朱超，朱瑩瑩，李二妮，宋新峰，張志芹

（德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東德州 253023）

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研究報(bào)告

糖尿病合并冠心病ZDF大鼠模型的構(gòu)建

朱超，朱瑩瑩，李二妮，宋新峰，張志芹

（德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東德州 253023）

【摘要】目的 構(gòu)建Ⅱ型糖尿病合并冠心病的大鼠模型。方法 采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合連續(xù)注射鹽酸異丙腎上腺素（ISO）制備Ⅱ型糖尿病合并冠心病的Zucker糖尿病肥胖大鼠（Zucker diabetic fatty，ZDF）模型。通過(guò)血清肌酸激酶（CK）、血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心電圖ST波及心臟組織形態(tài)評(píng)價(jià)模型。結(jié)果 非DM模型組和DM-CHD組隨給藥次數(shù)增多CK表達(dá)逐漸升高，CK-MB表達(dá)先升高后下降，說(shuō)明大鼠心肌損傷已形成。模型大鼠心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段的偏移表明心肌損傷已經(jīng)形成。注射模型組大鼠心肌病理切片結(jié)果顯示空白對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞正常，ZDF大鼠在被連續(xù)注射5 d ISO后心肌壞死面積達(dá)到心肌截面的1/2，10 d后心肌壞死面積達(dá)到心肌截面的3/4。結(jié)論 CK、CK-MB含量變化、心電圖ST波變化和心肌病理切片顯示造模已成功。ISO能造成一定程度的心肌損傷，可采用連續(xù)注射ISO進(jìn)行冠心病模型的構(gòu)建。本文建立了一種簡(jiǎn)便的采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合連續(xù)注射ISO的糖尿病合并冠心病大鼠模型的構(gòu)建方法。

【關(guān)鍵詞】糖尿病合并冠心??；大鼠；鹽酸異丙腎上腺素；肌酸激酶；肌酸激酶同工酶

Ⅱ型糖尿病 （type II diabetes mellitus，type II DM）和冠心?。╟oronary heart disease，CHD）同屬于代謝性疾病，具有共同的危險(xiǎn)因子。研究表明［1］，高胰島素血癥是引起糖尿病和心血管疾病等代謝相關(guān)疾病的共同因素，而糖尿病合并冠心病后的乘積效應(yīng)會(huì)加速動(dòng)脈粥樣硬化。CHD是糖尿病最常見(jiàn)而嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是致使糖尿病患者死亡的主要原因，危害遠(yuǎn)大于糖尿病本身。CHD因其高致殘率、高發(fā)病率和高致死率被稱(chēng)為人類(lèi)健康的“頭號(hào)殺手”，所以該病的早診斷、早治療將大大降低疾病的危害，尤其在糖尿病患者中尋找有效的預(yù)防和治療CHD的方法意義重大。因此，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的動(dòng)物模型構(gòu)建是探索疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程、尋找有效治療途徑的重要環(huán)節(jié)。

研究中多以大鼠作為模型動(dòng)物。大鼠對(duì)外源性膽固醇吸收率低，無(wú)膽囊，有自發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）形成的特性，單純高脂喂養(yǎng)很難產(chǎn)生AS病變［2］。多以藥物誘導(dǎo)與高脂喂養(yǎng)和（或）損傷聯(lián)合的方法造成AS病變［3-11］。現(xiàn)已培育出脂蛋白代謝基因缺陷鼠，使得大鼠在動(dòng)脈粥樣硬化模型的研究中重新受到高度重視［11］。大鼠AS病變的形態(tài)以及斑塊的破裂位置與人類(lèi)非常相似［12］。同時(shí)，大鼠冠脈側(cè)支循環(huán)缺乏，心肌壞死出現(xiàn)較早，穩(wěn)定性、重復(fù)性好，心肌梗死后與心力衰竭和臨床心肌梗死的病理生理過(guò)程接近［13］。

