魏杰，王洪，鞏薇，賀爭鳴，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

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實驗小鼠腎勻漿中酯酶-3的實驗室測定能力驗證結(jié)果評價

魏杰，王洪，鞏薇，賀爭鳴，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【摘要】目的 通過實驗小鼠腎勻漿中酯酶-3項目的檢測比對，了解全國實驗動物質(zhì)量檢測實驗室的水平，促進各實驗室加強質(zhì)控。方法 按照CNAS批準的能力驗證方案，制備樣品并將穩(wěn)定性和均勻性合格的樣品作為能力驗證樣品，進行隨機編號，隨作業(yè)指導書一起發(fā)放給參加單位。在規(guī)定時限提交檢驗報告和原始記錄復印件，其結(jié)果與樣品預檢結(jié)果完全一致的判為優(yōu)秀結(jié)果；除雜合型判定以外的結(jié)果均一致的判定為滿意結(jié)果，否則判為不滿意結(jié)果。結(jié)果 共10個實驗室報名參加本次比對試驗，其中優(yōu)秀結(jié)果0個實驗室；滿意結(jié)果的有9個實驗室，占參加比對實驗室的90.0%；不滿意結(jié)果1個實驗室，占參加比對實驗室的10.0%。結(jié)論 本次能力驗證項目反映了各參與實驗室在實驗小鼠腎勻漿中酯酶-3的總體檢測能力較高，但檢測細節(jié)及部分實驗室技術(shù)水平還有待提高。

【關(guān)鍵詞】能力驗證；質(zhì)量控制；實驗動物；酯酶-3

能力驗證是一項用于評審實驗室進行測試或測量工作能力的活動［1］。開展實驗室間的能力驗證項目，是一種國際通行的實驗室質(zhì)量控制方法，被廣泛用于國際實驗室之間的質(zhì)控互認，也是實驗室質(zhì)量控制的重要工作［2］。隨著實驗動物質(zhì)量檢測機構(gòu)及認證檢測項目增加，對各實驗室在相同項目中是否具備相應(yīng)的檢測能力也亟待比對驗證。為此，中國食品藥品檢定研究院根據(jù)中國合格評定國家認可委員會（CNAS）的有關(guān)要求，組織實施了本次能力驗證計劃：NIFDC-PT-020實驗小鼠腎勻漿中酯酶-3檢測。

酯酶-3檢測項目是GB/T14927.1-2008《實驗動物近交系小鼠、大鼠生化標記檢測法》中規(guī)定的遺傳生化標記常規(guī)14個位點之一，能在蛋白水平上反映小鼠基因表達差異，廣泛應(yīng)用于近交系小鼠常規(guī)和新品系鑒定中［3，4］。其樣品來源易得，檢測方法成熟，檢測所需試劑儀器經(jīng)濟，電泳圖譜帶型豐富清晰，結(jié)果易于判斷，是進行實驗室檢測能力比對的理想項目［5］。

本次能力驗證項目即通過酯酶-3檢測的室間比對，了解不同實驗室在該項目上的技術(shù)水平，評價其檢測能力，考察室間差異和存在問題，促進各實驗室加強管理和提高檢測水平，積累質(zhì)控數(shù)據(jù)，為質(zhì)量管理體系的建設(shè)和完善提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1 檢測樣品

本項目提供的待測樣為小鼠腎勻漿凍干樣品。BALB/c、C57BL/6、C3H三品系小鼠各15只，8周齡，均來自中國食品藥品檢定研究院【SCXK（京）2012-0003】。動物取材實驗均在中國食品藥品檢定研究院動物設(shè)施內(nèi)完成【SYXK（京）2011-0008】。二氧化碳安樂術(shù)處死動物，取腎臟剝除筋膜，按照2∶1（V/W）比例加入預冷的蒸餾水，并用組織勻漿器勻漿。勻漿后于4℃低溫高速離心機中離心，15 000 r/min，30 min。分離上清，加保護劑，以每瓶100 μL的裝量分裝至西林瓶，上凍干機凍干，加蓋，封口膜封口，隨機編號后密封冷藏。具體制備方法及樣品的穩(wěn)定性和均一性驗證已另文發(fā)表，經(jīng)測定能夠滿足質(zhì)量控制的要求［5，6］。

