徐田鋒，彭彥昆，李永玉，翟 晨，鄭曉春，喬 璐，Adnan Abbas

中國農(nóng)業(yè)大學工學院，國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心, 北京 100083

菠菜品質(zhì)安全參數(shù)的拉曼點掃描快速檢測方法

徐田鋒，彭彥昆，李永玉*，翟 晨，鄭曉春，喬 璐，Adnan Abbas

中國農(nóng)業(yè)大學工學院，國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心, 北京 100083

針對蔬菜品質(zhì)安全無損傷檢測的實際市場需求，結(jié)合葉菜表面農(nóng)藥殘留等品質(zhì)安全參數(shù)的不均一性，以實驗室自行搭建的拉曼光譜硬件系統(tǒng)為基礎(chǔ)，開發(fā)了葉菜氣吸平整裝置，編寫了基于LabVIEW開發(fā)平臺的GUI應(yīng)用程序。該系統(tǒng)通過設(shè)定掃描步長等參數(shù)，實現(xiàn)了整個菠菜樣品的拉曼光譜自動點掃描檢測，包括對所有掃描點的拉曼信號進行自動采集、顯示和存儲。檢測過程中，系統(tǒng)軟件實時監(jiān)控相機、二維平移臺的運行狀態(tài)。同時，針對菠菜原始光譜特性編寫了基于有效峰線性擬合基線校準方法的拉曼光譜熒光剔除程序，實現(xiàn)了對樣品所有掃描點數(shù)據(jù)的自動基線校準及疊加平均處理。菠菜樣品的點掃描實驗結(jié)果顯示，一次掃描不僅可以獲得菠菜樣品每一掃描點的葉綠素含量及毒死蜱農(nóng)藥殘留等品質(zhì)安全參數(shù)的分布情況，而且還可以獲得整個樣品各參數(shù)的平均信息。該點掃描拉曼系統(tǒng)有效提高了不均勻樣品的品質(zhì)安全參數(shù)的檢測精度。

拉曼光譜； 點掃描； 農(nóng)藥殘留； 品質(zhì)安全

引 言

葉菜含有豐富的維生素、核黃素、類胡蘿卜素、纖維素及其他各類營養(yǎng)物質(zhì)[1]，是人類獲取營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源之一，其品質(zhì)安全關(guān)乎每個人的健康及生命安全。近些年來，許多學者利用葉菜的光學特性、電學特性、振動特性、機器視覺和電子鼻技術(shù)進行了大量的品質(zhì)安全檢測研究。在這些技術(shù)中，拉曼光譜檢測技術(shù)具有高精度、快速、無損的特點，在痕量物質(zhì)及成分檢測領(lǐng)域顯示出了獨特的優(yōu)勢[2-6]。

拉曼光譜是一種分子振動性散射光譜，通過對頻移及相對強度分析即可獲得分子振動、轉(zhuǎn)動方面信息。因此，每一種物質(zhì)都有特定的指紋拉曼光譜。相關(guān)研究[7-9]表明，拉曼光譜的這種特性非常適合果蔬中農(nóng)藥殘留的無損傷檢測，加之其無需制備試樣、無需消耗化學試劑、所需樣品量少等特點，國內(nèi)外已有大量研究。

Dhakal等[10, 11]搭建了一套可用于直接檢測蘋果表面毒死蜱農(nóng)藥殘留的拉曼光譜系統(tǒng)，系統(tǒng)檢測限為6.69 mg·kg-1，單點檢測時間小于4 s。Zhang等[12]通過共聚焦顯微拉曼光譜儀(514.5 nm)和近紅外傅里葉變換拉曼光譜儀(1 064 nm)采集了幾種常見蔬菜的拉曼光譜，結(jié)果表明1 064 nm激發(fā)波長可有效抑制熒光，F(xiàn)T-Raman有望實現(xiàn)果蔬表面農(nóng)殘的直接檢測。Xie等[13]應(yīng)用表面增強拉曼光譜快速檢測了蔬菜中甲胺磷農(nóng)藥殘留，研究結(jié)果顯示，蔬菜表面甲胺磷農(nóng)殘在0.01～1 000 μg·mL-1的拉曼信號有非常好的線性相關(guān)性，在4，8，15 μg·mL-13個水平下進行的回收率實驗結(jié)果為86.7%～99.6%，標準偏差為1.2%～2.5%，表明該方法具有良好的可重復性。

