王　慧，李玉潔,陳　帆，南　燕

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院婦產科，河南新鄉(xiāng) 453003)

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坤泰膠囊對小鼠子宮內膜容受性影響的研究*

王慧，李玉潔△,陳帆，南燕

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院婦產科，河南新鄉(xiāng) 453003)

[摘要]目的通過比較溶血磷脂酸受體-3(LPAR3)在小鼠胚胎著床期子宮內膜的表達，了解坤泰膠囊對小鼠子宮內膜容受性的影響。方法將90只6～8周齡的昆明雌鼠分為3組[A組：控制性超促排卵(COH)；B組：坤泰+COH；C組：生理鹽水對照)，每組30只]，檢查合籠次日晨陰栓，于第1～6天每天每組處死5只雌鼠，測定血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，以及腺體數和LPAR3免疫組化光密度值(IOD)。 結果A、B組血清E2、P水平值均高于同期C組(P<0.05)；HE染色，A組較B、C組腺體數明顯減少(P<0.05)。A組第3天LPAR3的IOD值高于B、C組(P<0.05)，而A組第4天IOD值明顯小于B、C組(P<0.05)，B組較C組略高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論坤泰膠囊可能通過改善COH小鼠LPAR3正常時空表達，起到改善子宮內膜容受性的作用。

[關鍵詞]坤泰膠囊；子宮內膜容受性；控制性超促排卵；溶血磷脂酸受體-3

隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，輔助生殖技術在卵子的獲取、受精卵的培養(yǎng)、胚胎移植等方面取得很大的進步，為廣大的不孕癥患者帶來希望；但是胚胎的著床率較前并未出現明顯改善[1]，嚴重影響了妊娠結局，為此子宮內膜容受性即子宮內膜對胚胎的接受能力就成為當今生殖醫(yī)學界研究的熱點問題[2]。本實驗建立了控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)小鼠模型，觀察坤泰膠囊對小鼠子宮內膜容受性的影響，并了解溶血磷脂酸受體-3(lysophosphatidic acid receptors 3，LPAR3)在小鼠子宮內膜上的表達特點，對坤泰膠囊作用機制及胚胎著床影響的機制進行探討。

1材料與方法

1.1材料清潔級昆明雌鼠90只，6～8周齡，24～34 g；雄鼠45只，8～10周齡，28～37 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供。雌雄分籠飼養(yǎng)，自由取食水，室溫22～25 ℃。

1.2方法將90只雌鼠分為A、B、C 3組(n=30)，B組給予坤泰膠囊(貴陽新天藥業(yè)股份有限公司提供)，A、C組給予相同劑量生理鹽水，均灌胃1個月，每只每天劑量為0.7 mL。將坤泰膠囊溶于生理鹽水濃度為50 mg/mL，灌胃劑量根據許文生氏公式和Meeh-Rubner氏公式，按中國婦女的平均身高158.6 cm，體質量53.6 kg，本次實驗雌鼠的平均體質量27.5 g計算，小鼠的每日灌藥量約為1.2 mg/g。3組小鼠灌胃20 d后，于小鼠發(fā)情后期，A、B兩組均于上午9：00腹腔注射促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRHa)1.5 μg/100 g，連續(xù)9 d，第9天加注孕馬血清促性腺激素(PMSG)10 IU/只，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10 IU/只,C組同時注射同等劑量的生理鹽水。HCG注射日當晚A、B、C 3組雌∶雄比2∶1合籠，次日晨7：00～8：00時檢查陰栓，并記為第1天，依次為第2、3、4、5、6天，每天每組平均頸椎脫臼處死5只雌鼠，心臟取血行雌二醇(E2)、孕酮(P)測定，解剖取其子宮組織，放置4%的多聚甲醛中固定待行HE染色和免疫組化檢測LPAR3表達的光密度值(IOD)。

2結果

2.13組小鼠第1～6天E2、P水平比較A、B組E2、P水平均高于同期C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組E2、P水平高于A組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、表2。

2.23組小鼠第4天子宮內膜HE染色比較A、B、C組腺體數分別為(12.6±3.36)、(19.8±1.92)、(17.0±2.45)個，B組腺體數高于A、C組，與A組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。鏡下觀A組腺體發(fā)育差，腺腔小，間質致密，血管較少；B組腺體發(fā)育好，腺腔大，間質疏松，血管多；C、B組鏡下比較無明顯差別。圖1～3。

2.33組小鼠LPAR3表達的IOD比較LPAR3在3組小鼠的第1～6天出現規(guī)律性表達，A組峰值出現在第3天，B、C組峰值均出現在第4天，且A組第3天的IOD值高于B、C組(P<0.05)；B、C組第4天的IOD值高于A組(P<0.05)；B組第4、5天的IOD值略高于C組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。三組峰值可見免疫組化圖4～6。

表1　　3組小鼠第1～6天E2水平比較

a：P<0.05，與同期C組比較。

表2　　3組小鼠第1～6天P水平比較

a：P<0.05，與同期C組比較。

表3　　3組小鼠LPAR3的IOD比較

a：P<0.05，與同期A組比較。

圖1 A組第4天HE染色(×400)圖2 B組第4天HE染色(×400)圖3 C組第4天HE染色(×400)

