馮育芳，邢進，付瑞，王吉，李曉波，王淑菁，賀爭鳴，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050）

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實驗動物金黃色葡萄球菌的實驗室檢測能力驗證結(jié)果評價

馮育芳，邢進，付瑞，王吉，李曉波，王淑菁，賀爭鳴，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050）

【摘要】目的 通過實施實驗動物金黃色葡萄球菌檢出能力驗證計劃，了解實驗動物檢測機構(gòu)檢驗?zāi)芰?，提高實驗動物質(zhì)量檢測水平。方法 按照CNAS批準(zhǔn)的能力驗證方案，通過低溫凍干制備樣品，經(jīng)過穩(wěn)定性和均勻性檢驗合格，作為能力驗證樣品。采用隨機編號，發(fā)樣給參加單位，并附作業(yè)指導(dǎo)書。在規(guī)定時限提交檢驗報告和原始記錄復(fù)印件，其結(jié)果與樣品預(yù)檢結(jié)果一致的判為滿意結(jié)果，不一致或未能提交結(jié)果的判為不滿意結(jié)果。結(jié)果共有28個實驗室參加本次能力驗證項目，其中獲得滿意驗證結(jié)果的實驗室為22個，占總參加機構(gòu)的78.57%；未得到滿意驗證結(jié)果的實驗室為6個，占21.43%。采用國標(biāo)檢測方法的有27個，采用PCR檢測方法的有1個。結(jié)論 實驗動物質(zhì)量檢測機構(gòu)對金黃色葡萄球菌的檢測能力較高，實施能力驗證計劃能夠反映實驗室的檢測水平。

【關(guān)鍵詞】實驗動物；金黃色葡萄球菌；能力驗證樣品

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），是人和動物體表、皮、毛、鼻、口腔、消化道的常見菌，也是一種條件致病菌。在大多數(shù)情況下，攜帶金黃色葡萄球菌的動物為健康動物，但當(dāng)動物由于外傷、應(yīng)激和環(huán)境造成免疫低下時，可引起化膿性睪丸炎、前列腺炎、卵巢膿腫、子宮內(nèi)膜炎等，影響動物種群繁育和動物實驗結(jié)果［1］。中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB14922.2-2011《實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測》將金黃色葡萄球菌列為SPF級大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠和兔必須排除的病原菌［2］。近5年來我室共檢測SPF級實驗動物6199只，其中，金黃色葡萄球菌陽性率為2.5%，是SPF級動物檢測中最常見的污染菌。

實驗室能力驗證，是通過實驗室間檢測結(jié)果的比對來確定實驗室能力的活動，是實驗室證明其技術(shù)能力的一種主要手段。當(dāng)前，能力驗證是國際通行的實驗室質(zhì)量控制方法之一，已成為世界各國政府以及國際實驗室認(rèn)可組織廣泛采用的重要技術(shù)手段［3］。為提高實驗動物中金黃色葡萄球菌的檢出能力，依據(jù) CNAS-RL03《能力驗證提供者認(rèn)可準(zhǔn)則》［4］進行本次檢測能力驗證工作（NIFDC-PT-011）。

本項目的研究，包括金黃色葡萄球菌能力驗證樣品的制備工作、制定合適的評價方案以及比對結(jié)果的匯總分析，探討實驗動物致病菌檢測能力驗證計劃的組織和實施工作，為今后實驗動物微生物檢測能力驗證計劃的實施提供有價值的參考和借鑒作用。

1　材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

金黃色葡萄球菌為標(biāo)準(zhǔn)參考株CMCC26112，購自中國食品藥品檢定研究院中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心；本次驗證工作設(shè)置1個干擾菌-木糖葡萄球菌，該菌為日常檢測中常見的葡萄球菌，菌株為本室分離株，均用梅里埃的Staphy生化條進行了鑒定。

1.1.2 試劑材料

凍干液由中國食品藥品檢定研究院食品化妝品檢定所提供；培養(yǎng)基包括葡萄球菌培養(yǎng)基110、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)和高鹽甘露醇培養(yǎng)基；生化鑒定試劑為梅里埃的葡萄球菌鑒定條。

1.1.3 SPF大鼠

在進行造林之后需要進行及時的驗收，但是在實際的驗收工作中存在一定的問題。第一，對需要驗收的項目沒有進行及時的自查驗收，沒有進行建檔工作。第二，一些驗收工作只是在表面上進行，沒有真正落實到位。第三，驗收圖紙和實際的情況存在一定才差距。

