水玲玲， 李嵐慧， 金名亮， 周國富

(華南師范大學(xué)華南先進(jìn)光電子研究院，彩色動(dòng)態(tài)電子紙顯示技術(shù)研究所，廣州 510006)

?

微流控法DNA片段化研究進(jìn)展

水玲玲*， 李嵐慧， 金名亮， 周國富

(華南師范大學(xué)華南先進(jìn)光電子研究院，彩色動(dòng)態(tài)電子紙顯示技術(shù)研究所，廣州 510006)

摘要：DNA分子的片段化技術(shù)對(duì)于下一代基因測(cè)序技術(shù)和疾病檢測(cè)技術(shù)意義重大，文章回顧了現(xiàn)有的DNA片段化方法，著重介紹了基于微流控芯片技術(shù)的流體動(dòng)力學(xué)剪切法DNA片段化技術(shù)，總結(jié)了影響微流控芯片中DNA片段化過程的因素，并且展望未來微流控技術(shù)在DNA片段化和生物芯片領(lǐng)域的應(yīng)用.

關(guān)鍵詞：微流控； DNA片段化； 流體剪切； 基因測(cè)序

基因測(cè)序也稱DNA測(cè)序，是現(xiàn)代生物學(xué)研究中重要的手段之一，其關(guān)鍵是快速獲得隨機(jī)分布長短一致的DNA片段[1-3].通常，DNA片段長度的范圍是選取接近相關(guān)生物體內(nèi)1個(gè)單基因的平均長度，或者基于為整個(gè)數(shù)據(jù)庫自動(dòng)生成序列數(shù)據(jù)的方法來選取[4].因此，如何得到片段大小可控且長度分布集中的DNA片段成為大家普遍關(guān)心的熱點(diǎn)研究課題之一.

DNA是由核苷酸組成的長鏈分子聚合物，易溶于水，在外力作用下，DNA長鏈會(huì)被拉伸，當(dāng)外力大于分子間的化學(xué)鍵時(shí)，DNA組成單元間的共價(jià)鍵斷裂從而形成隨機(jī)分布的DNA片段[5].目前，常用的DNA片段化方法有以下幾種：DNA限制酶切法[6]、超聲波降解法[7-8]、噴射霧化法[9-10]和水動(dòng)力剪切法[11-16].這些方法均被用于DNA片段的生成，并各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn).基于水動(dòng)力剪切DNA的方法是目前大家公認(rèn)的比較有效的方法之一，可以較好地得到隨機(jī)分布并且分散度較小的DNA片段，并且不會(huì)對(duì)DNA造成損傷；但是目前的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，對(duì)密閉性和壓力要求嚴(yán)格，器件相對(duì)昂貴.Digilab公司生產(chǎn)的全自動(dòng)基因組DNA剪切儀(Hydrodynamic DNA Shearing Instrument)，利用水動(dòng)力剪切可以獲得長度為40～4 000 bp的DNA片段[17].針對(duì)便攜式醫(yī)療器械和下一代基因測(cè)序技術(shù)來說，操作更容易、樣品用量更少、無規(guī)片段化、片段長度可控和對(duì)樣品無損害的方法，仍然是科學(xué)家們追求的夢(mèng)想.

微流控芯片實(shí)驗(yàn)室(Lan-on-a-Chip)或稱微全分析系統(tǒng)(Micro Total Analysis System)，是有由MANZ與WIDMER[18]在1990年提出的. 通過這種技術(shù)可以把生物和化學(xué)領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離檢測(cè)等基本操作單位集成或基本集成與一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或者化學(xué)過程，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)[19].隨著20世紀(jì)微納米加工技術(shù)的飛速進(jìn)步，微納米器件已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域當(dāng)中，包括電子信息、醫(yī)療器械、生物和化學(xué)分析以及藥物篩選等[20].從微流控技術(shù)的特征來看，它可以精密地操控微米級(jí)的流體，是一種非常適合用來實(shí)現(xiàn)少量DNA樣品處理(包括片段化)的方法[8, 21]；并且這種技術(shù)的器件小(mm～cm)、便攜性好、樣品使用量少.在微流控的微通道中，流體的流速以及流動(dòng)的變化不但可以整體控制流體的速度，而且可以通過對(duì)微流控通道的幾何結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)來控制流體流速在微通道中的變化(加速或者減速).因此，可以控制流體對(duì)DNA樣品的流體剪切力，從而快速剪切溶液中的DNA分子，得到短鏈的DNA片段.微流控芯片可以通過現(xiàn)有的微加工方法來簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)，因此也可以比較容易地與其他功能的芯片集成，從而可以實(shí)現(xiàn)快速高效的診療流程，實(shí)現(xiàn)個(gè)人診療系統(tǒng)的器件化.

