常海軍，王小燕

(1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲(chǔ)運(yùn)工程技術(shù)研究中心，重慶　400067;2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶　400715)

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南瓜多糖的提取及其抗氧化性研究

常海軍1，王小燕2

(1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲(chǔ)運(yùn)工程技術(shù)研究中心，重慶400067;2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715)

摘要：【目的】 對(duì)酶法提取南瓜多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定.【方法】 以南瓜為原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了南瓜多糖果膠酶提取工藝條件，并采用水楊酸法測(cè)定了南瓜多糖對(duì)羥基自由基(·OH)的清除效果.【結(jié)果】 南瓜多糖的最佳提取工藝條件為：提取溫度30 ℃，果膠酶質(zhì)量濃度2.0%，料液比1∶40，提取時(shí)間2.5 h；該工藝條件下多糖的得率為27.19%.南瓜多糖質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí)對(duì)羥基自由基(·OH)的清除率最高，清除率為23.30%.【結(jié)論】 研究結(jié)果為南瓜的精深加工提供了理論依據(jù)，并為深入研究南瓜多糖的功效奠定了基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：南瓜多糖；果膠酶；提??；抗氧化性

南瓜(Cucurbitamoschataduch)為葫蘆科南瓜屬一年生蔓性草本植物，營養(yǎng)成分豐富，含有多種功能性營養(yǎng)成分，具有很高的食療保健作用，被譽(yù)為“天然營養(yǎng)保健食物”[1].南瓜多糖(pumpkin polysaccharide，PP)呈棕色粉末，是南瓜活性成分中最重要、最具潛力的功能成分之一.南瓜多糖具有降血脂、降血糖、防癌等功能[2-3].目前，對(duì)南瓜多糖所報(bào)道的提取方法主要有熱水浸提法[4-5]、堿法提取法[6]、超聲提取法[7-8]和復(fù)合酶提取法[9-10]等，其提取工藝各有特點(diǎn).熱水浸提法是一種常用提取方法，其操作簡單，但耗時(shí)長，得率低.超聲輔助法是在不改變提取物生物活性的前提下，先利用超聲波破壞植物細(xì)胞壁，來縮短提取時(shí)間，但因設(shè)備限制難以規(guī)?；a(chǎn).酶提取法是一種較為有效的提取方法，它可分解細(xì)胞壁使多糖更易析出，且可以降解蛋白質(zhì)，具有條件溫和、雜質(zhì)易除和得率高等優(yōu)點(diǎn).常用的酶有纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶等[11].于翠芳等[12]采用纖維素酶對(duì)南瓜多糖的酶法提取條件進(jìn)行了優(yōu)化.孫婕等[13]對(duì)南瓜多糖的復(fù)合酶法提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化.但多酶法提取工藝較為復(fù)雜，另外多酶間的相互作用以及作用強(qiáng)度等因素難以確定，基于此，本研究選用果膠酶對(duì)南瓜多糖的提取工藝進(jìn)行研究，并初步研究了南瓜多糖的抗氧化特性，以期為南瓜多糖在食品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1材料與方法

1.1材料和試劑

成熟南瓜，購于重慶南岸四公里永輝超市.

果膠酶(pectinase，活力≥500 000 U/g，BR)，其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2儀器和設(shè)備

AL104電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；DFY-400搖擺式高速萬能粉碎機(jī)(上海振春粉體設(shè)備有限公司)；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇正基儀器有限公司)；UV-3系列紫外分光光度儀(上海美譜達(dá)儀器有限公司)等.

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1工藝流程南瓜粉制備[3]：南瓜→去皮→去瓤→切片→烘干(70 ℃、24 h)→粉碎→100目過篩→南瓜粉.

南瓜多糖提取[13]：1 g南瓜粉→果膠酶→水溶解→酶解(酶量、溫度、時(shí)間)→90 ℃滅酶活→離心取上清液→加入4倍體積的無水乙醇→離心沉淀→干燥沉淀得粗多糖.

1.3.2南瓜多糖總糖測(cè)定采用蒽酮比色法[7-8].

1.3.3南瓜多糖提取的單因素試驗(yàn)?zāi)瞎隙嗵翘崛〉膯我蛩卦囼?yàn)參考Sun方法[14]，在固定條件果膠酶用量1.5%，料液比為1∶30，提取時(shí)間2 h，提取溫度40 ℃的情況下，設(shè)置溫度(30，40，50，60，70 ℃)，料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50)，酶用量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)，提取時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3 h)的單因素試驗(yàn)，研究各因素對(duì)南瓜多糖得率的影響.

1.3.4南瓜多糖提取的正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮多個(gè)因素相互效應(yīng)，以南瓜多糖的提取率和純度作為測(cè)定指標(biāo)，選取提取溫度、果膠酶濃度、料液比和提取時(shí)間為因素，做L9(34)正交試驗(yàn)[15]，提取步驟同單因素試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化南瓜多糖的提取條件.