Zuker糖尿病肥胖大鼠（Zuker diabetic fatty rat，ZDF rat）是常用的Ⅱ型DM模型動(dòng)物［14］，其特征為肥胖、胰島素抵抗、高血糖、高血脂、高胰島素血癥、高血壓。其肥胖與血腦屏障上的瘦素載體減少有關(guān)，瘦素與中樞神經(jīng)系統(tǒng)受體結(jié)合能夠啟動(dòng)調(diào)節(jié)攝食和機(jī)體能量平衡，此平衡如果被打破可導(dǎo)致肥胖發(fā)生，表現(xiàn)出糖尿病癥狀［15-19］。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎是制備大鼠心肌病模型的常用方法，但是由于采用麻醉、手術(shù)等措施增加了造模難度和模型死亡率［20-23］。為降低模型構(gòu)建難度和死亡率，本文嘗試基于ZDF大鼠，采用高脂喂養(yǎng)結(jié)合連續(xù)注射鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）的方法構(gòu)建Ⅱ型糖尿病合并冠心病的動(dòng)物模型。

1　材料與方法

ZDF大鼠，SPF級(jí)，雄性，8周齡，包括對(duì)照鼠（無(wú)糖尿病癥狀，體重230±10 g）與DM模型鼠（有糖尿病癥狀，體重340±10 g），由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供［SCXK（京）2012-0001］。培養(yǎng)條件：室溫 （20±2）℃，濕度 （50± 20）%。按飼養(yǎng)動(dòng)物的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑、材料與儀器

肌酸激酶 （CK）試劑盒、肌酸激酶同工酶（CK-MB）試劑盒，購(gòu)于南京安培化工科技有限公司；鹽酸異丙腎上腺素注射液 （ISO，規(guī)格：1 mg/2 mL），上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)；湘儀H2050R高壓冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)；Thermo Fisher Multiskan MK3酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)；ACCU-CHEK Active血糖檢測(cè)儀，德國(guó)羅氏診斷有限公司生產(chǎn)；ECG-1103LW VET心電圖機(jī)，深圳凱沃爾電子有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠分組及模型制作

冠心病模型的構(gòu)建參照已有文獻(xiàn)報(bào)道，并稍做改動(dòng)［24］。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)，非 DM鼠喂以普通飼料，DM模型鼠喂以高脂飼料 （Purina 5008）。2周后，測(cè)大鼠血糖值，非DM大鼠隨機(jī)血糖值均小于11 mmol/L，DM大鼠隨機(jī)血糖值均大于16.7 mmol/ L。將大鼠隨機(jī)分成4組：① 空白對(duì)照組 （n=6）。非DM大鼠每天皮下注射生理鹽水，連續(xù)10 d，第11天早晨采樣；② 非DM模型組 （n=6）。非DM大鼠每天皮下注射ISO（1 mg/kg），連續(xù)10 d。分別于注射ISO 5、10 d后，即實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第6天（采樣點(diǎn)1，造模5 d）、第11天（采樣點(diǎn)2，造模10 d）早晨采樣。③DM對(duì)照組（n=6）?；继悄虿〈笫竺刻炱は伦⑸渖睇}水（1 mg/kg），連續(xù)10 d，第11天早晨采樣。④ DM-CHD組 （n=12）。患糖尿病大鼠每天皮下注射ISO（1 mg/kg），連續(xù)10 d。分別于注射ISO 5、10 d后，即實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第6天（采樣點(diǎn)1，造模5天）、第11天（采樣點(diǎn)2，造模10 d）早晨采樣。采樣點(diǎn)1、2采血進(jìn)行血糖、CK和CK-MB的測(cè)定。采樣點(diǎn)1處死半數(shù)大鼠，采樣點(diǎn)2處死其余大鼠，取心臟做組織切片，觀察形態(tài)。

1.3.2 血漿采集

采樣前大鼠禁食12 h，可自由飲水。采用眼內(nèi)眥取血法［25］，從各組ZDF大鼠眼內(nèi)眥取血約0.5 mL至肝素鈉化的1.5 mL離心管中，3000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層血漿，置于1.5 mL離心管中，肝素抗凝血漿直接用于CK和CK-MB的測(cè)定。取血用毛細(xì)管上的血可直接用于血糖檢測(cè)。