每個參加實驗室分配3瓶樣品，a型、c型、ac 型3個組別各抽取一瓶并隨機編號，通過EMS冷藏寄發(fā)。

1.2 參加實驗室

本項目面向全國省市級實驗動物質(zhì)量檢測中心、藥檢所和相關(guān)檢測實驗室開放，對每個參加者賦予一個代碼，凡說明參加者的檢測結(jié)果和能力評價時均以代碼表示。共有10個實驗室報名參與，遍布北京、上海、廣東、黑龍江、遼寧、陜西、新疆、湖南、湖北9個省市，其中北京2家單位參加。

1.3 檢測項目和要求

檢測項目為小鼠腎勻漿中酯酶-3，檢測指標包括酯酶-3的a基因型、c基因型和ac基因型，其中ac型為雜合型?；蛐团卸梢妶D1。

圖1　酯酶-3結(jié)果判定型別圖Note.1-4 stand for types c，ac，a and a，respectively.Fig.1 Detection mapping of esterase-3 types

本項目所提供的樣品可在開封后直接加入70 μL蒸餾水溶解取樣測定，無需其余加工處理，并附有作業(yè)指導書和樣品狀態(tài)確認表；如樣品狀態(tài)確有異常，可聯(lián)系發(fā)樣單位及時補寄。針對酯酶-3項目的檢測，可以參照GB/T14927.1-2008的標準方法，但沒有規(guī)定統(tǒng)一方法；測定結(jié)果為定性的結(jié)果，按照樣品編號報告為所見酶譜基因型：a型/c型/ac型，但作業(yè)指導書中沒有提示會出現(xiàn)ac雜合型。測定完成后，需在檢測時限內(nèi)一并提交檢測報告和檢驗原始記錄復印件。

1.4 結(jié)果評價

依據(jù)GB/T14927.1-2008，對各實驗室提供的原始記錄和檢測結(jié)果進行評價。參考CNAS能力評價指南的說明［7］，本項目評價考察了時效性、真實性和結(jié)果正確性三個部分，分為優(yōu)秀、滿意和不滿意三個等級。能在規(guī)定時限內(nèi)完成實驗、提交的原始記錄含電泳圖片詳實可靠、反饋結(jié)果與預設(shè)完全一致即為優(yōu)秀；鑒于穩(wěn)定性實驗中雜合型受溫度影響較大的因素考慮［5］，當滿足時限和材料完整、除ac雜合型以外反饋的結(jié)果均與預設(shè)結(jié)果一致時，可視為滿意結(jié)果；否則，即為不滿意結(jié)果。

2　結(jié)果

本次小鼠酯酶-3能力驗證項目共發(fā)放了10個實驗室，均按時提交了檢測結(jié)果、原始記錄，但沒有實驗室上報了雜合型結(jié)果，即沒有優(yōu)秀的實驗室。

對10個實驗室的其余結(jié)果進行統(tǒng)計，獲滿意結(jié)果的實驗室9家，占參加單位的90.0%；不滿意結(jié)果有1家，占參加單位的10.0%，詳見表1。關(guān)于確認表和原始記錄細節(jié)的一些情況也做一匯總（樣品狀態(tài)均為良好），不計入最終結(jié)果評價，僅反映各實驗室參與此次能力驗證計劃的實際情況，具體可參見表2。