SPF級SD大鼠5只，體重200～250 g，2月齡，由中國食品藥品檢定研究院提供【SCXK（京）2014-0013】。實驗在中國食品藥品檢定研究院進行【SYXK（京）2011-0008】。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)控樣品制備

將36℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌和木糖葡萄球菌分別用無菌生理鹽水調(diào)成1011CFU的菌懸液備用。將75%的凍干液和25%的SPF大鼠糞便（高壓滅菌后）震蕩混合制成混懸液，每個凍存管中分裝180 μL的混懸液，然后加入20 μL金黃色葡萄球菌菌懸液作為單一陽性樣品、加入20 μL金葡菌和20 μL木糖菌菌懸液作為混合陽性樣品，加入20 μL凍干保護液作為陰性樣品，用冷凍干燥機制成凍干樣品。樣品采用隨機編號原則進行編號。

1.2.2 質(zhì)控樣品均勻性試驗

隨機抽取每種凍干質(zhì)控樣品20管，參照作業(yè)指導(dǎo)書，對樣品進行檢驗。陽性質(zhì)控樣品應(yīng)檢出金黃色葡萄球菌，陰性質(zhì)控樣品不應(yīng)檢出金黃色葡萄球菌。

將金黃色葡萄球菌能力驗證質(zhì)控樣品于-20℃、4℃、25℃、37℃保存。-20℃和4℃于0、1、2、3、4、5、6周，各抽取2個樣品，25℃、37℃于0、1、3、5、7、14、28 d，各抽取2個樣品，對質(zhì)控樣品進行檢驗。陽性樣品只要能夠檢出金葡菌即為可用，而陰性樣品不能檢出金葡菌。同時對貯藏穩(wěn)定性進行評價。

1.2.4 參加實驗室

全國共28家實驗室參加了此次能力驗證計劃。

1.2.5 檢測方法

本次能力驗證建議參考GB/T14926.14-2001實驗動物金黃色葡萄球菌檢測方法。但不規(guī)定具體測試方法，僅要求在結(jié)果報告單中注明所用的檢測方法。

1.2.6 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

陰性樣品和標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致，即判定為滿意結(jié)果。陰性樣本檢測結(jié)果或標(biāo)準(zhǔn)菌株陽性樣本的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致，即判定為不滿意結(jié)果［5］。

2　結(jié)果

2.1 質(zhì)控樣品均勻性試驗結(jié)果

隨機選取20瓶陽性、20瓶混合樣品和20瓶陰性樣品用于均勻性驗證，所有樣品以隨機次序在重復(fù)性條件下分別對樣品中的金黃色葡萄球菌進行檢測。在20瓶陰性樣品中均未檢出目標(biāo)菌，而在20陽性樣品和20瓶混合樣品中均檢出目標(biāo)菌，表明所制備的樣品是均勻的。

2.2 質(zhì)控樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果

按照1.2.3的方法對所制備的質(zhì)控品進行溫度和運輸穩(wěn)定性試驗，冷藏（4℃）存儲 6周，常溫（2℃）放置28 d或高溫（37℃）放置14 d，陽性檢測率均能達到100%。常溫（25℃）或高溫（37℃）運輸7 d，陽性檢測率也能達到100%，也證明了所制備質(zhì)控品的穩(wěn)定性達到發(fā)放要求。

2.3 實驗室反饋結(jié)果及采用方法

參加此次比對共28個實驗室，均在規(guī)定時間內(nèi)給出了反饋結(jié)果；根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)滿意的實驗室有22個，占實驗室總數(shù)的79%，不滿意的實驗室有6個，占實驗室總數(shù)的21%，這6家不滿意實驗室中，有4家將混合陽性樣品檢測為陰性，有1家將陰性樣品檢測為陽性，有1家將陽性樣品檢測為陰性。本次結(jié)果不公布具體實驗室名稱，僅以實驗室編號進行統(tǒng)計，實驗室編號從 NIFDC-PT-011-001～NIFDC-PT-011-028，具體結(jié)果見表1。

表1　實驗動物金黃色葡萄球菌檢出能力驗證結(jié)果匯總Tab.1 Summaries of validation of the detection ability of Staphylococcus aureus in laboratory animals