然而，國內(nèi)外運用拉曼光譜技術(shù)對葉菜進行品質(zhì)安全檢測的研究多數(shù)集中在單點或多點檢測，即只能獲得樣品一個點或幾個點的檢測信息。葉菜的實際種植、生產(chǎn)、貯藏過程中施藥的隨機性等因素造成了葉菜品質(zhì)安全參數(shù)的不均勻性，顯然僅靠單點或多點檢測的信息無法完全準確地把握整個樣品的信息，從而造成了樣品實際與檢測信息之間偏差較大等問題。

以實驗室自主搭建的拉曼光譜硬件系統(tǒng)為基礎(chǔ)，針對葉菜表面農(nóng)藥殘留等品質(zhì)安全參數(shù)的不均一性，設(shè)計開發(fā)了用于葉菜平整的氣吸裝置，編寫了基于LabVIEW開發(fā)平臺的GUI應(yīng)用程序，實現(xiàn)了整個葉菜樣品的拉曼光譜自動點掃描檢測，自動對所有掃描點的拉曼信號進行采集、極限校準、疊加平均、顯示和存儲。該系統(tǒng)一次掃描不僅獲得葉菜樣品每一掃描點的品質(zhì)安全參數(shù)的分布情況，而且還可以獲得整個樣品各參數(shù)的平均信息。

1 實驗用拉曼光譜采集系統(tǒng)

實驗室自行搭建的拉曼光譜系統(tǒng)硬件如圖1所示，包括16位高性能電荷耦合器件CCD相機(Andor Technology, Inc, South Windsor, Conn.)、拉曼光譜儀(Innovative Photonic Solutions, Monmouth Junction, N.J.)、785 nm激光器(Headwall Photonics, Fitchburg, Mass)及拉曼探針等。為了防止外部光線的影響，系統(tǒng)硬件均放置在可移動暗箱中，箱體分為上下兩層。上層箱體主要用于檢測，包括拉曼探針、二維電動平移臺、葉菜氣吸平整裝置等。升降臺被安裝在二維電動平移臺上，其調(diào)節(jié)精度為0.1 mm。同時，升降臺的上方承載一個氣吸式葉菜平整裝置，用于保證葉菜平整。下層箱體放置二維電動平移臺控制箱、CCD相機、光譜儀及氣吸裝置控制盒。電動平移臺控制箱封裝有運動控制卡、穩(wěn)壓電路等模塊，發(fā)送指定字符即可控制電動平移臺運動?？刂葡渫ㄟ^USB-RS232轉(zhuǎn)接線與電腦相連，便于實時監(jiān)控電機狀態(tài)。此外，為了提高CCD相機內(nèi)置冷卻器降溫性能，下層箱體通過對流式吸排氣風扇、散熱片確保CCD相機處于接近室溫的工作環(huán)境。

圖1 拉曼系統(tǒng)原理圖

系統(tǒng)所選用的拉曼探針焦距為7.5 mm，激光打在樣品上的圓形光斑直徑約為0.23 mm。為了減小葉菜表面不平整造成的激光散光，在原有硬件基礎(chǔ)上，研發(fā)了一種用于光學無損傷檢測的葉菜平整裝置，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。該裝置包括負壓盒、底板、真空泵三個部分。負壓盒上表面陣列適量2 mm大小的圓孔，材質(zhì)選用無拉曼信號的氧化鋁，減小了檢測過程中熒光對農(nóng)藥拉曼信號的干擾。底板開有與升降臺對應(yīng)的標準通孔，用于固定該氣吸裝置。負壓盒連通孔通過導氣管與真空泵連通，其內(nèi)腔室存在負壓進而讓葉菜緊貼于裝置的上表面。

圖2 氣吸式葉菜平整裝置示意圖

2 拉曼光譜點掃描方法

2.1 平移臺步長與速度計算

系統(tǒng)平移臺采用GCD-0301M步進電機(大恒新紀元科技股份有限公司)二維級聯(lián)方式連接，可實現(xiàn)二維方向的單獨或同時控制。影響平移臺單步位移的因素有電機細分比、步距角及機構(gòu)傳速比等，詳細公式如下

