張銀霞，田　蕾，李培富

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 銀川　750021)

寧夏自育水稻品種及部分引進(jìn)品種的稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記檢測

張銀霞，田蕾，李培富

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 銀川750021)

為明確寧夏水稻種質(zhì)資源中含有的抗稻瘟病基因型及基因數(shù)量，為水稻抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。采用與抗稻瘟病基因Pita、Pi-kh、Pib、Pi2、Pi-km、Pi9、Pi5緊密連鎖的7個(gè)分子標(biāo)記，對(duì)25份寧夏自育水稻品種和55份引進(jìn)水稻品種的抗稻瘟病基因進(jìn)行分子檢測。結(jié)果表明，寧夏自育水稻品種的抗稻瘟病基因較少，68%的材料僅含1～2個(gè)抗瘟基因，缺乏Pita、Pi2基因；抗病性鑒定也證實(shí)，只有8份材料達(dá)到中等抗性，主要含有Pib、Pi-km、Pi9抗瘟基因。37%的引進(jìn)品種含3～6個(gè)抗稻瘟病基因，主要抗瘟基因有Pib、Pi-kh、Pi-km、Pi2、Pi9和Pita，這些材料均可為寧夏水稻抗稻瘟病的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供抗病基因。

水稻；種質(zhì)資源；抗稻瘟病基因；分子檢測

水稻(Oryzasativa)是世界上最重要的糧食作物之一。由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae；無性態(tài)：Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是影響水稻生產(chǎn)的主要病害之一[1]，嚴(yán)重威脅世界糧食安全[2-3]。實(shí)踐證明，利用抗稻瘟病基因培育抗性品種是防治水稻稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的手段[3-4]。

寧夏是中國北方粳稻主產(chǎn)區(qū)之一，近年來，隨著全球氣候變暖，稻瘟病的發(fā)生越來越嚴(yán)重，已成為寧夏水稻的常發(fā)性病害，每年都有不同程度的發(fā)生，主要以葉瘟和穗頸瘟危害為主，尤其是2006-2007年，局部地區(qū)甚至大發(fā)生，嚴(yán)重制約寧夏灌區(qū)水稻增產(chǎn)[5]。寧夏的水稻栽培歷史悠久，富有獨(dú)特的水稻遺傳資源，但這些種質(zhì)資源卻未得到充分利用，其原因之一是這些種質(zhì)資源的抗稻瘟病基因類型和抗性尚不清楚；其次是由于目前多采用常規(guī)方法育種，而該方法通常在抗病性是由主效基因控制時(shí)才最有效，并且效率低、工作量大、操作困難。

近年來發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)可快速、準(zhǔn)確鑒定出材料中所含的抗性基因類型，并利用與稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，這對(duì)于培育抗稻瘟病水稻品種有重要意義。目前，已定位的抗稻瘟病基因至少有68個(gè)位點(diǎn)，共83個(gè)主效基因，它們成簇分布于除第3染色體外的所有水稻染色體[6]。已有葉瘟、頸瘟、苗瘟等的24個(gè)抗稻瘟病基因被克隆(國家水稻數(shù)據(jù)中心http://www.ricedata.cn/)，與其緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記大多都已被開發(fā)。因此，本研究利用與抗稻瘟病基因Pita、Pi-kh、Pib、Pi2、Pi-km、Pi9和Pi5緊密連鎖的7個(gè)分子標(biāo)記，對(duì)寧夏水稻種質(zhì)資源的抗病基因進(jìn)行分子檢測與分析，旨在查明這7個(gè)抗性基因在寧夏水稻種質(zhì)資源中的分布情況，為寧夏水稻抗病性的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。

