魏志平，沈　靜，周　玉，張秀云

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西楊凌　712100)

‘中華獼猴桃’根皮提取物抗煙草花葉病毒活性測定

魏志平，沈靜，周玉，張秀云

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西楊凌712100)

為開發(fā)出對環(huán)境友好的植物源抗病毒劑，以煙草花葉病毒(TMV)為供試病毒，采用半葉枯斑法測定‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物和不同極性萃取物的抗病毒活性。結(jié)果顯示， 10 g/L‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物(乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%)對TMV體外鈍化、抑制初浸染及抑制增殖的活性分別為83.55%、49.51%和48.44%；不同極性溶劑萃取物的活性也存在差異，其中，水相的活性較強(qiáng)，對TMV的體外鈍化、抑制初浸染及抑制增殖的活性分別為97.49%、54.11%和64.01%，其次是正丁醇萃取物，分別為 56.64%、27.32%和57.76%。

中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch)；煙草花葉病毒；體外鈍化活性；抑制初浸染活性；抑制增殖活性

煙草花葉病毒病是一種重要的病害。在煙草生產(chǎn)中，煙草花葉病毒廣泛分布于中國各煙草種植區(qū)[1]。煙草花葉病毒病不僅影響煙葉產(chǎn)量和外觀品質(zhì)，也使上等煙草比例下降，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，煙草花葉病毒病已經(jīng)成為當(dāng)前制約中國高品質(zhì)煙葉生產(chǎn)的重要因素[2]。

‘中華獼猴桃’是獼猴桃屬的一種，是中國特有的品種，主要分布于中國陜西、江西、湖南、湖北、福建、浙江、安徽等省[3]。獼猴桃全株有藥用作用，中醫(yī)認(rèn)為，其根皮冷，味道苦澀，活血消腫，驅(qū)逐風(fēng)和濕、利尿、止血、功效熱，可治療肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痢疾、絲蟲病、胃癌、乳腺癌等疾病[4]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃的根皮可有效清除活性氧自由基，有防病毒、護(hù)肝臟、抑制腫瘤細(xì)胞生長、增強(qiáng)免疫力等功效。近年來，作為傳統(tǒng)中藥，對獼猴桃根皮在醫(yī)藥方面作用有很多研究，但在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面研究較少。陳靠山等[5]研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃根皮提取物對小菜蛾、菜青蟲、蚜蟲均有較強(qiáng)的忌避、觸殺和胃毒作用。

與有機(jī)合成農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥有選擇性高、毒性低、易降解、不容易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[6]，尤其在抗植物病毒方面效果明顯。目前，紫莖澤蘭、商陸、臭椿等植物粗提物均已被證實(shí)具有較強(qiáng)的抗植物病毒活性[7-8]。近年來，西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心在篩選具有抗植物病毒活性的資源時(shí)發(fā)現(xiàn)，‘中華獼猴桃’根皮具有較強(qiáng)的抗植物病毒活性。因此，本研究對‘中華獼猴桃’根皮的粗提取物進(jìn)行初步分離，分別測定不同極性萃取段的活性，以期進(jìn)一步確定獼猴桃根皮的抗病毒活性成分，明確活性化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，為開發(fā)新型植物源農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試病毒與植物

‘中華獼猴桃’根皮采自秦嶺，經(jīng)鑒定后在陰涼處自然風(fēng)干，小型植物粉碎機(jī)粉碎，過50目篩。供試病毒為煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)普通株系，由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心保存；供試TMV局部枯斑寄主為心葉煙，TMV系統(tǒng)侵染寄主為普通煙(Nicotianatabacum)‘K326’品系，均在防蟲網(wǎng)溫室培育。

1.2‘中華獼猴桃’根皮提取物的制備

稱取獼猴桃根皮干粉，用φ=95%的乙醇浸泡提取3次，合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀，得到乙醇提取物，留少量浸膏備用；將乙醇提取物用水捏溶，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次各萃取3次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀，分別得到各萃取段浸膏及水相浸膏。分別稱取不同萃取物的浸膏適量，配制成10 g/L的提取物溶液，備用。