其中，s: 平移臺步長，mm；d: 絲杠導程，4 mm；θ: 電機步距角，1.8°；n: 電機細分比，20；i: 機構(gòu)傳速比，1。

因此，選用的平移臺單脈沖的理論位移是0.001 mm。而實際中，單脈沖會造成步進電機打擺，難以實現(xiàn)連續(xù)精確的控制。根據(jù)實際精度要求，選擇單步執(zhí)行100個脈沖即0.1 mm作為系統(tǒng)掃描的最小間距。

葉菜品質(zhì)安全參數(shù)的檢測趨向準確、快速、無損方向發(fā)展，縮短系統(tǒng)樣品檢測時間尤為重要。圖3是該系統(tǒng)光譜采集與電機驅(qū)動的時間脈沖圖，t表示系統(tǒng)單點檢測的時間，其包括光譜采集時間t0和電機驅(qū)動時間t1。在t0時間內(nèi)，系統(tǒng)只允許光譜采集，平移臺處于靜止狀態(tài)。而在t1時間內(nèi)，CCD通過關(guān)閉快門禁止外界光進入相機，平移臺依照特定指令迅速移動到下一個目標點等待檢測。同時，系統(tǒng)軟件將臨近一次采集到的光譜數(shù)據(jù)保存于txt文件中，并在操作界面繪圖區(qū)實時顯示當前檢測點的光譜曲線。為了縮短檢測時間，選用平移臺最大直線速度10 mm·s-1為其瞬時移動速度，發(fā)送指令@FF即可實現(xiàn)精確控制。

圖3 拉曼光譜采集與電機驅(qū)動時間脈沖圖

2.2 掃描模式

系統(tǒng)選用點掃描模式如圖4所示，其起始點位于目標區(qū)域的一角，是一種折線形的逐行掃描方式。從起始點開始，X軸方向平移臺以一定的步長向右逐點掃描直至達到預設(shè)值即完成一行掃描，此時，X方向電機停止動，Y方向平移臺向前移動單步長后，X方向平移臺繼而向左掃描，以此類推完成整個目標區(qū)域的掃描。由于該掃描模式具有編程簡單、易于圖像合成等優(yōu)點，本控制優(yōu)選此掃描的方式。

圖4 點掃描模式

2.3 系統(tǒng)矯正

拉曼光譜儀分光后，產(chǎn)生的分光帶被CCD上的1 024個探測器探測，因此需要通過對相機像素點的矯正把像素坐標轉(zhuǎn)換成頻移坐標。常用的拉曼坐標轉(zhuǎn)換方式是通過具有豐富拉曼峰的標準物質(zhì)進行擬合矯正。標品萘是目前公認的用于拉曼矯正的物質(zhì)之一，其豐富的拉曼峰及穩(wěn)定的散射頻移為系統(tǒng)精度提供了可靠的保障。圖5(a)是采集到的標品萘與CCD像素點對應(yīng)的拉曼光譜，圖中標出了7個拉曼峰對應(yīng)的實際拉曼頻移量。通過對比發(fā)現(xiàn)，相機像素點坐標與實際拉曼頻移之間存在良好的二次多項式關(guān)系，其擬合決定系數(shù)為1，如圖5(b)所示。矯正后CCD相機能探測的拉曼光譜范圍為-186.45～2 345.72。

2.4 樣品自動點掃描軟件

基于LabVIEW開發(fā)平臺編寫了一個可視化圖形用戶界面(GUI)，應(yīng)用程序流程圖如圖6所示。系統(tǒng)軟件自動初始化CCD相機，并打開相機內(nèi)置冷卻器降溫直至滿足預設(shè)溫度。選用的CCD相機最大降溫范圍-50～-70 ℃，以保證系統(tǒng)較低的暗電流及較好的光譜穩(wěn)定性。降溫結(jié)束后，軟件調(diào)用相應(yīng)函數(shù)對硬件進行參數(shù)設(shè)置，如初始化變量、設(shè)置讀取模式、采集模式等。此時，軟件處于待命狀態(tài)，用戶可根據(jù)需要隨時更改點掃描的步長和總距離。

