申云霞，趙艷麗，張 霽，金 航，王元忠*

1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200 2.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500

不同采收期滇龍膽的紅外光譜鑒別研究

申云霞1, 2，趙艷麗1，張 霽1，金 航1，王元忠1*

1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200 2.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500

采收是中藥生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，采收時(shí)間直接影響中藥質(zhì)量和產(chǎn)量，是中醫(yī)臨床安全有效用藥的前提，開展中藥適時(shí)采收期的研究具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。采用傅里葉變換紅外光譜法對(duì)72份不同采收期的滇龍膽進(jìn)行鑒別研究，用TQ8.0軟件對(duì)原始光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)(first derivative, FD)、二階導(dǎo)數(shù)(second derivative, SD)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量(standard normal variate, SNV)、多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)和平滑(savitaky-golay filter, SG)預(yù)處理，樣品按3∶1分為校正集和預(yù)測(cè)集，同時(shí)建立主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least square discriminant analysis, PLS-DA)模型。結(jié)果顯示，選取1 800～600 cm-1波段范圍的光譜，去除光譜噪音； SNV結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)光譜和SG(15, 3)平滑，預(yù)處理結(jié)果滿意。主成分分析表明，前三個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率為92.47%，5月、9月和10月份采收的樣品差異較小。偏最小二乘判別分析建立判別模型，決定系數(shù)R2和校正均方根誤差(RMSEE)分別為0.967 8和0.086 0，可對(duì)18個(gè)預(yù)測(cè)集樣品進(jìn)行準(zhǔn)確分類。紅外光譜法結(jié)合主成分分析、偏最小二乘判別分析對(duì)不同采收期滇龍膽的分類和判別效果較好，為不同采收期的中藥鑒別提供理論依據(jù)。

滇龍膽； 不同采收期； 傅里葉變換紅外光譜； 主成分分析； 偏最小二乘判別分析

引 言

中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)是中藥研究、應(yīng)用及發(fā)展的熱點(diǎn)及難點(diǎn)[1]。品種、產(chǎn)地、采收加工、炮制和制劑工藝是影響中藥品質(zhì)的重要因素，同時(shí)影響其藥性和藥效[2]。中藥規(guī)范化生產(chǎn)有利于確保中藥材、飲片、中成藥質(zhì)量的穩(wěn)定和用藥的安全有效。采收加工是中藥生產(chǎn)的源頭，合理采收對(duì)中藥材質(zhì)量與產(chǎn)量具有一定影響，是中藥產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)質(zhì)量穩(wěn)定、可控的重要前提[3]。

近年來，適時(shí)采收對(duì)中藥質(zhì)量的影響備受關(guān)注。研究表明，白術(shù)的收獲期以摘蕾前五月下旬到六月上旬為宜，此時(shí)白術(shù)內(nèi)酯含量最高[4]。前胡在12月份到翌年2月份，香豆素類成分含量達(dá)到最高階段，與傳統(tǒng)采收時(shí)間相吻合[5]。不同采收期香加皮中4-甲基水楊醛的含量差異較大，夏季的平均含量最高位0.71%，春、秋兩季的含量分別為0.22%和0.39%，夏季為最佳采收期，與傳統(tǒng)香加皮采收期為春、秋兩季有差別[6]。不同采收期的美花石斛多糖含量存在差異，九月到次年一月多糖含量相對(duì)較高[7]。金銀花的最佳采收期為“二白”和“大白”期采摘，此時(shí)綠原酸和木犀草苷含量最高[8]。水紅花子的最佳采摘期為十月中旬，此時(shí)槲皮素的含量最高，為0.697 mg.g-1[9]。因此，對(duì)中藥采收期的研究具有重要意義。