圖4 A組第3天LPAR3的表達(×400)圖5 B組第4天LPAR3的表達(×400)圖6 C組第4天LPAR3的表達(×400)

3討論

通過提高子宮內膜容受性，從而提高輔助生殖技術的臨床妊娠率是現在生殖醫(yī)學界研究的熱點問題，國內外學者通過大量研究以期解決超促排卵后導致的種植窗期子宮內膜容受性低下的問題，同時也是目前解決胚胎種植率低的切入點。

溶血磷脂酸(LPA)存在于機體的血清、眼房水、精漿等多種體液中，其受體有4種，分別是LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4，其中LPAR3與雌性生殖系統(tǒng)關系密切。有研究發(fā)現，LPAR3基因缺陷的雌性小鼠中LPAR3空間分布異常，并推測其表達異常可導致胚胎種植的延遲[3]。本實驗免疫組化提示，LPAR3表達于子宮內膜上皮及腺上皮細胞質，且在子宮內膜上的表達具有規(guī)律性，3組均出現峰值，A組峰值出現在第3天，B、C組出現第4天；B組峰值高于A組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這種規(guī)律性表達可能與生殖關系密切相關。

坤泰膠囊為純中藥制劑，由熟地黃、黃連、白芍、黃芩、茯苓、阿膠等六味中藥組成，無雌激素，卻有類雌激素作用。有研究證實，坤泰膠囊有雌激素樣作用，并且能改善子宮內膜發(fā)育，有利于胚胎著床[4]；有研究證實，雌、孕激素在胚胎與子宮內膜對話建立關聯之間起到重要的把控作用[5]。通過本實驗發(fā)現坤泰膠囊確實具有升高雌、孕激素的作用，但作用弱。陳蓉等[6]研究的坤泰膠囊可以升高E2，且不會造成子宮內膜過度增生。本實驗顯示，坤泰膠囊同時具有改善COH引起的子宮內膜腺體少且發(fā)育不良、間質致密等作用。付連方[7]研究COH藥物具有影響小鼠子宮內膜容受性，導致臨床妊娠率低；龔瑜等[8]試圖從子宮內膜厚度、血流指數等方面研究超促排卵對子宮內膜容受性的影響，發(fā)現超促排卵對內膜厚度與血流指數影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由本實驗可見COH可能是在異常升高雌、孕激素水平，影響內膜腺體發(fā)育等方面降低子宮內膜容受性的；而坤泰膠囊在一定程度上可通過改善子宮內膜腺體少、發(fā)育不良、疏松間質從而改善COH引起的子宮內膜容受性降低；這一結論與鄭瑞君等[9]研究的坤泰膠囊具有改善子宮內膜容受性的結論相同。南燕等[10]研究發(fā)現，坤泰膠囊能改善子宮內膜容受性，有助于胚胎的著床；此外宋暉等[11]研究發(fā)現，坤泰膠囊具有促排卵作用，但是不會造成子宮內膜過度增生，因此和促排卵藥物聯合應用可降低促排卵藥物對子宮內膜的不良影響，從而達到改善子宮內膜容受性的作用。另外臨床研究也證實，坤泰膠囊具有改善卵巢功能、調節(jié)雌激素水平、促進子宮內膜增生，利于胚胎著床[12-13]；還有研究顯示，坤泰膠囊對更年期大鼠子宮具有營養(yǎng)作用[14]。

小鼠子宮內膜的種植窗為第4～5天晨，約18 h[15]。胞飲突為目前公認的子宮內膜容受性評價指標之一。郭燕紅等[16]研究小鼠在合籠第4天，出現完全發(fā)育的胞飲突,本實驗的B組與C組的LPAR3峰值均出現在第4天；與胞飲突的發(fā)育一致，可見LPAR3與胚胎著床確實關系密切。坤泰膠囊在改善子宮內膜腺體數少、發(fā)育不良的同時，也改善了LPAR3總體表達量，為此可見B組第4天較其他兩組腺體多、LPAR3的IOD值較其他兩組高，免疫組化與HE染色結果一致。為此，可推斷，LPAR3與胚胎著床關系密切，其可能通過黏附作用參與胚胎著床過程。郭燕紅等[16]研究表明，LPAR3在子宮內膜著床期表達，對評價子宮內膜容受性有重要意義，可作為子宮內膜容受性的良好評價指標之一。A組LPAR3峰值提前出現且較B組低，第4天腺體發(fā)育不良、間質致密、血管較少，可見COH可能導致胚胎種植窗提前，造成胚胎與子宮內膜發(fā)育不同步，而坤泰膠囊改善了COH小鼠內膜的LPAR3時空表達，并增加了LPAR3的表達量，從而起到改善小鼠子宮內膜腺體發(fā)育，提高子宮內膜容受性的作用。

坤泰膠囊能促進子宮內膜發(fā)育，并能抵制促排卵藥物引起的子宮內膜容受性降低，而此作用可能是通過改善LPAR3的正常時空表達及量的表達實現；但LPAR3如何承上啟下發(fā)揮調節(jié)作用尚不清楚,有待進一步研究。

參考文獻

[1]魏麗坤，張雷，王藹明．子宮內膜容受性的評價及其改善措施[J]．生殖與避孕，2008，28(5)：298-303．

[2]Jones RL,Salamonsen LA,Findlay JK.Potential roles for endometrial inhibins,activins and follistatin during human embryo implantation and early pregnancy[J].Trends Endocrinol Metab,2002,13(4):144-150.