1DNA片段化微流控芯片材料和結(jié)構(gòu)

在微流控芯片器件中，流體的控制主要通過外加力場(chǎng)來控制，因此流體的流速和外加力場(chǎng)的壓力差成正比，可表示為[22]264：

Q=∫vidA，

(1)

其中，Q(m3/s)、vi(m/s)、A(m2)和P(Pa)分別代表流體的體積流速、特定位置點(diǎn)i處流體的線性速度、微通道的橫截面積和通道兩端的壓力差；Rhy代表微通道中流體流動(dòng)產(chǎn)生的阻力.由式(1)可知，微流控通道中流體對(duì)DNA分子的剪切力來源于流體流動(dòng)過程，因此,流體的流速越快或者外加力場(chǎng)越大，DNA片段化的效果越好.

基于目前常用的微米加工技術(shù)和材質(zhì)的選擇，玻璃/硅基微流控芯片可以耐受比較高的壓力，因此被常用于DNA片段化的芯片器件(圖1A)[21]3；但是為了降低剪切壓力，通過分段和連續(xù)的方法可以提高剪切效率，同時(shí)降低速度，因此高分子材料的微流控芯片也可以被用于DNA片段化的微流控芯片(圖1B)[12]1045.

2微流控芯片DNA片段化技術(shù)中DNA樣品的處理和要求

片段化的DNA分子對(duì)于基因測(cè)序和疾病檢測(cè)技術(shù)非常關(guān)鍵，因此要求DNA片段化的技術(shù)對(duì)樣品

圖1用于DNA片段化微流控芯片的玻璃和高分子材料

Figure 1DNA fragmentation microfluidic chips made of glass and polymer materials

不挑剔，不會(huì)帶來污染和損害.大量的流體力學(xué)DNA片段化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種技術(shù)對(duì)DNA樣品基本不挑剔.human genomic DNA[12]、salmon sperm DNA、restriction fragments、cosmids、BACs、YACs[13]等不同種類的DNA樣品均可以在微流控芯片中實(shí)現(xiàn)無規(guī)的有效DNA片段化，不同剪切速度下得到的DNA片段分布和DNA的來源無關(guān).

DNA溶液中離子強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致溶液的粘度增加，通常DNA分子在高離子強(qiáng)度下更趨于形成團(tuán)狀的卷曲結(jié)構(gòu)，因此，隨著離子濃度增加，要將同一種DNA分子剪切到相同大小的片段所需要的剪切力(流體速度)越大(圖2A)；隨著DNA濃度的增加，其粘度也增加，但是研究結(jié)果表明，在相同剪切力(流體速度)條件下，所產(chǎn)生的DNA片段差別不明顯(圖2B).

3流體速度和微通道尺寸的影響

眾所周知，流體力學(xué)DNA片段化主要由流體對(duì)DNA分子的快速剪切作用造成，因此流體的剪切速度決定了最終DNA片段化的尺寸.大量實(shí)驗(yàn)表明，隨著流體流速的增加，DNA片段化的尺寸減小；而在一定剪切速度下，DNA片段的大小隨著時(shí)間的增加而減小，經(jīng)過一段時(shí)間以后將達(dá)到平臺(tái)不再變化. 即在一定的流體速度下，DNA分子能夠被剪切得到穩(wěn)定的最小尺寸的片段(圖3)[21]4.

由式(1)可知，流體的體積流速和施加在微通道兩端的壓力差成正比，與流體在微通道中的流體阻力成反比，因此,在相同的體積流速下，微通道尺寸越小，其中的流體線性速度越大，可以將相同DNA分子片段化得到的尺寸越小.表1顯示，在同一種微流控芯片中，當(dāng)微通道尺寸從50 μm減小到10 μm，體積流速穩(wěn)定在3 mL/min時(shí)，DNA片段從9 000 bp降低到1 870 bp，而Human DNA也從較大尺寸降低到2 320 bp[12]1045.

圖2　DNA樣品溶液離子強(qiáng)度(A)[12]3883和DNA濃度(B)[21]5對(duì)微流控片段化的影響

圖3　微流控芯片中流體流速變化對(duì)剪切獲得的DNA片段長度的影響[21]4

表1　不同尺寸微通道對(duì)DNA片段化結(jié)果的影響[12]1045

注：a表示流速為3 mL/min. NDb表示未檢出.括號(hào)中的百分?jǐn)?shù)為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.