滇龍膽(GentianarigescensFranch.)為龍膽科植物，是治療肝膽疾病常用中藥[10]。沈濤等[11]采用高效液相色譜法對(duì)不同采收期、不同部位的滇龍膽進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同部位的樣品所含萜類物質(zhì)具有差異，9月—11月為其最佳采收期。目前，主要以單一指標(biāo)成分及藥用部位的產(chǎn)量作為中藥的采收期評(píng)價(jià)指標(biāo)，由于地域、生產(chǎn)環(huán)境的差異，難以客觀地對(duì)中藥采收期進(jìn)行評(píng)價(jià)。紅外光譜法具有特征性強(qiáng)、快速、無損和簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能夠反映樣品化學(xué)成分整體信息，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物[12-13]、食品[14-17]及中藥[18-19]的鑒定及質(zhì)量分析。本實(shí)驗(yàn)采用傅里葉紅外光譜法結(jié)合主成分分析和偏最小二乘判別分析法對(duì)不同采收期滇龍膽進(jìn)行研究，取得滿意的結(jié)果，以期為其合理采收和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

樣品采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所種質(zhì)資源圃，于2008年4月播種，2009年3—10月，每月采收9份樣品，共72份。經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所金航研究員鑒定為滇龍膽根及根莖。在50 ℃條件下烘48 h，粉碎過100目篩，備用。樣品采集時(shí)間和編號(hào)見表1。

表1 滇龍膽樣品信息

1.2 儀器與設(shè)備

Perkin-Elmer Fronter型傅里葉紅外光譜儀，DTGS檢測(cè)器，光譜范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，信號(hào)累加掃描16次。壓片機(jī)為YP-2(上海山岳科學(xué)儀器儀器公司)。KBr為分析純，購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.3 方法

取樣品與KBr粉末(1∶100)混合研磨均勻，壓制成透明薄片，放入紅外光譜儀中測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定三次，計(jì)算平均光譜。紅外光譜采集過程中室溫保持在23 ℃，空氣相對(duì)濕度保持在40%～48%。

1.4 光譜及數(shù)據(jù)處理

所有原始光譜數(shù)據(jù)用Nicolet Omnic8.0軟件進(jìn)行基線校正、歸一化預(yù)處理； 用TQ8.0軟件進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)(FD)、二階導(dǎo)數(shù)(SD)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正(SNV)、多元散射校正(MSC)、savitaky-golay filter平滑(SG)預(yù)處理，并進(jìn)行主成分分析(PCA)。SIMCA-P+11.0軟件用于建立偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型。

1.5 方法學(xué)考察

精密度實(shí)驗(yàn)：取同一份滇龍膽樣品，參照1.3測(cè)定方法，連續(xù)測(cè)定5次，獲得5個(gè)紅外光譜圖，計(jì)算圖譜間的相似度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一份樣品，參照1.3測(cè)定方法，每隔一個(gè)小時(shí)測(cè)定一次，共測(cè)5次，計(jì)算圖譜間的相似度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：取一份樣品，平行制備5個(gè)樣品片，分別測(cè)定，計(jì)算圖譜間的相似度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性考察結(jié)果表明，圖譜間相似度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.03%，0.98%和0.24%； 該方法可靠、重復(fù)性和穩(wěn)定性強(qiáng)。

2.1 滇龍膽光譜特征

根據(jù)1.3中實(shí)驗(yàn)方法，掃描72份樣品的傅里葉紅外光譜，所得光譜如圖1和圖2所示，滇龍膽不同采收季節(jié)的原始圖譜特征峰相似，難以從圖譜進(jìn)行鑒別，需要采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。

圖1 滇龍膽的傅里葉變換紅外光譜

圖2 滇龍膽的二階導(dǎo)數(shù)光譜

2.2 光譜預(yù)處理結(jié)果

紅外光譜在測(cè)定過程中，受樣品粒度、光的散射和儀器響應(yīng)等因素的影響，產(chǎn)生噪音和光譜的基線漂移； 適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方法，可以提高光譜的分辨率、有效消除基線漂移和噪聲[20]。表2顯示，選取1 800～600 cm-1波段范圍內(nèi)的光譜，主成分?jǐn)?shù)為10的條件下，經(jīng)SNV+SD+SG(15, 3)預(yù)處理后對(duì)樣品的誤判數(shù)最少，變量特征的解釋能力為96.6%，該方法可用于模型的建立。