編寫的GUI界面如圖7所示，包括相機設(shè)置模塊、電動平移臺參數(shù)設(shè)置模塊、系統(tǒng)操作模塊、數(shù)據(jù)保存模塊、硬件狀態(tài)及光譜曲線顯示模塊。其中，相機設(shè)置模塊包括CCD溫度、曝光時間、相機探測器中心位置及高度等的設(shè)置。為保

圖5 拉曼頻移矯正

圖6 軟件系統(tǒng)流程圖

證光譜儀及相機最佳的信噪比(SNR)，CCD相機開發(fā)商提供了Single-track數(shù)據(jù)讀取模式。在這種讀取模式下，CCD相機探測器僅從選取的目標位置獲取數(shù)據(jù)。電動平移臺參數(shù)設(shè)置模塊主要包括電機步長和掃描長度設(shè)置，單維掃描最大長度為200 mm，掃描步長精度為0.1 mm。界面下方還設(shè)有狀態(tài)顯示欄，包括CCD初始化、當前CCD溫度以及電動平移臺相對初始狀態(tài)的位置等，當鼠標在光譜曲線上捕捉到某點后，會實時顯示捕捉點的坐標。

圖7 系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集軟件操作界面

打開應(yīng)用軟件，通過選擇對應(yīng)串口使計算機與二維平移臺通訊。當相機內(nèi)置溫度達到預設(shè)溫度后，點擊開始采集，程序?qū)⑦B續(xù)采集數(shù)據(jù)并保存。數(shù)據(jù)以二維數(shù)組的形式保存為txt文件，保存路徑為指定目標文件夾。檢測過程中，可根據(jù)實際需要點擊暫停/繼續(xù)按鈕選擇暫?；蚶^續(xù)。按下中止鍵或完成整個樣品檢測，二維電動平臺將自動還原初始位置并把系統(tǒng)所有變量初始化(CCD溫度除外)。當所有樣品檢測結(jié)束后，點擊退出程序，程序?qū)⒆詣雨P(guān)閉相機及應(yīng)用程序。

3 基線自動校準及疊加平均處理

拉曼光譜熒光剔除(基線校準)是拉曼光譜數(shù)據(jù)處理的一個難點[14]，基線校準的好壞直接影響系統(tǒng)檢測的精度。本研究拉曼光譜熒光剔除采用基于有效波峰臨近閾值范圍內(nèi)光譜數(shù)據(jù)直線擬合替換的方法(以下稱為有效峰線性擬合法)，通過判斷波峰兩側(cè)有無波谷從而確定直線擬合的起始位置，進而通過直線擬合方程產(chǎn)生并替換原始光譜中波峰位的數(shù)據(jù)。基于以上原理，編寫了有效峰線性擬合基線校準的程序。從圖8中可以看出，盡管原始光譜在634.2和679.7 cm-1處的拉曼信號非常弱，但該方法仍能正確識別有效拉曼峰位置并進行直線擬合。基線校準后，曲線中各峰位及形狀與原始光譜中的峰位和形狀幾乎沒有差別，可以很好的剔除復雜熒光背景的光譜曲線的熒光，提高了系統(tǒng)檢測的精度。因?qū)嶋H檢測過程有時需要逐點預測樣品的品質(zhì)安全參數(shù)，該程序采用了先對樣品所有掃描點數(shù)據(jù)進行基線校準，再進行對所有掃描點的疊加平均處理的方法。

圖8 弱的拉曼信號光譜的基線校準

4 菠菜樣品拉曼光譜點掃描實驗

4.1 樣品制備

用去離子水配制4 800 mg·kg-1毒死蜱農(nóng)藥水溶液，取20 mL溶液置于一個小型迷霧噴槍中。將市售菠菜用去離子水洗凈并自然干燥后，采用迷霧的方式模擬田間農(nóng)藥的施藥過程制備實驗樣品。

4.2 拉曼光譜采集

將樣品依次放置于氣吸平整裝置上，微調(diào)升降臺確保拉曼探針到菠菜樣品的距離為7.5 mm。打開拉曼點掃描系統(tǒng)軟件，設(shè)置二維方向掃描間距均為2 mm、掃描長度為20 mm、激光功率為350 mW、相機曝光時間為2 s。為了確保較高的信噪比(SNR)，所有數(shù)據(jù)均在CCD的內(nèi)冷卻溫度保持在-50～-60 ℃之間采集。