1材料與方法

1.1供試材料

寧夏自育水稻品種25份，由寧夏大學(xué)、寧夏農(nóng)科院選育；寧夏引進(jìn)水稻品種55份。具體品種名稱見表1。

表1　供試材料

1.2方法

1.2.1引物合成PCR特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京分公司合成，序列見表2。

1.2.2基因組總DNA提取采用SDS法提取總DNA，并用瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量濃度。以總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL反應(yīng)體系：10×Buffer(含Mg2+)2.0 μL，2.5 mol/mL dNTP 0.4 μL，每種引物(2 mmol/L)各1.0 μL，Taq酶0.2 μL，模板DNA 2.0 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃，5 min；然后35個(gè)循環(huán)：94 ℃，45 s，退火溫度依據(jù)引物說明而定，72 ℃，1.5 min；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色，紫外燈下觀察拍照。

表2　用于PCR反應(yīng)的引物名稱、序列及預(yù)期片段大小

2結(jié)果與分析

2.1寧夏自育水稻品種抗稻瘟病基因分子檢測結(jié)果

對(duì)寧夏自育水稻品種抗稻瘟病基因進(jìn)行分子檢測，結(jié)果(表3)表明，這些品種含抗稻瘟病基因相對(duì)較少，其中，含5個(gè)抗稻瘟病基因的品種1個(gè)(SD-1)，占供試品種總數(shù)的0.4%，經(jīng)大田抗稻瘟病試驗(yàn)鑒定為中抗[14]；含4個(gè)抗稻瘟病基因的品種4個(gè)，占供試品種總數(shù)的16%，經(jīng)大田抗稻瘟病試驗(yàn)鑒定為中抗[14]；含3個(gè)抗稻瘟病基因的品種5個(gè)，占供試品種總數(shù)的20%，經(jīng)大田抗稻瘟病試驗(yàn)鑒定為中抗[14]；其他品種含1～2個(gè)抗稻瘟病基因，占供試品種總數(shù)的68%，經(jīng)大田抗稻瘟病試驗(yàn)鑒定為感病[14]。

25個(gè)品種中，含Pita基因的品種5個(gè)，占供試品種總數(shù)的20%，主要分布于各抗病品種；含Pi-kh基因的品種7個(gè)，占供試品種總數(shù)的28%，也主要分布于各抗病品種；含Pib基因的品種13個(gè)，占供試品種總數(shù)的52%，在感病品種和抗病品種中均有分布；含Pi-km基因的品種11個(gè)，占供試品種總數(shù)的44%；含Pi9基因的品種9個(gè)，占供試品種總數(shù)的35%；含Pi2基因的品種6個(gè)，占供試品種總數(shù)的24%；含Pi5基因的品種10個(gè)，占供試品種總數(shù)的40%，主要分布于各感病品種。以上結(jié)果表明，寧夏自育水稻品種花‘118’‘花119’‘SD-1’‘SD-2’‘2007XZ-181’‘節(jié)11’等均為中等抗病品種，且含有的抗稻瘟病基因主要是Pi-kh、Pib、Pi-km和Pi9，而在感病品種中主要含有Pi5(表3、圖1～圖5)。

表3　寧夏自育水稻品種抗稻瘟病基因的分子檢測結(jié)果

注：+. 攜帶抗性基因；-.不攜帶抗性基因；MR. 中抗；S. 感病。下同。

Note: +. Carrying resistance gene; -. No carrying resistance gene; MR. Middle resistant; S. Susceptible. The same below.

2.2引進(jìn)水稻品種抗瘟病基因分子檢測結(jié)果

對(duì)引進(jìn)水稻品種抗稻瘟病基因進(jìn)行分子檢測，結(jié)果表明，這些品種含有的抗稻瘟病基因數(shù)明顯高于寧夏當(dāng)?shù)仄贩N，其中，有9個(gè)品種，如‘香粳2號(hào)’‘圣香粳2572’‘降糖稻’‘吉粳108’‘通系929’等，含4～6個(gè)抗稻瘟病基因；有11個(gè)品種含3個(gè)抗稻瘟病基因；其他品種含1～2個(gè)抗稻瘟病基因(表4和圖2)。