5）課堂教學(xué)是以教師講課為主的知識(shí)傳授，方式比較單一。目前控制工程基礎(chǔ)課程計(jì)劃學(xué)時(shí)設(shè)置為54學(xué)時(shí)（其中6學(xué)時(shí)為實(shí)驗(yàn)），簡(jiǎn)單以教師授課效果來(lái)評(píng)價(jià)極為不公平。所導(dǎo)致的結(jié)果，一方面，學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣大大減弱，影響學(xué)生對(duì)基本知識(shí)的掌握；另一方面，教師講授過(guò)于死板，課堂教授缺乏活力，難以調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性。

1.3.3 酶活性檢測(cè)

CK、CK-MB的分析分別采用CK試劑盒、CKMB試劑盒檢測(cè)。采樣點(diǎn)采集的血樣肝素抗凝后分離血漿，立即用Thermo Fisher酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定CK和CK-MB含量。

1.3.4 心電圖檢測(cè)

對(duì)空白對(duì)照組、模型組第5天和模型組第10天ZDF大鼠于處死前進(jìn)行心電圖檢測(cè)，每次采集5 min。觀察II導(dǎo)聯(lián)ST波的變化情況，記錄ST波最大值（表1）。

2　結(jié)果

2.1 檢測(cè)指標(biāo)變化

2.1.1 CK活性變化

空白對(duì)照組和DM對(duì)照組的CK含量在第5天和第10天差異無(wú)顯著性 （P＞0.05）。第5天非DM模型組和DM-CHD組的CK含量較對(duì)照組略高但并不顯著（P＞0.05）。第10天非DM模型組和DM-CHD組的CK含量較對(duì)照組有顯著升高（P＜0.01），且與第5天的CK含量差異有顯著性 （P＜0.01）。隨著ISO注射次數(shù)的增多，CK含量呈現(xiàn)顯著升高，表明大鼠的心肌損傷已經(jīng)發(fā)生。見(jiàn)圖1。

圖1　ISO對(duì)ZDF大鼠血漿CK含量的影響Note.Group 1：Control.Group 2：Model without DM. Group 3：DM Control.Group 4：DM-CHD.Fig.1 The effect of ISO on plasma CK in the ZDF rats

2.1.2 CK-MB活性變化

空白對(duì)照組和DM對(duì)照組的CK-MB含量在第5天和第10天差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。第5天非DM模型組和DM-CHD組的CK-MB含量較對(duì)照組有顯著升高（P＜0.01）。第10天非DM模型組和DM-CHD組的CK-MB含量較對(duì)照組顯著降低（P＜ 0.01），且與第5天的CK-MB含量差異有顯著性（P ＜0.01）。隨著ISO注射次數(shù)的增多，CK-MB含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，表明大鼠的心肌損傷已經(jīng)發(fā)生。見(jiàn)圖2。

圖2　ISO對(duì)ZDF大鼠血漿CK-MB含量的影響Note.Group 1：Control.Group 2：Model without DM. Group 3：DM Control.Group 4：DM-CHD.Fig.2 The effect of ISO on plasma CK-MB in the ZDF rats

2.1.3 血糖變化

采樣點(diǎn)測(cè)量血糖值顯示，非DM組隨機(jī)血糖值均小于11.0 mmol/L，且各大鼠之間差異無(wú)顯著性；DM組隨機(jī)血糖值均大于16.7 mmol/L，且各大鼠之間差異無(wú)顯著性。

2.1.4 心電圖ST波變化

比較空白對(duì)照組和DM-CND組大鼠的心電圖ST段最大值（mV）。DM-CHD第5天，與空白對(duì)照組（0.06 s＜QRS＜0.12 s）相比模型組大鼠心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段有顯著下移現(xiàn)象且伴有QRS波群增寬（0.17 s＜QRS＜0.29 s），提示大鼠可能出現(xiàn)急性缺血性心肌損傷；DM-CHD第10天II導(dǎo)聯(lián)ST波顯著抬高，提示大鼠可能已由急性心肌缺血發(fā)展為急性心肌梗死，表明模型組急性缺血性心肌損傷已經(jīng)形成［26-27］。此結(jié)果將在心肌組織形態(tài)變化中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.1.5 組織形態(tài)變化