3　討論與建議

NIFDC-PT-020實驗小鼠腎勻漿中酯酶-3檢測是第三次開展的全國范圍的實驗動物質(zhì)檢機構(gòu)能力驗證比對項目之一。相比于前兩次，此次能力驗證項目有如下特點：（1）參與實驗室數(shù)量歷史最高，歷經(jīng)幾年發(fā)展具備相應(yīng)檢測能力的實驗室有所增加，同時，能力驗證項目的影響力逐年提升；（2）樣品的制備發(fā)放流程更加規(guī)范，對均一性和穩(wěn)定性的驗證更為細致；（3）項目指標設(shè)定靈活，設(shè)定了ac雜合型，更貼近實際檢測需求；（4）方法選擇更為多樣，有一家實驗室（代碼2014-LA-006）利用了酯酶-3小鼠和大鼠的檢測方法，選擇2種緩沖液分別實驗，并得到了一致的結(jié)果；（5）結(jié)果考核內(nèi)容不斷豐富，增加了時效性和原始記錄真實性的部分。通過組織實施這一項目以及對結(jié)果的整理分析，也發(fā)現(xiàn)了尚存的部分問題。

3.1 不滿意結(jié)果原因分析

檢測結(jié)果不滿意的1家實驗室（代碼2014-LA-004），樣品CB-G-160的設(shè)定結(jié)果是a型，樣品CBG-233的設(shè)定結(jié)果是c型，該實驗室得出的結(jié)果與設(shè)定結(jié)果完全相反。同時，ac雜合型樣品即便在降解的情況下，也可以表現(xiàn)為重帶c型。但與其他9家實驗室不同的是，該實驗室把該雜合型判定為a型。從該實驗室提供的結(jié)果圖中，也很難看出目的條帶。綜合分析認為，該實驗室沒有檢出目的條帶，判定為不滿意結(jié)果。

3.2 應(yīng)注重原始記錄的完整性

在本次結(jié)果統(tǒng)計中，沒有填寫上樣量的實驗室有2家，0.3 μL上樣量的實驗室有2家（含不滿意結(jié)果的1家），0.6 μL上樣量的實驗室有5家，0.9 μL上樣量的單位有1家。可見上樣量的差異并不是造成是否能夠得到滿意結(jié)果的關(guān)鍵影響因素，但仍應(yīng)填寫完整。本次能力驗證項目考察了檢測的時效性、原始記錄的真實性和結(jié)果的準確性。雖然沒有將原始記錄的完整性列入考核，仍應(yīng)提起各實驗室的注意。原始記錄的完整性，不僅是實驗的一部分，對結(jié)果核查、檔案管理和質(zhì)量控制都十分重要。

3.3 接收樣品無誤后應(yīng)盡快開始試驗

本次能力驗證活動中，10家實驗室均在5 d內(nèi)接收到了樣品，并且樣品狀態(tài)良好。其中，1 d接收到樣品的實驗室有4家，2 d接收到的有4家（含不滿意結(jié)果的1家），4 d和5 d接收到樣品的各1家。

而對于實驗的開始時間上，收到樣品次日開始實驗的實驗室1家，收到4 d開始實驗的1家，收到5 d開始實驗的3家（含不滿意結(jié)果1家），收到8 d開始實驗的4家，最晚的1家收到12 d開始實驗。

表1　能力驗證酯酶-3結(jié)果統(tǒng)計一覽表Tab.1 Analysis of the comparative test results of esterase-3 detection

表2　能力驗證酯酶-3項目各參加實驗室確認表及原始記錄情況表Tab.2 The quiz information from the laboratories entered into the esterase-3 detection project

經(jīng)過穩(wěn)定性實驗并綜合各實驗室的反饋結(jié)果來看，運輸和開始實驗室間也不是最終影響實驗室是否能得到滿意結(jié)果的關(guān)鍵影響因素，但還是建議各實驗室在接收確認后，盡早開始試驗，以期得到更容易判讀的結(jié)果并有利于樣品的復檢等工作。在本次結(jié)果回收統(tǒng)計中，有兩家單位的原始記錄中都能清晰的看到雜合型的條帶，無論出于何種原因沒有判定為雜合型，但還是顯示出檢測時間對于結(jié)果的重要性。凍干樣品模擬了實際檢測樣品，如果是活體動物新鮮采集樣品，就應(yīng)盡快實驗，防止酶蛋白的降解，進而獲得更貼近實際的檢測結(jié)果。

