 取對數(shù)期的GMC，置于96孔板中，按照1.2.1中要求分組，每組設(shè)6個副孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μ l MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μ l DMSO，輕輕震蕩10 min，使用酶標儀測定490 nm處各孔的吸光度值(OD值)，檢測GMC增殖情況。

1.2.3 ELISA法檢測細胞上清液中TGF-β1的含量取對數(shù)期的GMC，置于24孔板中，按照2.1中要求分組，每組設(shè)6個副孔，培養(yǎng)48 h后，離心收集上清液，按照ELISA試劑盒操作說明書檢測TGF-β1的含量。

1.2.4 PCR法檢測細胞中VEGF和PDGF mRNA的表達 取對數(shù)期細胞，置于6孔板中，按照1.2.1中要求分組，每組設(shè)3個副孔，培養(yǎng)48 h后，后收集細胞加1 ml Trizol提取細胞總RNA，紫外分光光度計測RNA純度。按cDNA合成試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后。以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，按SYBRGreen熒光染料試劑盒說明進行PCR擴增反應(yīng)。

VEGF的上游引物序列為5′-CCGCTCTCTTGGGTGCACTGG-3′，下游引物序列為5′-ATCCGGCTTGGCTTGTCGCGA-3′;產(chǎn)物200 bp。

QCS003C教學實驗臺適用于各高等院校、各中等專業(yè)技術(shù)學校金屬切削機床液壓傳動課程的教育實驗。同樣適合于各工人大學培養(yǎng)專門液壓技術(shù)人員及科研單位作為液壓教學和研究使用。

PDGF的上游引物序列為5’-GGGAATACTGCTCACAGAG-3’，下游引物序列為 5’-CGATACAAAATAGCACTTCGG-3’;產(chǎn)物394bp。

GAPDH的上游引物序列為5’–TGCTAGCACCATGAAGACG-3’，下游引物序列為5’–TAACGCAGCTCAGTAACCA-3’，產(chǎn)物212bp。

記錄每孔Ct值，并采用△△CT法對結(jié)果進行定量分析△△Ct=[Ct（實驗組基因）-CtGAPDH（實驗組基因）]-[Ct（對照組基因）-CtGAPDH（對照組基因）]。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析、t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡子對高糖培養(yǎng)的GMC增殖的影響 培養(yǎng)48h后，高糖組與對照組相比，GMC明顯增殖，加入EPA后，GMC的數(shù)量顯著降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性，見表1。

表1 對高糖培養(yǎng)的GMC增殖的影響

表1 對高糖培養(yǎng)的GMC增殖的影響

與對照組比較，*P＜0.0005；與HG組比較，#P＜0.0005；不同濃度牛蒡子比較，※P＜0.005。

組別 n 濃度/(μ mol/L) OD正常組 6 - 0.42±0.01高糖組 6 - 0.70±0.03*高糖+牛蒡子組 6 10 0.63±0.03*#高糖+牛蒡子組 6 100 0.52±0.04*#※

2.2 牛蒡子對高糖培養(yǎng)的GMC TGF-β1分泌的影響培養(yǎng)48 h后，高糖組與對照組相比，細胞上清液中TGF-β 1的分泌量顯著升高（P＜0.05），加入EPA后，細胞上清液中TGF-β1的分泌量顯著降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性，見表2。

表2 對高糖培養(yǎng)的GMC TGF-β1分泌的影響

表2 對高糖培養(yǎng)的GMC TGF-β1分泌的影響

與對照組比較，*P＜0.0005，△P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.01，☆*P＜0.001；不同濃度牛蒡子比較，◇P＜0.05。

組別 n 濃度/(μ mol/L) TGF-β1（ng/ml）正常組 6 - 0.44±0.04高糖組 6 - 0.57±0.03*高糖+牛蒡子組 6 10 0.53±0.02*#高糖+牛蒡子組 6 100 0.49±0.04△☆◇