按照正交表進(jìn)行提取試驗(yàn)，對(duì)各組試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析，以確定最佳提取工藝條件.

1.3.5羥基自由基(·OH)清除能力測(cè)定取5支具塞試管，編號(hào)，每支試管各加入9 mmol/L的FeSO4和濃度為9 mmol/L的水楊酸-乙醇混合液各2 mL，按試管編號(hào)加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL南瓜多糖溶液2 mL.最后加入濃度為8.8 mmol/L的H2O22 mL啟動(dòng)反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)1 h，并以蒸餾水代替南瓜多糖溶液作空白調(diào)零，在510 nm處測(cè)定樣品的吸光度，記錄數(shù)據(jù)[13,16].清除率按下式計(jì)算：

清除率(%)=(A0-AS)/A0×100%

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度，As為加入提取液后的吸光度.

1.4數(shù)據(jù)分析

2結(jié)果與分析

2.1南瓜多糖蒽酮比色法測(cè)定結(jié)果

通過蒽酮比色法所制作的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式為y=0.008 2x-0.008 2，精度較高(R2=0.997 4)，測(cè)得南瓜中總糖的含量約為27.3%.

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of glucose

2.2南瓜多糖提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1溫度對(duì)南瓜多糖得率的影響如圖2所示，在40 ℃之前隨溫度上升，南瓜多糖提取率上升，而在40 ℃之后隨著溫度升高，南瓜多糖提取率呈下降趨勢(shì).可能是由于未達(dá)到果膠酶的最適溫度之前，升高溫度有利于細(xì)胞壁的破裂或溶解，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出，南瓜多糖提取率隨溫度升高而提高.而過高的溫度又會(huì)使果膠酶失活，酶促反應(yīng)過程受到抑制，使南瓜多糖的提取率下降.因而選擇最佳提取溫度為40 ℃.

2.2.2果膠酶濃度對(duì)南瓜多糖得率的影響如圖3所示，果膠酶體積分?jǐn)?shù)在低于1.5%時(shí)，南瓜多糖提取率隨酶體積分?jǐn)?shù)的增高而顯著增高；當(dāng)酶體積分?jǐn)?shù)高于1.5%時(shí)，隨酶體積分?jǐn)?shù)增加，南瓜多糖提取率明顯下降.其原因可能是酶體積分?jǐn)?shù)過高導(dǎo)致南瓜多糖發(fā)生部分降解的緣故.綜合分析，確定提取南瓜多糖的最佳果膠酶濃度為1.5%.

圖3　果膠酶濃度對(duì)南瓜多糖提取率的影響Fig.3　Effects of pectinase concentration on theyield of crude polysaccharide

2.2.3料液比對(duì)南瓜多糖得率的影響如圖4所示，料液比達(dá)到1∶30之前，南瓜多糖的提取率隨著溶劑量的增加顯著增大，料液比超過1∶30后，提取率隨著溶劑量的增加不再顯著增加.考慮到生產(chǎn)成本、經(jīng)濟(jì)效益等方面的因素，選擇提取南瓜多糖的最佳料液比為1∶30.

圖4　料液比對(duì)粗多糖得率的影響Fig.4　Effects of liquid to solid water ratio on the yieldof crude polysaccharide

2.2.4時(shí)間對(duì)南瓜多糖得率的影響如圖5所示，提取時(shí)間在2 h之前時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長南瓜粗多糖的得率逐漸提高，而當(dāng)提取時(shí)間超過2 h以后，粗多糖得率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于提取時(shí)間過長導(dǎo)致粗多糖分解或者損失；另外，時(shí)間過長，也會(huì)影響到粗多糖的品質(zhì).綜合來看，南瓜多糖提取的最佳提取時(shí)間為2 h.

圖5　時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響Fig.5　Effects of extraction time on the yieldof crude polysaccharide

2.3南瓜多糖提取工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

由表1，表2可以看出，以提取率為測(cè)定指標(biāo)時(shí)，果膠酶法提取南瓜多糖各因素的主次順序?yàn)楣z酶濃度>提取溫度>提取時(shí)間>料液比；南瓜多糖提取的最佳工藝組合為A1B3C3D3，即為正交組合中3號(hào)試驗(yàn)組，即果膠酶法提取南瓜多糖的最優(yōu)提取條件為提取溫度30 ℃，果膠酶濃度2.0%，料液比1∶40，提取時(shí)間2.5 h.該工藝條件下南瓜多糖的得率為27.19%.