4循環(huán)次數(shù)對(duì)微流控片段化的影響

雖然在微流控芯片中，流體的快速剪切可以將

DNA分子片段化，但是微流控通道的尺寸有限.在微流控芯片中，流體的阻力與通道的長度成正比，因此通道越長，阻力越大.一般來說，玻璃或者硅基的微流控芯片可以耐受106Pa數(shù)量級(jí)的壓力，而塑料芯片一般只能耐受105Pa數(shù)量級(jí)的壓力.通常情況下，微流控通道的長度可以控制在mm到cm級(jí)之間；但是為了減低達(dá)到片段化要求的高速流體流動(dòng)，通道的尺寸不能太長，一般在mm到cm級(jí)之間.總之，當(dāng)DNA溶液從微流控芯片的入口到出口流動(dòng)的時(shí)間都在μs至ms級(jí)之間.溶液中存在大量的DNA分子，快速短暫的流動(dòng)可以讓部分DNA分子片段化，而大量的DNA分子來不及片段化就已經(jīng)到達(dá)出口.研究發(fā)現(xiàn)，在流體力學(xué)剪切DNA片段化器件或設(shè)備中，可以通過多次循環(huán)樣品來達(dá)到降低DNA片段尺寸和尺寸分布的效果.圖4為樣品在微流控通道中，相同流速下循環(huán)1～10次對(duì)DNA片段化結(jié)果的影響，循環(huán)次數(shù)的增加，不但可以降低DNA片段尺寸，還可以提高樣品的回收率.

圖4　固定流速下1～10次循環(huán)的DNA片段尺寸分布(A)、平均尺寸和質(zhì)量濃度(B)[21]6

Figure 4Length distribution (A), average length and collected DNA concentration (B) of DNA fragments produced by shearing DNA solution through a microfluidic device at a fixed flow rated with 1 to 10 cycles[21]6

5溫度對(duì)微流控片段化的影響

DNA溶液在低溫下一般很穩(wěn)定，可長時(shí)間保存；但是在高溫下則會(huì)發(fā)生變性，核酸雙螺旋堿基對(duì)的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，同時(shí)溶液的粘度降低.DNA解鏈的溫度與分子中所含的堿基對(duì)成分有關(guān)，G和C越多則解鏈溫度越高.THORSTENSON等[15]的研究表明，當(dāng)工作溫度在22～60 ℃時(shí)，流體力學(xué)剪切樣品DNA獲得的結(jié)果區(qū)別不大，而當(dāng)溫度>60°以后，相同剪切條件下DNA片段的尺寸明顯減小.這可能是由于DNA分子由雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋變成單鏈結(jié)構(gòu)，因此在相同剪切速度下，更加容易被剪切變成更小的DNA片段(圖5).

圖5　溫度對(duì)流體剪切DNA片段化的影響[15]851

Figure 5Effect of temperature on DNA fragmentation by hydrodynamic shearing[15]851

6結(jié)論

微流控技術(shù)可以精密準(zhǔn)確地控制流體在微觀尺度的流動(dòng)和變化，流體快速流過微流控通道會(huì)對(duì)溶液中的分子產(chǎn)生剪切力作用，因此，這種技術(shù)可以用于DNA片段化研究.本文總結(jié)了微流控流體力學(xué)DNA片段化的影響因素和效果.DNA樣品的來源、DNA的濃度對(duì)微流控DNA片段化影響不明顯；溶液的離子強(qiáng)度可以增加溶液粘度和使DNA分子處于團(tuán)簇狀態(tài)，因此需要更大的剪切力才能獲得相同尺寸的DNA片段；溶液在微流控芯片中多次循環(huán)可以降低DNA片段尺寸和尺寸分布，同時(shí)可以提高回收產(chǎn)率；工作溫度在DNA解鏈溫度以下，溫度對(duì)片段化結(jié)果影響較小，當(dāng)溫度大于解鏈溫度后，DNA解旋成單鏈因此更加容易被片段化.微流控流體剪切DNA片段化具有無規(guī)剪切、尺寸可控、分子破壞小和污染少等特點(diǎn)，結(jié)合微流芯片器件的尺寸小和用量少的優(yōu)勢(shì)，是一種非常適合于下一代基因測(cè)序和便攜式醫(yī)療的新技術(shù)，正受到越來越多的關(guān)注.

參考文獻(xiàn)：

[1]EL MUSTAPHA B, STAMBROOK P J. Next-generation sequencing technologies: breaking the sound barrier of human genetics[J]. Mutagenesis, 2014, 29(5):303-310.

[2]HEAD S R, KIYOMI K H, LAMERE S A, et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges[J]. Biotechniques, 2014, 56(2):61-77.

[3]LIU L, LI Y H, LI S L, et al. Comparison of next-generation sequencing systems[J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012,2012: Art 251364,7pp.

[4]HENGEN P N. Shearing DNA for genomic library construction[J]. Trends in Biochemical Sciences, 1997, 22(7):273-276.

[5]MANNEVILLE S, CLUZEL P, VIOVY J L, et al. Evidence for the universal scaling behaviour of a freely relaxing DNA molecule[J]. Europhysics Letters, 1996, 36(6):413-418.