2.3 牛蒡子對高糖培養(yǎng)的GMC VEGF和PDGF表達的影響 培養(yǎng)48 h后，高糖組與對照組相比，GMC VEGF和PDGF mRNA的表達增加（P＜0.05），加入EPA后，GMC VEGF和PDGF mRNA的表達明顯降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性，見表3。

表3 對高糖培養(yǎng)的GMC VEGF和PDGF mRNA表達的影響

表3 對高糖培養(yǎng)的GMC VEGF和PDGF mRNA表達的影響

與對照組比較，*P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.05。

組別 n 濃度/(μ mol/L) VEGF PDGF正常組 6 29.96±0.33 25.66±0.49高糖組 6 33.35±1.04* 27.00±0.49*高糖+牛蒡子組 6 10 32.2±0.25# 26.13±0.19#高糖+牛蒡子組 6 100 31.4±0.18# 25.29±0.14#

3 討論

DN即是糖尿病嚴重而常見的微血管并發(fā)癥，又是其死亡的主要原因。DN的發(fā)生過程中主要的病理變化是腎小球基底膜增厚和系膜外基質(zhì)增多，導致腎小球硬化和腎功能衰竭。GMC是腎小球中最活躍的細胞，能合成分泌多種細胞因子，在腎小球病的發(fā)生中處于重要地位[3]。高糖可以通過激活活性氧、糖基化終末產(chǎn)物、血管緊張素等途徑，促進系膜細胞分泌細胞因子，其中包括TGF-β1、VEGF和PDGF[4]。

TGF-β1屬于多肽鏈組成的二聚體，是由多種細胞分泌的的多肽生長因子，廣泛存于腎臟中，參與腎小球細胞增殖、分化和凋亡等過程[5]。VEGF可以促進血管內(nèi)皮細胞增生及誘導血管生成，參與DN早期蛋白尿產(chǎn)生和系膜細胞增殖，目前已成為研究熱點[6]。PDGF作為多種因素導致腎臟損傷共同的重要中介,與腎小球系膜細胞增殖、腎小球細胞外基質(zhì)蛋白積聚密切相關(guān),也與腎小球硬化密切相關(guān)[7]。

牛蒡子是從菊科草本植物牛蒡的干燥的成熟果實中提取分離而來的木脂素化合物。研究表明牛蒡子除了抗病毒、抗腫瘤作用外，還能通過抗炎、抗免疫發(fā)揮腎臟保護作用[8,9]。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下培養(yǎng)48 h，RMC增殖明顯。而牛蒡子可以抑制高糖環(huán)境下GMC的增殖，且濃度越高，抑制作用越強。本實驗還發(fā)現(xiàn)，牛蒡子還可以抑制高糖環(huán)境引起的TGF-β1、VEGF和PDGF的表達增加，且濃度越高，抑制作用越強。這些結(jié)果顯示，牛蒡子可抑制高糖誘導GMC增殖，保護腎臟，該作用可能與下調(diào)TGF-β1、VEGF和PDGF的表達有關(guān)。

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Effects of Arctium on Proliferation of High Glucose Stimulated Rat Glomerular Mesangial Cell

Zhao Hui

（Heze Medical College，Heze 274000,Shandong）

ObjectiveTo investigate the effects of arctium on Proliferation of highglucose stimulated rat glomer?ular mesangial cell.MethodsGMC were incubated with arctium(100μ mol/L、10μ mol/L)for 48 hours,the Prolifera?tion of rat glomerular mesangial cell was measured by MTT method,the secretion of TGF-β1was measured by ELISA method,and the expression of VEGF and PDGF mRNA was measured by real-time PCR method.ResultsArctium could decrease the the Proliferation of rat glomerular mesangial cell,TGF-β1secretion,VEGF and PDGF mRNA ex?pression by high glucose stimulated rat glomerular mesangial cell.ConclusionThe arctium can decrease the the Prolif?eration of rat glomerular mesangial cell by reducing the expression of TGF-β1,VEGF and PDGF.

Burdock;Transforming growth factor-β1;Vascular endothelial growth factor;Platelet-derived growth factor

R285.5

A

1008-4118（2016）03-0012-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.03.004

2016-07-14