心肌病理切片結(jié)果顯示空白對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞正常（圖3 A）；DM大鼠在被連續(xù)注射ISO 5 d后即造成心肌損傷，主要病變?yōu)樾膬?nèi)膜下心肌壞死，呈多灶性條索狀、大片壞死，壞死面積超過(guò)心肌截面的1/2，壞死處細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，有少許纖維母細(xì)胞和新生小血管（圖3 B）；連續(xù)10 d注射ISO后，心肌損傷范圍增大至心肌截面的3/4以上，壞死出炎細(xì)胞大量減少，纖維母細(xì)胞增多，出現(xiàn)肉芽組織增生修復(fù)（圖3 C）。大鼠心臟組織形態(tài)變化符合心電圖ST段偏移的提示結(jié)果。

表1　連續(xù)注射ISO對(duì)DM大鼠心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST波的影響Tab.1 The effect of continuous injection of ISO on ST segment in the rat ECG part II（±s，n≥5）

表1　連續(xù)注射ISO對(duì)DM大鼠心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST波的影響Tab.1 The effect of continuous injection of ISO on ST segment in the rat ECG part II（±s，n≥5）

注：與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；模型組第5天與第10天比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。Note.Compared with the control group：*P＜0.05，**P＜0.01.Model groups 5-days vs.10-days：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01.

采集時(shí)間/min Scan time/min 0.5　1　2　3　4　5空白對(duì)照組Control　0.03±0.02　0.03±0.02　0.05±0.03　0.04±0.02　0.04±0.03　0.03±0.02組別Groups DM-CHD組Group DM-CHD（第5天）（5 days）-0.11±0.04**　-0.12±0.08**　-0.15±0.09**　-0.15±0.10*　-0.17±0.08**　-0.13±0.05**DM-CHD組Group DM-CHD（第10天）（10 days）0.12±0.02**▲▲　0.14±0.03**▲▲　0.10±0.02*▲▲0.13±0.03**▲▲0.12±0.03**▲▲　0.11±0.02**▲▲

圖3　連續(xù)注射ISO對(duì)心肌組織結(jié)構(gòu)的影響Note.（A）Control group.（B）ISO injection for 5 consecutive days.（C）ISO injection for 10 consecutive days.Fig.3 The effect of continuous injection of ISO on the myocardial structure

3　討論

心肌特異性酶是心肌損傷的標(biāo)志物，對(duì)于心肌損傷診斷有非常重要的意義。CK通常存在于動(dòng)物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個(gè)與肌肉收縮、細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、ATP再生有直接關(guān)系的關(guān)鍵激酶，它能夠可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)［28］。而ISO通過(guò)作用于心臟的β1和β2腎上腺素受體而產(chǎn)生作用，會(huì)產(chǎn)生正性肌力作用和變時(shí)性作用［29］。CK是心肌梗死的重要診斷依據(jù)和預(yù)報(bào)因子，尤其對(duì)心內(nèi)壁下心肌梗死和心肌缺血的診斷比其他因素靈敏度高。急性發(fā)病時(shí)CK含量上升，且增高程度與心肌受損程度基本一致。對(duì)照模型組大鼠和DM模型組大鼠注射ISO后，血漿CK升高，表明ISO對(duì)心肌功能有一定程度的影響。