4.3 結(jié)果與分析

圖9 在不同檢測點的樣品原始光譜

通過對實驗數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)檢測低濃度毒死蜱農(nóng)藥殘留時存在一定的拉曼頻移，即679.7 cm-1處峰可能會漂移到677.1和682.4 cm-1處。數(shù)據(jù)處理過程中，通過基于MATLAB自行編寫的峰位校正程序自動校正了存在漂移的有效拉曼峰。考慮到實際檢測過程是逐點預測殘留濃度，因此程序采用了先對單個樣品所有數(shù)據(jù)進行基線校準再進行疊加平均的處理方法。

程序經(jīng)過有效峰線性擬合法剔除熒光背景及光譜疊加平均后的光譜曲線如圖10所示?？梢悦黠@看出，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理后的光譜曲線在679.7，743.6，1 160，1 189，1 217，1 288，1 326，1 526 cm-1處存在明顯的拉曼峰，說明所采用的熒光剔除方法正確的識別并處理了原始光譜中許多微弱的拉曼信號。其中，679.7和1160，1 526 cm-1分別是毒死蜱農(nóng)藥和葉綠素的拉曼特征峰，743.6，1 189，1 217，1 288，1 326 cm-1可能與菠菜內(nèi)部品質(zhì)如維生素、固形物含量等成分有關(guān)。

圖10 去除熒光背景和平均處理后的光譜圖

且僅有少量掃描點沒有出現(xiàn)葉綠素的特征峰，其原因是在這些掃描位置激光打到了菠菜的脈絡(luò)或干癟處。

圖11 拉曼峰強度的柱狀圖

5 結(jié) 論

以實驗室自行搭建的拉曼光譜硬件系統(tǒng)基礎(chǔ)上研發(fā)的用于葉菜品質(zhì)安全檢測的點掃描拉曼光譜系統(tǒng)，對檢測樣品進行自動逐點掃描、信號采集、基線校準、疊加平均、顯示和存儲。即可獲得樣品每一掃描點的葉綠素含量及毒死蜱農(nóng)藥殘留等品質(zhì)安全參數(shù)的分布情況，而且還可以獲得整個樣品的各參數(shù)平均信息。該拉曼光譜點掃描系統(tǒng)有效提高了葉菜等不均勻樣品品質(zhì)安全參數(shù)的檢測精度。

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(Received Apr. 13, 2015; accepted Aug. 25, 2015)

*Corresponding author

A Point Raman Scanning Method for Rapidly Detection of Spinach Quality and Safety Parameters

XU Tian-feng, PENG Yan-kun, LI Yong-yu*, ZHAI Chen, ZHENG Xiao-chun, QIAO Lu，Adnan Abbas

College of Engineering, China Agricultural University, National Research and Development Center for Agro-processing Equipment, Beijing 100083, China

According to actual market demand for nondestructive detection of vegetables quality and safety, combined with the heterogeneity of quality and safety parameters such as pesticide residues on leaf vegetables surface and to realize the automatic point scanning for the whole leaf vegetables samples, a suction device based on laboratory (self-designed) Raman spectroscopy hardware and a GUI application software based on the LabVIEW development platform were developed. This system can test the Raman spectroscopy of the whole spinach including the automatic collection, display and storage of the Raman signal of all the scanned points by set up different scan step. A new method to remove the Raman spectrum background was proposed based on data replacement with linear equation at the range of threshold spectrum on both sides of the effective peaks according to the characteristics of spinach original spectra. Its principle is to determine the starting position of linear fitting by judging whether there is trough on both sides of the crest, and then to generate and replace the original spectra data in peak position through the linear fitting equation. Spinach samples were used for the experiment showed that the chlorophyll content and distribution of chlorpyrifos pesticide residue on each scanning point can be obtained after scanning. Therefore, the point scanning Raman system could improve detection accuracy of the quality and safety parameters for the non-uniform samples effectively.

Raman spectroscopy; Points scan; Pesticide residues; Quality and safety

2015-04-13，

2015-08-25

國家科技支撐項目(2014BAD04B05)資助

徐田鋒，1993年生，中國農(nóng)業(yè)大學工學院碩士研究生 e-mail: xtf_aden@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: yyli@cau.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)06-1765-06