黃福海,潘麗英,徐楚燕

(1.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院,廣東 深圳　518106；2.深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院，廣東 深圳　518104)

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半乳糖凝集素-9在卵巢癌組織中的表達及其臨床意義

黃福海1,潘麗英2,徐楚燕1

(1.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院,廣東 深圳518106；2.深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院，廣東 深圳518104)

摘要：目的觀察半乳糖凝集素-9(Galectin-9)在卵巢癌組織中的表達及其臨床意義。方法收集該院外科手術切除的卵巢癌組織、癌旁組織(距離癌灶<2cm)及卵巢良性組織(距離癌灶≥2cm)各60例，采用免疫組化法及RT-PCR法檢測卵巢組織中Galectin-9蛋白及mRNA表達。結果免疫組化證實卵巢癌組織中Galectin-9陽性表達率顯著低于癌旁組織及良性卵巢組織，癌旁組織中Galectin-9陽性表達率低于卵巢良性組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RT-PCR證實卵巢癌組織中Galectin-9mRNA表達顯著低于癌旁組織及良性卵巢組織，癌旁組織中的Galectin-9mRNA表達低于卵巢良性組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫組化亦證實有淋巴結轉移卵巢癌組織中的Galectin-9陽性表達率低于無淋巴結轉移卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。卵巢癌組織中Galectin-9陽性表達率與病理類型，病理分級，TNM分期無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論Galectin-9低表達可能與卵巢癌的發(fā)生及淋巴結轉移密切相關，可能成為卵巢癌預后的標志及基因治療的靶點。

關鍵詞：卵巢腫瘤;淋巴轉移;半乳糖凝集素-9

卵巢癌是女性生殖器官惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居婦科惡性腫瘤首位，具有發(fā)現(xiàn)晚，進展快及預后差等特點，嚴重的威脅女性健康及生命安全。并且由于卵巢居于盆腔底部，缺乏早期明顯特異，當發(fā)現(xiàn)時常處于晚期[1-2]。因此，探尋卵巢癌早期診斷，早期治療的特異性腫瘤標志物具有重要意義。半乳糖凝集素-9(Galectin-9)是學者們在1997年從鼠胚腎組織中分離得到的，是一種半乳糖苷結合蛋白，且含有一個包含130個氨基酸序列的糖識別區(qū)域。后續(xù)研究證實Galectin-9在自身免疫性疾病、炎癥、生殖及腫瘤等多種疾病中起重要作用[3-5]。已報道Galectin-9在食管鱗狀細胞癌，乳腺癌、結直腸癌、胃癌、口腔鱗癌、膠質瘤及肝癌中低表達，并與腫瘤的發(fā)生，進展、轉移及預后密切相關[6]。從而說明Galectin-9的異常表達可能也與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關，并且Galectin-9有可能成為一種卵巢癌診斷標志物。因此，本研究通過免疫組化及RT-PCR來檢測Galectin-9在卵巢癌、癌旁組織及良性卵巢組織中的表達，并探討Galectin-9與卵巢癌病理特征的關系，從而為卵巢癌的治療與預后提供實驗依據(jù)。

1資料與方法

1.1標本來源本研究選擇深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院及合作醫(yī)院外科2014年6月至2015年12月手術切除的卵巢癌組織、癌旁組織(距離癌灶<2cm)及卵巢良性組織(距離癌灶≥2cm)各60例納入研究。卵巢癌患者術前均未接受其他治療。所有病例都經過病理組織學檢查確診為卵巢癌。有完整詳細的臨床和病理診斷資料，按照病理分級分為漿液型38例，黏液型12例，子宮內膜樣型10例，按TNM標準分期分為，I+Ⅱ期35例，Ⅲ+Ⅳ期25例。有淋巴結轉移的24例，無淋巴結轉移36例。高分化12例，中分化25例，低分化23例。

1.2主要試劑及儀器鼠抗人Galectin-9多克隆抗體，羊抗鼠FITC-IgG，SP免疫組化檢測試劑盒均購自武漢博士德生物生物工程有限公司；ThermoShandonFinesse自動切片機，購自英國珊頓公司；Olympusbx40光學顯微鏡，購自日本Olympus公司。AEU-210型電子分析天平，購自日本島津公司。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉印電泳儀購自北京六一儀器廠；ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3實驗方法

1.3.1RT-PCR參考trizol試劑盒使用說明書提取總RNA，并檢測RNA純度。進而通過RT-PCR試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，并擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳。于凝膠成像系統(tǒng)拍照，Qantityone4.0 分析光密度值，實驗重復 3 次。引物如下，Galectin-9上游引物：5’-CATCCAATGCCATCCTCCTGTC-3’，TGAGCTTCACACAAGATCCACAC-3’，長度235bp；GADPH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’，長度138bp。

1.3.2免疫組織化學染色法(SP)卵巢組織于10%甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋、切片，用免疫組織化學SP法檢測Galectin-9的表達。操作過程為：采用高壓熱修復法修復抗原1.5min，室溫冷卻30min后PBS沖洗3次；再加入50μL3%過氧化氫溶液，室溫孵育10min后，PBS沖洗3次；采用非免疫性動物血清室溫下封閉10min，甩去多余血清，PBS沖洗3次；滴加1%濃度的一抗，陰性對照組用PBS液代替一抗，室溫下孵育60min，PBS沖洗3次；滴加二抗，室溫孵育10min后，PBS沖洗3次，應用DAB溶液顯色后沖洗、復染、脫水、透明、樹膠封片。