臨床上認(rèn)為特征性心肌損傷標(biāo)志物CK-MB的水平，先升高后逐漸降低并伴隨心電圖ST段的抬高或下移，可以作為急性心肌缺血性損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)。CK-MB主要分布在心肌中，是心肌損傷的敏感指標(biāo)。心肌損傷后在2～12 h內(nèi)血清CK-MB活性急劇上升，一般持續(xù)2～3 d，在判斷心肌損害上有一定靈敏性［30-31］。然而 CK-MB恢復(fù)正常的時(shí)間較快，故CK-MB診斷窗口期短，容易出現(xiàn)漏診現(xiàn)象。ZDF大鼠注射ISO后，CK-MB水平先升高后降低，說(shuō)明ISO能夠?qū)π募≡斐梢欢ǔ潭鹊膿p傷。

心電圖ST段的偏移是評(píng)價(jià)大鼠心肌缺血或心急梗死的重要指標(biāo)［26-27，32-33］。本研究中心電圖 ST段出現(xiàn)偏移，連續(xù)注射5 d ISO后大鼠心電圖ST段顯著下移并伴有QRS波群增寬，提示大鼠急性缺血性心肌損傷已形成。繼續(xù)注射ISO至第10天，大鼠心電圖ST段抬高，提示大鼠出現(xiàn)急性心肌梗死。心電圖ST段的變化說(shuō)明大鼠在連續(xù)注射ISO過(guò)程中由急性缺血性心肌損傷發(fā)展為急性心肌梗死。心臟組織形態(tài)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了心肌損傷的形成。

本研究中CK、CK-MB的含量變化、心電圖ST段的偏移和心臟組織形態(tài)變化，都表明大鼠反復(fù)皮下注射ISO能夠?qū)е滦募p傷。以ISO作為誘導(dǎo)藥物，以ZDF大鼠作為載體在糖尿病模型的基礎(chǔ)上制備糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型具有較強(qiáng)的可操作性，簡(jiǎn)便、耗時(shí)短（24 d）、成模率高 （6只大鼠除1只死亡，5只出現(xiàn)心肌損傷，成模率大于80%）。以此方法構(gòu)建的模型可用于糖尿病合并冠心病相關(guān)的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，為早期診斷、致病機(jī)理、療效評(píng)價(jià)等研究提供實(shí)驗(yàn)載體。

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Establishment of a Zuker diabetic fatty rat model of type II diabetic coronary heart disease

ZHU Chao，ZHU Ying-ying，LI Er-ni，SONG Xin-feng，ZHANG Zhi-qin
（College of Medicine&Nursing，Dezhou University，Dezhou Shandong 253023，China）

【Abstract】Objective The purpose of the present study was to develop an animal model of type II diabetic coronary heart disease in Zuker diabetic fatty（ZDF）rats.Methods The ZDF rat model of type II diabetic coronary heart disease was prepared by high-fat diet feeding combined with continuous injection of isoprenaline hydrochloride（ISO）in a dose of 1 mg·mL-1for 10 consecutive days.Serum creatine kinase（CK），and creatine kinase izozyme（CK-MB），ST segment in electrocardiogram（ECG）and myocardial pathological changes were detected to evaluate the rat model.Results CK of both the control and model groups was gradually increased with ISO injections，while CK-MB increased first and then decreased.The ST segment in ECG part II had significant changes.The pathological examination found that about half of the myocardial cross section in the model group was necrotic after injections of ISO for 5 days and more than 3/4 of the myocardial cross section was necrotic after injection of ISO for 10 days.The results indicated that ISO caused myocardial injury in ZDF rats.Conclusions The variation of CK-MB，CK，ST segments in ECG and myocardial necrosis indicate that the model is successfully established.The use of high-fat diet combined with continuous injection of isoprenaline hydrochloride in a dose of 1 mg·mL is a simple way to develop a Zuker diabetic fatty rat model of type II diabetic coronary heart disease.

【Key words】TypeⅡdiabetic coronary heart disease；Mouse；Isoprenaline；Creatine kinase；Creatine kinase izozymes

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0111-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.001

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81202502）。

［作者簡(jiǎn)介］朱超（1983-），男，講師，博士。主要從事糖尿病及其合并癥的代謝組學(xué)研究。Email：zhuchao830111@163.com

Corresponding author：ZHU Chao，Email：zhuchao830111@163.com

［收稿日期］2015-11-26