表2 不同預(yù)處理方法的結(jié)果(主成分?jǐn)?shù)為10)

2.3 主成分分析

主成分分析是一種數(shù)據(jù)降維方法，將多個(gè)相關(guān)變量簡(jiǎn)化為少數(shù)幾個(gè)不相關(guān)變量的多元統(tǒng)計(jì)分析方法[21]。選用2.2中最優(yōu)預(yù)處理方法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，前三個(gè)主成分分別為65.32%, 22.01%, 5.14%，累積貢獻(xiàn)率大于90%，包含了原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息和樣本的聚類信息。PC1, PC2和PC3得分散點(diǎn)圖見圖3，樣品按采收期的差異分為八類，在散點(diǎn)圖上的位置與實(shí)際有一定的相關(guān)性。5月、9月和10月采收的樣品空間分布較相近，形成一個(gè)聚集區(qū)域，即此時(shí)采收的樣品差異較小，與藥典規(guī)定的春、秋兩季采挖相符[10]； 7月采集的樣品離散程度較大，8月采集的樣品距離其他樣品較遠(yuǎn)，顯示出較大的差異性。

圖3 不同采收期滇龍膽樣品的主成分得分圖

2.4 偏最小二乘判別分析建立與驗(yàn)證

2.4.1 異常值的檢測(cè)

儀器的噪聲、基線漂移和測(cè)定條件改變等因素會(huì)產(chǎn)生異常光譜，利用傅里葉紅外光譜數(shù)據(jù)建模時(shí)，異常樣品的存在會(huì)影享模型的穩(wěn)健性。利用SIMCA-P+11.0軟件Hottelling T2控制圖對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測(cè)，若樣品超出99%的置信區(qū)間，即判定為異常樣品。圖4為72個(gè)樣品的異常值檢測(cè)結(jié)果，除友4個(gè)樣品在95%～99%置信區(qū)間內(nèi)，剩余樣品均在95%的置信區(qū)間，表明沒有異常樣品需要剔除。

2.4.2 PLS-DA模型的建立

PLS-DA方法是基于PLS建立的樣本分類變量與傅里葉紅外光譜特征間的回歸模型。在進(jìn)行光譜預(yù)處理和異常值檢驗(yàn)之后，選取2.2中經(jīng)SNV+SD+SG(15, 3)預(yù)處理的光譜對(duì)訓(xùn)練集樣品建立偏最小二乘判別模型，前三個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為80.68%，R2為0.967 8，校正均方根誤差(RMSEE)為0.086，表明模型具有良好的預(yù)測(cè)能力。由圖5所示，建立的模型將樣品根據(jù)不同采收期分為8類，3月、5月、9月和10月份采集的樣品在空間分布上較相近，即所含的化學(xué)成分具有相似性。圖6顯示了所建立的模型對(duì)八個(gè)不同采集時(shí)間的滇龍膽樣品光譜數(shù)據(jù)的累積貢獻(xiàn)能力(R2Y(cum))和模型的預(yù)測(cè)能力(Q2Y(cum))，R2Y(cum)值均大于95.59%，Q2Y(cum)值均大于83.10%，適用于樣品的鑒別。

圖4 樣品異常值檢測(cè)

圖5 滇龍膽的偏最小二乘判別分析結(jié)果

圖6 不同采收期滇龍膽的累計(jì)貢獻(xiàn)率和預(yù)測(cè)率

2.4.3 PLS-DA模型的驗(yàn)證

將建立好的判別模型用于驗(yàn)證，隨機(jī)選取18份樣品作為驗(yàn)證集，對(duì)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行判定。即考察預(yù)測(cè)值Ypre與偏差Ydev，判定準(zhǔn)則為：(1)當(dāng)Ypre>0.5，Ydev<0.5，判定樣品屬于該類； (2)當(dāng)Ypre<0.5，Ydev<0.5，判定樣品不屬于該類； (3)Ydev>0.5，判定不穩(wěn)定[22]。結(jié)果如表3所示，根據(jù)判別準(zhǔn)則，建立的判別模型能對(duì)18份驗(yàn)證集樣品進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。