3　討論

從NIFDC-PT-011實驗動物金黃色葡萄球菌檢出能力驗證計劃結(jié)果報告中可以看出，本次能力驗證計劃共計有28家實驗室參加，所有實驗室均在規(guī)定時間內(nèi)提交了結(jié)果反饋單。其中滿意結(jié)果的22家，占79%，不滿意結(jié)果有6家，占21%，27家實驗室均參照了國標(biāo)中的方法進行檢測，只有1家實驗室采用的是PCR方法進行檢測。6家不滿意實驗室中有4家將混合陽性樣品判定為陰性，一方面說明樣品因為摻雜了木糖葡萄球菌對金黃色葡萄球菌的檢測有一定的影響，致使在分離培養(yǎng)時出現(xiàn)了漏檢金葡菌的現(xiàn)象，另一方面也說明在參加比對計劃時應(yīng)盡可能采用2種以上的培養(yǎng)基對樣品進行檢測，以免造成漏檢，出現(xiàn)對結(jié)果的判斷不正確。必要時可實行2人同時檢測，避免出現(xiàn)主觀判斷錯誤。

能力驗證是實驗室檢測質(zhì)量監(jiān)控的重要手段，既是實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的補充，又是政府和社會了解實驗室檢測能力的重要方法［9］。能力驗證作為日常監(jiān)督檢查的輔助手段，能夠有效提升實驗室的檢測能力。促進實驗室保持有效的檢測能力，同時也幫助部分實驗室及時發(fā)現(xiàn)自身的不足并加以改進，為更好地檢測實驗動物提供有力的技術(shù)支撐［5-8］。

參考文獻

［1］ 方喜業(yè)，邢瑞昌，賀爭鳴.實驗動物質(zhì)量控制［M］.北京，中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，008：371-372.

［2］ GB/T14922.2-2011，實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測［S］.中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

［3］ CNAS-RL02，能力驗證規(guī)則［S］.中國合格評定國家認(rèn)可委員會，2010.

［4］ CNAS-RL03，能力驗證提供者認(rèn)可準(zhǔn)則［S］.中國合格評定國家認(rèn)可委員會，2010.

［5］ 邢進，馮育芳，王洪，等.實驗動物中綠膿桿菌檢測能力驗證的結(jié)果與分析［J］.中國藥事，2014，28（9）：982-989.

［6］ 王洪，魏杰，李芳芳，等.實驗動物質(zhì)檢機構(gòu)堿性磷酸酶-1測定能力驗證評價［J］.中國藥事，2014，28（12）：1339-1341.

［7］ 李曉波，王洪，付瑞，等.實驗大鼠細小病毒H-1株抗體檢測能力驗證結(jié)果評價［J］.中國藥事，2014，28（9）：990-994.

［8］ 魏杰，王洪，李芳芳，等.實驗室能力驗證用酯酶-3標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性和穩(wěn)定性研究［J］.中國藥事，2014，28（9）：990-994.

［9］ 陳文勝，羅建波，劉禮平.實驗室質(zhì)量監(jiān)督工作探討［J］.華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，33（增刊）：105-107.

Evaluation of the ability to detect Staphylococcus aureus in experimental animal laboratories

FENG Yu-fang，XING Jin，F(xiàn)U Rui，WANG Ji，LI Xi-bo，WANG Shu-jing，HE Zheng-ming，YUE Bing-fei*
（Institute for Laboratory Animal Resources，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective To verify the detection ability of experimental animal quality detection laboratories in China for Staphylococcus aureus.Methods The testing samples for Staphylococcus aureus detection were prepared by bacterial culture，homogeneity test and stability test，according to the study plan approved by CNAS.Then the samples and operation instruction were sent to the participant laboratories.The detection reports from these laboratories should be submitted before the deadline expires，and the collected data were summarized and analyzed.Results There were 28 laboratories which joined to this test plan.Among them 22 laboratories（78.57%）achieved satisfactory test results，and six laboratories （21.43%）had unsatisfactory test results.27 Laboratories used the national standard detection assay，while only one laboratory used PCR assay.Conclusions Most of experimental animal quality testing laboratories in China have sufficient proficiency in detection of Staphylococcus aureus.The obtained information are very helpful for the laboratory ability verification testing in future.

【Key words】Laboratory animals；Staphylococcus aureus；Detection ability validation

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）02-0195-04

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.016

［基金項目］國家科技支撐計劃（編號：2015BAI09B00）。

［作者簡介］馮育芳（1981-），女，副研究員，研究方向：實驗動物微生物檢測。E-mail：fyf307@126.com

［通訊作者］岳秉飛（1960-），男，研究員，研究方向：實驗動物學(xué)。E-mail：y6784@126.com

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com

［收稿日期］2016-01-13