55份材料的抗稻瘟病基因分布見圖1，結(jié)果顯示，56%的品種含抗稻瘟病基因Pib，43.6%的品種含抗稻瘟病基因Pi-km，36%的品種含Pi9基因，32.7%的含Pita基因，25.5%的品種含Pi-kh基因，23.6%的品種含Pi5基因，9%的品種含Pi2基因。即Pib、Pi-km、Pi9和Pita是寧夏引進(jìn)品種含有的主要抗稻瘟病基因。

圖1　7個(gè)抗稻瘟病基因在55份引進(jìn)材料中的分布

序號(hào)Number品種名稱VarietyPitaPi-khPibPi-kmPi9Pi2Pi5總數(shù)Total1大胚稻 Largeembryorice--++--+32巨胚稻 Giantembryorice--+----13耐貯藏 Storagerice+-+----24銀玉 Silverjade------+15圣稻13 Shengrice13----+--16圣稻14 Shengrice14--+---+27圣稻15 Shengrice15----+--18圣稻16 Shengrice16--+---+29圣稻17(516) Shengrice17(516)----+-+210臨稻11 Linrice11--+-+-+311香粳9407 Xiangjing9407--+-+-+312圣香粳2572 Shengxiangjing2572+++++--513綠米 Greenrice---+---114小粒糯 Smallwaxy---+---115降糖稻 Hypoglycemicrice+++-+--416秋田小町 Akitakomachi--++--+317大粒稻 Largegrainrice---++--218高粱稻-1 Sorghumrice-1------+119高粱稻-2 Sorghumrice-2--+-+--220奧326 Ao326---+---121吉粳44 Jijing44--+-+--222LDC355-------023L0307S++-+---324吉2000F59 Ji2000F59--+----125優(yōu)育41 Youyu41+--+---226吉粳108 Jijing108++-++--427鹽豐47 Yanfeng47+--+---228鹽粳218 Yanjing218++-+---329吉大6號(hào) JidaNo.6--+--+-230香粳2號(hào) XiangjingNo.2++++++-631松遼5號(hào) SongliaoNo.5+++----332松遼6號(hào) SongliaoNo.6----+--133松遼7號(hào) SongliaoNo.7---+---134春香糯1號(hào) SweetglutinousriceNo.1---++--235Z-22++-++--436沈稻121 Shenrice121----+-+237法國稻 Frenchrice--+-+-+338日本晴 Nipponbare--+----139Agostone--++---240富源4號(hào) FuyuanNo.4--+----141吉粳105Jijing105+++----342吉粳106Jijing106+++----343龍粳21Longjing21---+---144龍粳31Longjing31++-+-+-445龍粳36Longjing36--+--+-246春優(yōu)1號(hào) ChunyouNo.1++++---447松遼08-27 Songliao08-27+-+----248通98-56 Tong98-56----+-+249通系929 Tongxi929++---++450通粘1號(hào) TongnianNo.1--+----151通院835 Tongyuan835+++-+--452空育131 Kongyu131--+++--353J-206--++---254Bertone--++---255越光 Koshihikari--++---2

第1行First line：1. 大胚稻Large embryo rice；2. 巨胚稻Giant embryo rice；3. 耐貯藏Storage rice；4. 銀玉Silver jade；5.未擴(kuò)增出條帶 No amplification bands； 6. 圣稻13 Sheng rice 13；7. 圣稻14 Sheng rice 14；8. 圣稻15 Sheng rice 15；9. 圣稻16 Sheng rice 16；10. 圣稻17 Sheng rice 17；11 .臨稻11 Lin rice 11；12. 香粳9407 Xiangjing 9407；13. 圣香粳2572 Shengxiangjing 2572；14. 綠米Green rice；15. 小粒糯Small waxy；16. 降糖稻Hypoglycemic rice；17. 秋田小町Akitakomachi；18. 大粒稻Large grain rice；19. 高粱稻-1 Sorghum rice-1；20. 高粱稻-2 Sorghum rice-2；21. 奧326 Ao 326；22. 吉粳44 Jijing 44；23. LDC355；24. L0307S；下同 The same below