1.3抗病毒生物活性測定

1.3.1對TMV體外鈍化作用采用半葉枯斑法[9]。選取健康、葉片大小一致、4～6葉期的枯斑寄主，TMV的枯斑寄主為心葉煙。將10 g/L提取物溶液與20 mg/L病毒汁液等體積混合后，鈍化10 min，立即用食指沿葉脈方向輕輕摩擦接種于心葉煙左半葉，以右半葉接種病毒液與PBS水的等體積混合液作為對照。每株接種5片葉，每次處理3株。3 d后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)量，計(jì)算抑制率。

抑制率=(對照平均枯斑數(shù)-處理平均枯斑數(shù))/對照平均枯斑數(shù)×100%。

1.3.2抑制初侵染(預(yù)防)活性測定采用半葉枯斑法。選取健康、葉片大小一致、4～6葉期的煙苗作為寄主，沿葉脈方向?qū)⒐┰囁巹┩磕ㄓ诳莅呒闹鞯淖蟀肴~，右半葉涂抹PBS水溶液。24 h后分別用病毒汁液摩擦接種于整個葉片，病毒接種質(zhì)量濃度為20 mg/L。每株接種5片葉，每次處理3株，3 d后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)，按照 “1.3.1” 中抑制率計(jì)算公式計(jì)算抑制率。

1.3.3抑制增殖(治療)活性測定采用半葉枯斑法。選取健康、葉片大小一致、4～6葉期的煙苗作為寄主，然后用食指沿葉脈方向輕輕摩擦病毒汁液接種于整個葉片，病毒接種質(zhì)量濃度為20 mg/L。24 h后將供試藥劑涂抹在枯斑寄主左半葉，右半葉用蒸餾水處理，每株接種5片葉，每次處理3株，3 d后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)，按 “1.3.1” 抑制率計(jì)算公式計(jì)算抑制率。

2結(jié)果與分析

2.1體外鈍化活性分析

‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物及各萃取物對TMV體外鈍化活性見表1。由表1可知，乙醇提取物及不同溶劑萃取物對TMV均有一定的鈍化活性，其中，水相對枯斑抑制率最高，達(dá)97.49%，其次為乙醇提取物，為83.55%，而石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取物的枯斑抑制率均低于60%。說明，‘中華獼猴桃’根皮中對TMV體外鈍化活性的分子多為水溶性成分。

表1　‘中華獼猴桃’根皮提取物不同萃取段對TMV的體外鈍化活性

注：數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。提取液質(zhì)量濃度為10 g/L，下表同。

Note:Data are the means of 3 replicates, data with different letters in the same column are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. The mass concentrations of extract for test were 10 g/L,the same as below.

2.2抑制初侵染(預(yù)防)活性分析

‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物及各段萃取物對TMV的預(yù)防活性見表2。提前24 h用‘中華獼猴桃’根皮提取物及不同溶劑萃取物處理心葉煙，結(jié)果顯示，乙醇提取物和正丁醇萃取物、水相均對心葉煙有較好的預(yù)防活性。其中，乙醇提取物對枯斑抑制率為49.51%，水相的活性稍有提高，為 54.11%，其他3種溶劑萃取物對枯斑抑制率均較低。由此可以看出，‘中華獼猴桃’根皮中抑制TMV初侵染活性的分子存在于極性較大的水相。

表2　‘中華獼猴桃’根皮提取物不同萃取段對TMV的抑制初侵染活性(預(yù)防)

2.3抑制增殖(治療)活性分析

‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物及各段萃取物對TMV的治療活性見表3。由表3可知，提前24 h對心葉煙接種病毒后，用‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物及不同溶劑萃取物進(jìn)行處理，水相和正丁醇萃取物相的抑制率分別達(dá)到64.01%和57.76%，乙醇提取物對TMV抑制增殖率達(dá)48.44%。石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物抑制率很低，說明‘中華獼猴桃’根皮對TMV的抑制增殖活性部位在正丁醇和水相部分。

表3　‘中華獼猴桃’根皮不同萃取段對TMV抑制增殖(治療)

注：“-”表示沒有作用。

Note:“-”means no effect.