3.4 需要提高非常規(guī)樣品的檢測和復檢意識

本次能力驗證項目首次引入了雜合型樣品，雜合型的條帶一般出現(xiàn)于近交系小鼠發(fā)生遺傳變異和封閉群小鼠中［8］，而在遺傳質(zhì)量合格的近交系小鼠中不會檢出。由于雜合型樣品的穩(wěn)定性會收到溫度的影響，本次能力驗證項目雖然發(fā)放了雜合型樣品，但并沒有把該樣品作為滿意結(jié)果評價的硬性指標，僅作為滿意之上的優(yōu)秀的結(jié)果評價指標。從各實驗室原始記錄圖中可以看到，2家實驗室的圖譜中能夠清晰的看到雜合型條帶，但是并沒有進行復檢，也沒有判為雜合型結(jié)果，而判定為其中的重帶（c型）。另有1家進行了復檢并采用了2種緩沖液（2014-LA-006），但也沒有檢出雜合型。除了和上述穩(wěn)定性和實驗室間等因素有關(guān)，反映出參與實驗室對于非常規(guī)樣品還沒有足夠的準備，對于相關(guān)的檢品的檢測經(jīng)驗上還有待積累。

3.5 組織對實驗室的培訓宣貫

能力驗證是實驗室質(zhì)量保障體系的重要組成部分，實驗室則是能力驗證活動中的主體。通過組織和參與能力驗證活動，能更好的衡量實驗室的內(nèi)部質(zhì)控水平、人員能力、設(shè)備狀況、運行能力等因素。通過長期的參與、交流和學習，有助于發(fā)現(xiàn)問題，改進檢測技術(shù)方法，提升檢測及管理水平［9-10］。

從結(jié)果反饋來看，有部分實驗室準備并不充分，發(fā)樣結(jié)束訂購檢測試劑盒、樣品接收確認表不蓋章、原始記錄圖片不能及時提供的情況均有發(fā)生。這和有些參與實驗室對能力驗證項目認識不足有關(guān)，需要加強實驗體系的管理，減輕實驗檢測人員的負擔，充分利用參加能力驗證的機會檢驗所有相關(guān)環(huán)節(jié)的質(zhì)量活動，發(fā)現(xiàn)問題及時整改，從而使質(zhì)量體系得到完善。

參考文獻

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Proficiency evaluation of laboratories for the detection of esterase-3 in the kidneys of laboratory mice

WEI Jie，WANG Hong，GONG Wei，HE Zheng-ming，YUE Bing-fei*
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective To investigate the detection capacity of esterase-3（Es-3）in the laboratory animals monitoring laboratories in China，and to improve the quality management of laboratories.Methods We prepared the test samples according to the criteria of China National Accreditation Service for Conformity Assessment（CNAS），all the samples were certificated by homogeneity test and stability test.Then，samples with random numbers and standard operation instruction were distributed to the participant laboratories.The laboratories should submit their reports before the deadline expires. When the results are the same as the standard results，the laboratories will receive excellent remark；when the results are the same as the standard results except the hybridization type，the laboratories will receive satisfactory remark；otherwise，it will receive unsatisfactory remark.If a laboratory did not submit report，the laboratory will also receive unsatisfactory remark.Results Ten laboratories participated in the program，and no laboratory received excellent remark.Nine laboratories （90.0%of enrolled laboratories）had satisfactory results，while one laboratory（10.0%of enrolled laboratories）had unsatisfactory results.Conclusions The nationwide overall detection level of laboratories in Es-3 is relatively high.However，some details should be noticed and several laboratories should improve their detecting ability.

【Key words】Capacity evaluation；Quality control；Laboratory animal；Esterase-3

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）02-0204-04

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.018

［基金項目］國家科技支撐計劃（2015BAI07B02）：實驗用動物病原分子生物學快速檢測新技術(shù)研究與應(yīng)用。

［作者簡介］魏杰（1982-），女，碩士。研究方向：免疫遺傳檢測。E-mail：jane3040320@163.com。

［通訊作者］岳秉飛（1960-），男，研究員，博士。研究方向：實驗動物學。E-mail：y6784@126.com。

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com

［收稿日期］2016-01-13