1.3.3結果判斷由兩位病理醫(yī)師根據(jù)細胞染色強度及陽性細胞百分比對切片進行半定量(HSCORE)評分，根據(jù)棕色的強弱評分為 0、1、2、3。計數(shù)5個高倍鏡視野下的陽性細胞百分比，總細胞數(shù)>1 000個。其中HSCORE=∑Pi(i)i=0、1、2、3,Pi= 0～100%，HSCORE>100 時，說明切片為陽性，HSCORE≤100 說明切片陰性。

2結果

2.1正常卵巢組織、良性卵巢組織與卵巢癌組織中Galectin-9的表達卵巢癌組織中Galectin-9陽性表達率顯著低于癌旁組織和良性卵巢組織，癌旁組織中的Galectin-9陽性表達率低于良性卵巢組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，卵巢癌組織中Galectin-9mRNA的表達顯著低于癌旁組織和良性卵巢組織，癌旁組織中的Galectin-9mRNA的表達低于良性卵巢組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達與組織病理類型，腫瘤分化程度，臨床分期的關系卵巢癌組織中Galectin-9陽性與病理類型，病理分級，TNM分期無關(P>0.05)，見表2～4。

2.3卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達與淋巴結轉移的關系免疫組化證實有淋巴結轉移卵巢癌組織中的Galectin-9陽性表達率低于沒有淋巴結轉移卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表5。

3討論

Galectin-9是半乳糖結合蛋白家族成員之一，能夠與細胞表面及間質中的半乳糖特異性結合，發(fā)揮細胞間以及細胞與間質間的信號傳遞作用。Galectin-9在人體多數(shù)組織中皆表達，包括腦、乳腺、胃、肝臟、肺臟、子宮、扁桃體等。同時Galectin-9參與了機體許多生理和病理過程，包括細胞間黏附、細胞生長調節(jié)、炎癥反應和免疫調節(jié)等。已報道Galectin-9在食管鱗狀細胞癌，乳腺癌、結直腸癌，胃癌，口腔鱗癌，膠質瘤及肝癌中低表達，并與腫瘤的發(fā)生、進展、轉移及預后密切相關[6]。郭素平等[7]證實食管鱗狀細胞癌中Galectin-9的陽性表達率顯著低于癌旁正常鱗狀組織，并與腫瘤的分化程度有關，且其陽性表達者生存期更長。Yang等[8]證實Galectin-9在胃正常組織，癌旁組織，胃癌組織中表達量逐漸降低，且胃癌組織中Galectin-9的低表達與臨床分期，腫瘤病理分子，腫瘤此分化，淋巴結轉移及生存率密切相關。Liang等[9]通過免疫組化亦證實Galectin-9在子宮頸的正常鱗狀上皮、低度上皮內瘤變、高度上皮內瘤變和浸潤期鱗癌組織中陽性表達水平逐漸降低。上述研究表明Galectin-9在多種腫瘤組織中異常表達，Galectin-9可能也是卵巢癌新的診斷標志物。因此本研究通過免疫組化及RT-PCR檢測卵巢癌組織中Galectin-9蛋白及mRNA的表達，結果發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中Galectin-9的陽性表達率及mRNA都顯著低于癌旁組織和良性卵巢組織，癌旁組織中的Galectin-9陽性表達率及mRNA表達低于良性卵巢組織，從而證實Galectin-9的表達與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，因此本研究進一步探討Galectin-9與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關系，結果表明，卵巢癌組織中Galectin-9的陽性表達與組織病理類型，腫瘤分化程度，臨床分期無關，與郭素平等[7]在食管鱗狀細胞癌中，Yang等[8]在胃癌組織中Galectin-9的陽性表達與組織病理類型，腫瘤分化程度，臨床分期密切相關的觀點不一致，原因可能是腫瘤病例標本的大小，組織的特異性所導致的。

表1　正常卵巢組織、良性卵巢組織與卵巢癌組織中Galectin-9的表達

注：與卵巢良性組織組比較，aP<0.01，與癌旁組織組比較，bP<0.01。

表2　卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達

注：三類型中Galectin-9陽性率比較，P>0.05。

表3　卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達

注：三類型中Galectin-9陽性率比較，P>0.05。

表4　卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達

注：二類型中Galectin-9陽性率比較，P>0.05。

表5　卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達

注：二類型中Galectin-9陽性率比較，P<0.05。

轉移是導致外科手術、化療、放療等失敗的主要原因，更是患者病情惡化的重要原因[10-11]。因此探討Galectin-9的表達與卵巢癌淋巴結轉移具有重要意義。免疫組化結果證實免疫組化亦證實有淋巴結轉移卵巢癌組織中的Galectin-9陽性表達低于未淋巴結轉移卵巢癌組織，提示Galectin-9的表達與卵巢癌的淋巴結轉移密切相關。并且以往研究也證實Galectin-9的表達與腫瘤轉移密切相關。如Kageshita等[12]證實Galectin-9在黑色素痣組織中高表達，在黑素瘤組織中低表達，尤其是在轉移性的黑素瘤中低表達更明顯。Chan等[13]證實Galectin-9在口腔鱗癌中低表達，并在有淋巴結轉移中的陽性表達低于無淋巴結轉移。Zhang等[14]證實肝細胞癌中Galectin-9的表達與淋巴結轉移，血管侵襲及肝內轉移密切相關，且陽性表達Galectin-9的肝細胞癌患者有更長的生存時間。從而說明Galectin-9與卵巢癌的淋巴結轉移密切相關，以此為靶點，提高Galectin-9在卵巢癌組織中的表達，可能能顯著的抑制卵巢癌淋巴結轉移。

綜上所述，Galectin-9低表達可能與卵巢癌的發(fā)生及淋巴結轉移密切相關，而與組織病理類型，腫瘤分化程度，臨床分期無關，可能成為卵巢癌預后的標志及基因治療的靶點。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.040

(收稿日期：2015-10-21，修回日期：2016-04-29)