3討 論

從天然產(chǎn)物尤其從植物中獲得農(nóng)用活性成分是當(dāng)前抗病毒劑的研究熱點(diǎn)。植物中活性成分具有與環(huán)境友好、對人和動物低毒等優(yōu)點(diǎn)。獼猴桃根皮作為傳統(tǒng)中藥，具有活血消腫、清熱利尿、祛風(fēng)利濕、散熱止血的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，‘中華獼猴桃’具有抗腫瘤、抗突變、抗病毒、降血脂、保肝、提高免疫力等多種藥理活性[10-11]，具有廣泛的開發(fā)前景，但獼猴桃根皮在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用較少。有文獻(xiàn)報(bào)道，獼猴桃具有一定的抑菌活性，并從‘中華獼猴桃’分離得到三萜類、黃酮類、甾醇類、糖類、有機(jī)酸等一系列活性化合物[12-14]。篩選具有農(nóng)用活性的植物提取物時(shí)發(fā)現(xiàn)，‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗煙草花葉病毒活性。進(jìn)一步活性測試發(fā)現(xiàn)，‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物經(jīng)不同極性溶劑萃取后，其抗病毒活性表現(xiàn)不同，總體來說，水相和正丁醇萃取物的活性較強(qiáng)，而石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物的活性較弱，甚至不表現(xiàn)抗病毒活性。水相在鈍化、預(yù)防、治療方面都顯示出較好的活性，由此推測，‘中華獼猴桃’根皮提取物中的抗病毒活性成分可能是極性較強(qiáng)的糖苷類，也可能是多糖或者糖蛋白等高分子化合物[15-18]，這為下一步進(jìn)行活性成分分離提供了思路和依據(jù)。

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Anti-TMV Activity of the Extract ofActinidiachinensisPlanch. Root Bark

WEI Zhiping, SHEN Jing, ZHOU Yu and ZHANG Xiuyun

(Research and Development Center of Biorational Pesticide, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

In order to develop environmentally friendly source of plant anti-virus pesticide,the antiviral activities of the extract ofActinidiachinensisPlanch. root bark against tobacco mosaic virus (TMV) were tested by half leaf method.The results showed thatφ=95% Ethanol extract ofActinidiachinensisPlanch. root bark showed anti-TMV activities to some extent, with the inactivating, inhibiting infectivity and inhibiting multiplication activities of 83.55%,49.51% and 48.44% under the concentration of 10 g/L. Extracts with different polar solvents possessed diverse activities. The strongest activities appeared in water extract, with the inactivating, inhibiting infectivity and inhibiting multiplication activities of 97.49%, 54.11% and 64.01%, followed by n-Butanol phase, with the activities of 56.64%,27.32% and 57.76%. It is suggested that the anti-TMV compounds should be hydrosoluble.

ActinidiachinensisPlanch.; Tobacco mosaic virus (TMV); Inactivating activities; Inhibiting infectivity activities; Inhibiting multiplication activities

2015-12-07

2016-01-19

The Special Fund for Basic Scientific Research of Central University (Northwest A&F University).

WEI Zhiping, male, master student. Research area:pesticide chemistry. E-mail:18792763808@163.com

ZHANG Xiuyun, female, Ph.D,lecturer, master supervisor. Research area:pesticide chemistry. E-mail:zhangxiuyun@nwsuaf.edu.cn

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

2015-12-07修回日期：2016-01-19

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)專項(xiàng)基金。

魏志平，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥化學(xué)。E-mail:18792763808@163.com

張秀云，女，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥化學(xué)。E-mail:zhangxiuyun@nwsuaf.edu.cn

S482.1

A

1004-1389(2016)07-1087-05

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1643.048.html