表3 驗(yàn)證集的偏最小二乘判別分析結(jié)果

注：Ypre為預(yù)測(cè)值，Ydev為偏差

Note:Ypreis predictive value，Ydevis doviation

3 結(jié) 論

采集不同采收期滇龍膽的傅里葉變換紅外光譜，考察樣品的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法穩(wěn)定和可靠。用TQ8.0軟件對(duì)所有原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，選取1 800～600 cm-1光譜波段，采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)法及SG平滑預(yù)處理，建立主成分分析模型，前三個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為92.47%，能夠反映原始數(shù)據(jù)的大部分信息，顯示滇龍膽樣品成分之間的相關(guān)性，不同采收期樣品在空間中離散分布，其中5月、9月和10月采收的樣品在空間分布較近，即所含化學(xué)成分相似性較高，與藥典規(guī)定的春、秋兩季采挖相符。為了對(duì)樣品準(zhǔn)確鑒別，利用SIMCA-P+11.0軟件，選擇預(yù)處理后的光譜，建立PLS-DA模型，根據(jù)經(jīng)累積貢獻(xiàn)能力、R2和RMSEE對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估，表明模型的穩(wěn)定性較好。所建立的模型對(duì)驗(yàn)證樣品的準(zhǔn)確識(shí)別率為100 %； 與目前沿用的以藥用部位單一指標(biāo)性活性成分結(jié)合生物產(chǎn)量的采收期確定方法相比，F(xiàn)TIR具有簡(jiǎn)便、無損、真實(shí)宏觀及反應(yīng)樣品綜合信息等優(yōu)點(diǎn)，為快速鑒別中藥不同采收期提供參考。

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(Received Dec.19, 2014; accepted Apr.15, 2015)

*Corresponding author

Study on the Discrimination of FTIR Spectroscopy ofGentianaRigescenswith Different Harvest Time

SHEN Yun-xia1, 2, ZHAO Yan-li1, ZHANG Ji1, JIN Hang1, WANG Yuan-zhong1*

1.Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650200, 2.College of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China

The harvest time of traditional Chinese medicine (TCM) is a very essential part for the production and quality of TCM which is the prerequisite for safe and effective clinical use of TCM.It is of great importance to carry out the research of timely harvest time of TCM.With Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) to study harvest time of Seventy-twoGentianaRigescenssamples.First derivative, second derivative, standard normal variate, multiplicative scatter correction and Savitaky-Golay(15,3) smoothing of all original spectra were pretreated with TQ8.0 software.Samples were divided into calibration set and prediction set at the ratio of 3∶1.Principal component analysis (PCA) and partial least square discriminant analysis (PLS-DA) model were established.The result indicated that after removing noise spectrum, the spectra range was from 1 800 to 600 cm-1, the method SNV combined with SD and SG present the best result of spectra pretreatment.The contribution rates of first three principal components were 92.47% with PCA.Small differences were found for the samples harvested in May, September and October.Same spectrum range was chosen and PLS-DA was applied to establish the model.TheR2and RMSEE were 0.967 8, 0.086 0, respectively, and the prediction accuracy is 100%.The methods of PCA and PLS-DA have good ability to classify and identify different harvest time ofGentianaRigescens.It provided a basis for the identification of different harvest time of TCM.

Gentianarigescens; Different harvest seasons; Fourier transform infrared spectroscopy; Principal component analysis; Partial least square discriminant analysis

2014-12-19，

2015-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260608)和云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013FD066, 2013FZ150)資助

申云霞，女, 1991年生, 云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院研究生 e-mail：shenyunxia1991@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail：yzwang1981@126.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)05-1358-05