第2行Second line：1. 寧粳16 號(hào)Ningjing No.16；2. 吉2000F59 Ji 2000F59；3. 寧粳36號(hào)Ningjing No.36；4.寧粳43號(hào)Ningjing No.43；5. 優(yōu)育41 Youyu 41；6.寧粳34號(hào)Ningjing No.34；7. 寧粳24號(hào)Ningjing No.24；8. 吉粳108 Jijing 108；9. 鹽豐47 Yanfeng 47；10. 鹽粳218 Yanjing 218；11. 吉大6號(hào)Jida No.6；12. 香粳2號(hào)Xiangjing No.2；13. 松遼5號(hào)Songliao No.5；14. 松遼6號(hào)Songliao No.6；15. 松遼7號(hào)Songliao No.7；16. 春香糯1號(hào)Sweet glutinous rice No.1；17. Z-22；18. 花118 Hua 118；19. 花119 Hua 119；20. 節(jié)11 Jie 11；21. 2007G-318；22. 沈稻121 Shen rice 121；23. 2001QX-62；24.11NX-2417；下同 The same below

第3行Third line：1. SD-1；2. SD-2；3. 2007XZ-181；4. 法國稻French rice；5. 日本晴Nipponbare；6. Agostone；7. 富源4號(hào)Fuyuan No.4；8. 吉粳105 Jijing 105；9. 寧粳38號(hào) Ningjing No.38；10.未擴(kuò)增出條帶 No amplification bands;11.未擴(kuò)增出條帶 No amplification bands；12. 寧粳40號(hào)Ningjing No.40；13.吉粳105 Jijing 106；14. 寧粳37號(hào)Ningjing No.37；15. 花94 Hua 94；16. 寧大95 Ningda 95；17. 寧粳27號(hào)Ningjing No.27；18. 2004D4；19. 寧粳41號(hào)Ningjing No.41；20. 寧粳33號(hào)Ningjing No.33；21. 龍粳21 Longjing 21；22. 龍粳31 Longjing 31；23. 龍粳36 Longjing 36；24. 春優(yōu)1號(hào)Chunyou No.1；下同 The same below

第4行Fourth line：1. 未擴(kuò)增出條帶 No amplification bands；2.未擴(kuò)增出條帶 No amplification bands；3. 松遼08-27 Songliao 08-27；4. 通98-56 Tong 98-56；5. 通系929 Tongxi 929；6. 通粘1號(hào)Tongnian No.1；7. 通院835 Tongyuan 835；8. 空育131 Kongyu 131；9. J-206；10. Bertone；11. 越光Koshihikari；12.寧粳12號(hào)Ningjing No.12；13. 湼羅Nieluo；14. 楊和白皮稻Yanghe white rice；15. 未擴(kuò)增出條帶 No amplification bands；16.未擴(kuò)增出條帶 No amplification bands；17.未擴(kuò)增出條帶 No amplification bands；下同 The same below

圖2部分水稻品種中抗性基因Pita的PCR擴(kuò)增

Fig.2PCR amplification ofPitagene in part of rice variety

圖3　部分水稻品種中抗性基因Pi2的PCR擴(kuò)增

圖4　部分水稻品種中抗性基因Pib的PCR擴(kuò)增

圖5　部分水稻品種中抗性基因Pi5的PCR擴(kuò)增

3討論與小結(jié)

由于稻瘟病菌生理小種高度易變，抗瘟品種通常在3～5 a后便喪失抗性[15]，將多個(gè)抗性基因聚合至一個(gè)品種是增加品種抗性和抗譜、培育多抗品種、避免或減緩水稻抗性喪失的有效途徑。在聚合雜交中，應(yīng)用目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，可快速、準(zhǔn)確將多個(gè)目標(biāo)基因聚合于一個(gè)重組體[16]。本研究采用7個(gè)抗稻瘟病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)寧夏自育水稻品種和部分引進(jìn)水稻品種進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，寧夏自育水稻品種含的抗稻瘟病基因數(shù)較少，抗性較差，抗病性最佳的品種僅為中等抗??；抗性材料主要含Pi-kh、Pib、Pi-km、Pi9等抗稻瘟病基因，說明寧夏自育水稻品種所含的抗稻瘟病基因Pi-kh、Pib、Pi-km、Pi9對(duì)寧夏本地的稻瘟病生理小種具有一定的抗性。而寧夏自育品種缺乏Pita和Pi2基因，而Pita基因是主效抗稻瘟病基因，在中國很多稻區(qū)均表現(xiàn)高水平的稻瘟病抗性[17]，若以此為主效基因，聚合其他抗性基因，可以提高水稻品種的持久抗稻瘟病能力。