表1　南瓜多糖提取L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表

表2　南瓜多糖提取正交試驗(yàn)方差分析表

從表中F值和F臨界值的比較可以看出，各因素均無顯著影響，相對(duì)來說B果膠酶濃度和A提取溫度對(duì)南瓜粗多糖的得率影響大些，提取時(shí)間和料液比的影響較小.通過對(duì)各因素做方差分析，其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響順序與極差分析結(jié)果一致，即果膠酶體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時(shí)間>料液比，但各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響均不顯著(P>0.05)，主要原因是誤差偏差平方和(SS)與均方差(MS)都較小，從而使因素的效應(yīng)達(dá)不到顯著水平，可能與不同因素間存在的一些互作效應(yīng)有關(guān).

2.4南瓜多糖清除羥基自由基(·OH)的能力

由圖7可以看出，在0.3 mg/mL以前，隨著粗多糖質(zhì)量濃度的升高羥基自由基(·OH)的清除率逐漸增大，而在粗多糖質(zhì)量濃度大于0.3 mg/mL后，清除率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在0.3 mg/mL至0.4 mg/mL之間下降明顯，而從0.4 mg/mL開始下降趨緩.南瓜多糖質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí)，最大清除率為23.30%.

圖6　各因素與南瓜粗多糖得率的關(guān)系Fig.6　Relationship between the factors and the yeild of crude polysaccharide

圖7　南瓜多糖濃度對(duì)羥基自由基(·OH)的清除率Fig.7　Pumpkin polysaccharide concentration onthe hydroxyl radical (·OH) clearance rate

自由基的清除是利用氧自由基的氧化或還原性，使反應(yīng)體系中的某種反應(yīng)物發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，生成物在紫外或(和)可見光范圍內(nèi)某一特定波長下具有最大吸收峰，通過測(cè)定反應(yīng)體系在這一波長下的吸光度的變化，間接測(cè)定氧自由基的含量.多糖結(jié)構(gòu)中的醇羥基可以與產(chǎn)生(·OH)等自由基所必需的金屬離子(如Fe2+、Cu2+等)絡(luò)合,使羥基自由基的產(chǎn)生受到抑制[11].孫婕等[13]在用不同方法提取的南瓜多糖進(jìn)行清除羥自由基試驗(yàn)時(shí)得出，相同質(zhì)量濃度下，復(fù)合酶法提取所得的南瓜多糖清除羥基自由基(·OH)的能力最強(qiáng)，在南瓜多糖濃度0.3 mg/mL時(shí)清除率為40%左右，在1.8 mg/mL時(shí)可達(dá)83.2%.南瓜多糖及其衍生物具有很好的抗氧化性能，對(duì)不同的自由基的清除能力不同.同樣，不同成分的南瓜多糖對(duì)同一種自由基的清除能力也不相同.因此，清除某種自由基要找到對(duì)其具有最大清除能力的南瓜多糖成分[1].

3結(jié)論

1)本研究得出南瓜多糖提取最佳工藝條件為：提取溫度30 ℃，果膠酶濃度2.0%，料液比1∶40，提取時(shí)間2.5 h.該工藝條件下南瓜多糖的得率為27.19%.

2)南瓜多糖對(duì)羥基自由基具有一定的清除能力，在南瓜多糖質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí)，最大清除率為23.30%.

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Extraction and antioxidant activity on pumpkin polysaccharide

CHANG Hai-jun1,WANG Xiao-yan2

(1.College of Environment and Resources,Chongqing Technology and Business University,Chongqing Engineering Research Center for Processing,Storage and Transportation of Characterized Agro-Products,Chongqing 400067,China;2.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

Abstract：【Objective】 The aim of this study is to optimize the enzymatic extraction condition of pumpkin polysaccharide,and to detect the antioxidant properties of pumpkin polysaccharide.【Method】 The pectinase extraction of polysaccharide from pumpkin was investigated,and the extraction parameters were studied by single factor and orthogonal experiments.The scavenging effects of the polysaccharide on hydroxyl radical (·OH) were evaluated with salicylic acid assay.【Result】 The optimum extraction conditions were as follows: extraction temperature at 30 ℃,pectinase concentration 2.0%,solid-liquid ratio 1∶40 and extraction time for 2.5 h.The polysaccharide extraction rate reached to 27.19%.The highest clearance rate for hydroxyl radicals(·OH) reached to 23.30% when the polysaccharide at 0.3 mg/mL.【Conclusion】 This research provides a theoretical basis for the deep processing of the pumpkin,and laid the foundation for further study on pumpkin polysaccharide efficacy.

Key words：pumpkin polysaccharide;pectinase;extraction;antioxidant

基金項(xiàng)目：重慶市科委基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2013jcyjA80017)；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ1500633).

收稿日期：2015-05-28；修回日期：2015-07-09

中圖分類號(hào)：S 642.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2016)03-0135-05

第一作者：常海軍(1980-)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)畜產(chǎn)品加工理論與技術(shù).E-mail：changhj909@163.com