[6]HOHEISEL J D, NIZETIC D, LEHRACH H. Control of partial digestion combining the enzymes dam methylase and MboI[J]. Nucleic Acids Research, 1989, 17(23):9571-9582.

[7]KASOJI S K, PATTENDEN S G, MALC E P, et al. Cavitation enhancing nanodroplets mediate efficient DNA fragmentation in a bench top ultrasonic water bath[J]. Plos One, 2015, 10(7): Art 0133014,15pp.

[8]TSENG Q, LOMONOSOV A M, FURLONG E E, et al. Fragmentation of DNA in a sub-microliter microfluidic sonication device[J]. Lab on A Chip, 2012, 12(22):4677-4682.

[9]LENTZ Y K, WORDEN L R, ANCHORDOQUY T J, et al. Effect of jet nebulization on DNA: identifying the dominant degradation mechanism and mitigation methods[J]. Journal of Aerosol Science, 2005, 36(8):973-990.

[10]SAMBROOK J, RUSSELL D W.Fragmentation of DNA by nebulization[J]. Cold Spring Harbor Protocols, 2006, 2006(4):1-3.

[11]JONEJA A, HUANG X H.A device for automated hydrodynamic shearing of genomic DNA[J]. Biotechniques, 2009, 46(7):553-556.

[12]NESTEROVA I V, HUPERT M L, WITEK M A, et al. Hydrodynamic shearing of DNA in a polymeric microfluidic device[J]. Lab on A Chip, 2012, 12(6):1044-1047.

[13]OEFNER P J, HUNICKE-SMITH S P, CHIANG L, et al. Efficient random subcloning of DNA sheared in a recirculating point-sink flow system[J]. Nucleic Acids Research, 1996, 24(20):3879-3886.

[14]SHUI L, SPARREBOOM W, SPANG P, et al. High yield DNA fragmentation using cyclical hydrodynamic shearing[J]. RSC Advances, 2013, 3(32):13115-13118.

[15]THORSTENSON Y, HUNICKE-SMITH S, OEFNER P, et al. An automated hydrodynamic process for controlled, unbiased DNA shearing[J]. Genome Research, 1998, 8(8):851.

[16]YEW F F H, DAVIDSON N. Breakage by hydrodynamic shear of the bonds between cohered ends of lambda-DNA molecules[J]. Biopolymers, 1968, 6(5):659-679.

[17]DIGILAB Inc. The best way to rragment DNA for genomic and paired end library construction, high throughput & long reads sequencing![EB/OL].[2016-01-12]. http://www.digilabglobal.com/--NEXTGEN-SHEAR.[18]MANZ A, GRABER N, WIDMER H M. Miniaturized total chemical analysis systems: a novel concept for chemical sensing[J]. Sensors & Actuators B: Chemical, 1990, 1(90):244-248.

[19]VO-DINH T.Development of a DNA biochip: principle and applications 1[J]. Sensors & Actuators B: Chemical, 1998, 51(1/2/3):52-59.

[20]CHEN G, WEI LI, DU WD, et al. Development of a DNA biochip for detection of known mtDNA mutations associated with MELAS and MERRF syndromes[J]. Hereditas, 2008, 30(10):1279-1286.

[21]SHUI L L, BOMER J G, JIN M L, et al. Microfluidic DNA fragmentation for on-chip genomic analysis[J]. Nanotechnology, 2011, 22(49):Art 494013,7pp.

[22]SHUI L, EIJKEL J C T, BERG A V D. Multiphase flow in micro- and nanochannels[J]. Sensors & Actuators B: Chemical, 2007, 121(1):264.

【中文責(zé)編：譚春林英文責(zé)編：李海航】

Recent Progress of DNA Fragmentation Based on Microfluidics

SHUI Lingling*, LI Lanhui, JIN Mingliang, ZHOU Guofu

(Institute of Electronic Paper Displays, South China Academy of Advanced Optoelectronics, South China Normal University, Guangzhou 510006, China)

Abstract：DNA fragmentation is one of the key technologies for gene library and disease detection. Normal DNA fragmentation technologies are reviewed focusing on microfluidic based DNA fragmentation technology. Effective parameters are discussed and summarized according to the resulted DNA fragments. The importance and perspective of microfluidic DNA fragmentation are summarized.

Key words：microfluidics; DNA fragmentation; fluidic shearing; gene sequencing

收稿日期：2015-12-31 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51405165)；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”項(xiàng)目(IRT13064)；廣東省引進(jìn)創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(2011D039)

*通訊作者:水玲玲，教授，國家“青年千人計(jì)劃”入選者， Email：shuill@m.scnu.edu.cn.

中圖分類號(hào)：TN27

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):1000-5463(2016)01-0023-05