引進(jìn)的55份水稻品種含的抗稻瘟病基因數(shù)明顯高于寧夏自育品種，部分品種含5～6個(gè)抗稻瘟病基因，且所含的主要抗稻瘟病基因是Pib、Pi-km、Pi9和Pita。這些材料可以為寧夏培育抗稻瘟病水稻品種提供優(yōu)良抗性基因。王軍等[18]研究表明，Pita、Pib抗稻瘟病基因與江蘇省粳稻穗頸瘟的抗性呈正相關(guān)，Pita與Pib聯(lián)合可顯著提高江蘇省粳稻穗頸瘟抗性。目前，穗頸瘟是寧夏地區(qū)為害最嚴(yán)重的稻瘟病害，因此，可利用含有Pita基因的引進(jìn)品種與當(dāng)?shù)仄贩N進(jìn)行MASB育種，選育抗穗頸瘟的抗病品種。董巍等[19]通過MASB方法將供體BL6的 Pi1、 Pi2抗性基因聚合至培矮64S水稻品種，篩選出10株對(duì)稻瘟病的葉瘟和穗頸瘟抗性明顯增強(qiáng)的改良株系。有研究表明，多個(gè)抗性基因聚合后，抗性基因間表現(xiàn)出極顯著的基因互作，可協(xié)同抵抗單個(gè)抗病基因不能抵抗的生理小種[16]，這是多基因聚合后抗譜拓寬、抗性增強(qiáng)的重要原因。因此，基因聚合可作為培育稻瘟病持久抗性的有效方法。

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Detection and Analysis of Rice Blast Resistance Gene in Rice Varieties Bred in Ningxia and Introduced from Outside Ningxia

ZHANG Yinxia,TIAN Lei and LI Peifu

(School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan750021,China)

The blast resistant genotype and quantity of rice germplasm in Ningxia and from other places were detected and analyzed in order to lay the foundation for breeding rice for disease resistance by Molecular marker-assisted selection (MAS). 25 rice varieties bred in Ningxia and 55 introduced varieties were detected by using the molecular markers closely linked to the rice blast resistance genesPita,Pi-kh,Pib,Pi2,Pi-km,Pi9 andPi5. The results showed that 25 rice varieties bred in Ningxia contained resistant gene were less and 68% of them only contained 1-2 resistant gene and lackedPitaandPi2 genes. Resistance evaluation of them in the field also confirmed that resistant varieties were less (8 of them) and they could reach medium resistance to rice blast and mainly contained the resistant gene ofPib,Pi-kmandPi9. 37% of 55 introduced rice varieties contained 3-6 resistance genes and main resistant gene werePib,Pi-kh,Pi-km,Pi2,Pi9 andPita. These materials could provide new resistance genes for breeding new rice varieties with blast resistant by MAS.

Rice; Germplasm; Rice blast resistance gene; Molecular marker

2016-01-04

2016-02-26

Ningxia Natural Science Foundation (No. NZ14005).

ZHANG Yinxia, female, associate professor. Research area: rice genetics and breeding. E-mail: zyinxia2008@126.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

2016-01-04修回日期：2016-02-26

寧夏自然科學(xué)基金(NZ14005)。

張銀霞，女，副教授，研究方向?yàn)樗具z傳育種。E-mail：zyinxia2008@126.com

S511.2+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A文章編號(hào)1004-1389(2016)07-0989-08

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1624.012.html