[3]Ye X,Hama K,Contos JJ,et al.LPA3-mediated lysophosphatidic acid signalling in embryo implantation and spacing[J].Nature,2005,435(738):104-108.

[4]李存存，王晶晶，陳潮，等．坤泰膠囊與激素替代療法治療更年期綜合征有效性和安全性比較的Meta分析[J]．中國中西醫(yī)結合雜志，2013，33(9)：1183-1190．

[5]張煒，周劍萍，劉銀坤，吳欣等.白血病抑制因子在小鼠圍著床期子宮內膜的表達[J].生殖醫(yī)學，2000,9(2):100-103.

[6]陳蓉，林守清，楊欣，等．坤泰膠囊治療婦女更年期綜合征的臨床研究[J]．中國新藥雜志，2005，14(12)：1472-1476．

[7]付連芳．控制性超排卵(COH)藥物GnRHα對小鼠子宮內膜整合素αv、β1表達的影響[J]．醫(yī)學檢驗與臨床，2006，17(6)：33-34,40．

[8]龔瑜，岳天孚，白曉紅，等．超促排卵與胚胎著床前期子宮內膜容受性的關系[J]．國際婦產科學雜志，2010，37(3)：212-214,218,227．

[9]鄭瑞君，張宸銘．坤泰膠囊對原因不明性不孕癥子宮內膜容受性的影響[J]．中成藥，2014，36(11)：2261-2264．

[10]南燕，段予新，李玉潔等.坤泰膠囊對不孕癥患者子宮內膜容受性的影響[J]，新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2012，29(5):384-385.

[11]宋暉，韓星，田國華，等．坤泰膠囊對多囊卵巢綜合征促排卵臨床療效觀察[J]．中國婦幼保健，2012，27(32)：5194-5196．

[12] Trudel G.Sexuality and marital life：results of a survey[J].J Sex Marital Ther，2002,28(3)：229-249．

[13]Rossouw JE,Anderson GL,Prentice RL,et al.Risk and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal woman[J].JAMA,2002,288(3)：321-333．

[14]張紹芬，朱慧庭，劉旸，等.坤泰膠囊對更年期大鼠卵巢功能及子宮內膜影響的實驗研究[J].中華老年雜志，2004,23(9)：648-651.

[15]Wang H,Dey SK.Roadmap to embryo implantation:clues from mouse models[J].Nat Rev Genet,2006,7(3):185-199.

[16]郭燕紅，張雷，邵素霞，等．溶血磷脂酸受體3在小鼠胚胎圍著床期子宮內膜的表達及意義[J]．解剖學報，2009，40(1)：141-145．

Study on effect of Kuntai Capsule on mice endometrial receptivity*

WangHui,LiYujie△,ChenFan,NanYan

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang,Henan453003,China)

[Abstract]ObjectiveTo understand the effect of Kuntai Capsule on mice endometrial receptivity by comparing the lysophospholipids acid receptor-3(LPAR3) expression in endometrium during mouse embryos implantation period.MethodsNinety 6-8 week old Kunming female mice were randomly divided to three groups:the group A[controlled ovarian hyperstimulation(COH)],B (COH+Kuntai Capsule) and C(normal saline control),30 cases in each group.The vaginal plug was performed on the next day after mating.Five mice in each group were daily killed on 1-6 d.The serum estradiol(E2) and progesterone(P) levels were detected.The glands number and the immunohistochemical integrated optical density(IOD) were also determined.ResultsThe levels of serum E2 amd P in the group A and B were higher than those in the group C at the same period(P<0.05);in the HE staining,the glands number in the group A was significantly decreased compared with the group B and C(P<0.05).The IOD value of LPAR3 on 3 d in the group A was significantly lower than that in the group B and C(P<0.05),while the group B was slightly higher than the group C without statistical difference(P>0.05).ConclusionKuntai Capsule may play the role for improving the endometrial receptivity by improving the normal space-time expression of LPAR3.

[Key words]Kuntai Capsule;endometrial receptivity;controlled ovarian hyperstimulation;lysophosphatidic acid receptors 3

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.005

基金項目：2012年河南省高等學校骨干教師資助項目(2012GGJS-135)。

作者簡介：王慧(1987-)，住院醫(yī)師，碩士研究生，主要從事子宮內膜容受性研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：645482554@qq.com。

[中圖分類號]R715.9

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)18-2464-03

(收稿日期：2015-11-16修回日期：2016-03-08)